Summary
定義されている物の巨大リポソームに機能的な膜タンパク質を再構成すると、パッチクランプ電気生理学と組み合わせた強力なアプローチである。しかし、従来の巨大リポソーム生産は、タンパク質の安定性と互換性がないかもしれません。私たちは純粋な脂質やイオンチャネルを含む小さなリポソームから巨大リポソームを製造するためのプロトコルを記述します。
Abstract
電気生理学的記録のために、化学的に定義された脂質膜へのイオンチャネルの再構成は、これらの重要なタンパク質の機能を識別し、探索するための強力な手法となっています。しかしながら、このような平面的な二重層のような古典的な製剤は、再構成されたチャネルと、その膜環境で行うことができる操作や実験を制限する。巨大リポソームの全表示セル状構造は、脂質環境の制御を犠牲にすることなく、従来のパッチクランプ実験を可能にする。
電鋳は効率的で巨大なリポソーム>薄い、順序付けられた脂質フィルムが電極表面に堆積する交流電圧の印加に依存して、直径が10μmを生成することを意味する。脂質は有機溶媒から析出させるために、古典的なプロトコルを呼び出ししかし、それはイオンチャネルと変更する必要がありますようにそれほど強固な膜タンパク質との互換性はありません。最近では、PRotocolsは私達が私達の研究室でタンパク質含有リポソームに適応している部分脱水小さなリポソームから巨大リポソームを電鋳するために開発されている。
我々はここで、背景、装置、技術、および小型のリポソーム分散液から巨大リポソームの電鋳の落とし穴を紹介。我々は従うより挑戦的なプロトコルを試みる前に、最初に習得すべきである古典的なプロトコルで始まる。私たちは、飽和塩溶液と蒸気の平衡を用いた小型リポソームの制御された部分的な脱水のプロセスを示しています。最後に、電鋳自体のプロセスを示す。我々は、高品質のリポソームを生成し、最良の結果を得るために各段階で調製物の目視検査を記述するために自社で製造することができる単純で安価な機器について説明する。
Introduction
ジャイアントリポソームは（しばしば巨大な単層小胞、またはGUVsと呼ばれる）は、主に二重層変形、横相共存（ "ラフト"）、膜融合など 1-4の研究を含む脂質二重層の物理学と物理化学を勉強するために使用されている。簡単に周囲の水性緩衝液よりも異ならせることができる水性内部を取り囲む膜の球殻：それらは著しくセル状構造を有している。それらは、定義により、直径が1〜100μmで≈ので、それらは光学顕微鏡様々な手法を用いて撮像することができるされている。それらは、一般的にソフトながら、それらの特性は、取り扱いが簡単に操作できるように、ピンと張っ用いて浸透圧の勾配または機械的に適用された張力を行うことができる。具体的には、リポソームの "剛性"電気生理学のための "リポソームに接続された"又は切除したパッチを形成することが簡単で制御することになる。過去には、イオンチャネルの再構成は、主に平面脂質（b）で実施したilayers。さて、巨大リポソームからパッチを形成し、従来の電気生理学のために開発されたツールのかなりの震え（蛍光顕微鏡、マイクロピペット吸引、急速潅流と温度制御など ） を使用する能力は、再構成の研究5,6のために巨大なリポソームがますます魅力的になります。
巨大リポソームは、多くの戦略によってなされている。乾燥した脂質膜は4,7,8を再水和されたとき、実際には、巨大なリポソームは腫れプロセスによって自発的に形成する。より急速に大きくなる準備をする欲求は、より均一なリポソームは、電鋳1,9そのうちチーフ他のアプローチへの研究を主導した。電鋳はまた、乾燥脂質膜の水和に依存するが、脂質膜を横切る振動電場を印加して処理を高速化する。フィールドまたは水によって分離され、二つの電極、白金線のいずれか、またはインジウムスズ酸化物（ITO）でコーティングされたガラススライドを介して印加されるバッファとその上に脂質が堆積される。リポソームの膨潤をスピードアップすることで、人はより大きなリポソームの高収率を達成しています。したがって、電鋳、巨大リポソーム4を生成するデフォルトの方法となっています。
電鋳のメカニズムは完全には理解されるものではなく、プロトコルのほとんど（ 例えば 、10,11）経験的に開発されている。それにもかかわらず、我々は理論といくつかの実証結果を考慮することによって期待することについて少し学ぶことができます。これは、広く電鋳が堆積脂質膜10,11に積層され、個々の脂質二重層との間のバッファの電気浸透流を駆動することによって起こると考えられている。脂質二重層の熱揺らぎに静電結合はまた、おそらく12複雑です。これらの仮説は、定性的10,12を使用することができる電界の周波数および強度の上限を予測する。特に、その高い導電性溶液を予測している（
しかしながら、膜タンパク質は、その後、薄い脂質フィルムを残すように蒸発させる有機溶媒中、すなわち、electroswelling手順については電極上に脂質を堆積する通常の方法と互換性があると思われる。この難しさの周りに二つの主要な経路があります：巨大リポソーム形成後にタンパク質を組み込むために、または脂質が堆積されているどのように適応する。我々のアプローチは、脂質とreconstiを堆積させるために他の人5,11上に構築小規模または大規模な "プロテオ"の懸濁液から一緒に膜タンパク質をtuted。我々は、（コリンズとゴードン、 レビューで）他の場所で、タンパク質と脂質を精製からプロテオリポソームを生成する長い、より挑戦的なプロセスについて説明します。ここでは、任意のタンパク質が存在しない場合にプロトコルを記述しますが、タンパク質が組み込まれているとき、それは同じであり、私たちはイオンチャネルTRPV1を含むプロテオがGUVsに変換され、パッチクランプ電気生理学に使用できることを示す結果が含まれています。任意の電鋳アプローチでは、脂質堆積プロセス中の脂質サンプルの目視検査が成功に不可欠である。
我々のアプローチはイオンチャネル再構成に専用アプリケーションを超えて関連しているかもしれません。まず現在、このプロトコルを開発してからの時間で、それはまた、脂質電鋳用電極上に積層された方法は、得られたGUVsの組成の不均一性をどのように影響するかが示されている。 BaykアルCaglar ら 14は慎重に脱水リポソームから形成GUVsは、様々なリン脂質とコレステロールの混合物から形成GUVsの混和転移温度で2.5倍小さい変動を有することを示した。彼らの仕事は、その脂質を示し、特にコレステロール、堆積された脂質膜の組成に大きな空間的変動を生じる有機溶媒から析出脂質混合物から沈殿し得る。これは、脂質膜の相挙動の研究のために特に重要であるだけでなく、イオンチャンネル機能に関する定量実験に重要であり得る。バイカル-Caglar らのプロトコルは似ていますが、私たち自身と同一ではない、と読者は、同様にそれを勉強することをお勧めします。
このプロトコルは、（概要、 図1を参照）を使用することができる、多くの一つである。原則電鋳の成功で脂質混合物、水和、温度、他の溶質（特にイオン）、およびに依存もちろん形成に使用される電圧および周波数を。電鋳は、より良い理解になると、我々はより多くの我々のプロトコルを絞り込むことを期待しています。
最後に、巨大リポソームを電鋳で急な学習曲線がしばしばあります。我々は、従来のプロトコル（セクション1と4、そして、必要に応じて、第5項）をリポソーム懸濁液（セクション2-5）から脂質を堆積させるために学習する前にマスタリングを示唆している。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。有機溶媒からの脂質の沈着：クラッシックプロトコル
- 。-20℃または-80℃で貯蔵から脂質を取り外し、RTに暖かい注意：脂質は極めて吸湿性であり、多くは酸素に敏感である。乾燥アルゴンまたは窒素ガス中の脂質をカバーし、 すべてのステップで空気への暴露を最小限に抑えることができます 。
- 必要であれば、1から10 mg / mlのでクロロホルム又はシクロヘキサンに脂質を中断、メーカーの規定の濃度は、通常、名目だけであることに注意してください注意：有機溶剤を使用する場合、適切な手袋および他の個人用保護具を着用してください。ほとんどの材料は、まだこれらの溶剤に対して透過性であり、彼らは唯一の一時的な保護を提供するような溶媒は、その上にこぼした場合はすぐにPPEを外します。
- エタノールを持つ2つの25×37.5ミリメートルITO被覆ガラススライドの両側をきれい
- 所望のモル比を達成するために、脂質を混ぜる。リップで被覆するITOスライドの領域のそれぞれ1cm 2のためのイド、ミックス〜脂質の15〜20μgの。両方とも25×37.5ミリメートルスライドが完全に被覆されるべきであった場合、我々は一般的に10 mg / mlの脂質混合物30μlのを使用します（注）。蛍光イメージングのために0.1モル％、テキサスレッド-DPPEを追加し、に関する注意については、以下を参照してください蛍光色素。
- スライドガラスのITOコーティングされた側が抵抗計またはマルチメータと表面抵抗を測定することにより、上を向いていることを確認します。
- 溶媒耐性シリンジ注意に脂質を吸引：いいえ接着剤やPTFE以外のプラスチック、有機溶剤にお問い合わせください。
- 注射針はかなりITO表面に触れていないと、徐々にスライドを行き来針を動かす脂質を適用します。ガラス表面に "虹の輝き"を探して、均等に表面を覆う。
- <1トル（1 mmHgの）溶剤の痕跡を除去するための0.5-1時間、真空下で素早くスライドを置きます。不活性ガスで真空を解除します。
- で、シリコンガスケットを適用する両側のシリコン真空グリースの薄層。スライドの一端で露出むき出しのスライドの5mm以上にしておきます。
- 第4節にすぐ進みます。
2。制御された脱水のための小さなリポソーム製剤
- ステップ1.4から1.1のように、脂質混合物を準備します。
- 10〜15ミリメートル径培養チューブにアルゴンのストリームまたは窒素ガスを用いた脂質を乾かします。脂質の少量の場合は、≤0.5mgを、得られたフィルムを直接残留溶媒を除去するために0.5〜1時間真空下に置いた後、水和することができ、2.5に進みます。脂質の多量でも真空下で、厚いゲル中に有機溶媒をトラップする傾向があり、良好な凍結乾燥により調製され、ステップ2.3-4を参照してください。
- 、シクロヘキサンで乾燥脂質フィルムを中断ストッパーとアルゴンとシールでカバー、1時間最低-80℃で冷たいブロックと凍結にチューブを配置。
- 真空システムに冷たいブロックと脂質サンプルを置き100トルに達することができる。真空を適用し、それは溶剤昇華オフとして約1Torrで "失速"意志。いったん溶媒が完全に真空がこのレベル以下に低下します（約1時間）に削除されます。不活性ガスで真空を解除し、直ちに管又は水和物を封印。
- 脂質は、真空下でされていますが、脱気水和バッファ真空を使用して15-17を散布。
- 最終濃度1-10 mg / mlので脱気したバッファーを使用して水和物脂質。ゆっくり水和物への脂質を許す。 30分後、1時間、残りの塊を分割するための渦。完全な水和を可能にするために追加の0.5-1時間を待ちます。以下の手順で完全に脱水症状を防ぐために、このような最大200 mmまでのソルビトールまたはスクロースなど、osmoticantを使用してください。
- 押出により100-200 nmの直径リポソームを準備します。詳細については、製造元の押し出しプロトコルを参照してください。バッファは〜25 mMのイオン強度未満持っている必要があります、または特別な電鋳電圧プロトコルは第4節で必要とされることに注意してください。
3。小さなリポソームの制御脱水によって脂質の堆積
- 注意：私たちのプロトコルは脂質が多くの時間のために、飽和塩溶液と蒸気の平衡状態に置かれている必要があります。我々は強くグローブボックスまたは類似のエンクロージャを使用して、不活性ガス雰囲気中でプロトコルを実行することをお勧めします。
- 注意：タンパク質を含む試料を準備した場合、完全な脱水を避ける。水和物は、暖かい水のビーカーを持つ任意のエンクロージャ内の雰囲気、または超音波処理器ベースの加湿器。少なくとも30％の相対湿度があることを確認するために湿度計を使用してください。合計脱水を防ぐために、追加の予防措置として、小さなリポソームバッファ内ソルビトールまたはスクロースを使用してください。
- 適切な相対湿度の飽和塩溶液を準備します。目標湿度は、小胞の準備の浸透圧に依存します。低浸透圧の小胞の準備が十分に脱水することができるしながら生理的浸透圧を有する製剤の場合、30〜45％RHを使用75から90パーセントRH（ 表1も参照）と平衡。
- インテリア棚でしっかり密閉できる容器に飽和食塩水と過剰な塩分を入れて。非常によくヨーグルトとグラノーラの仕事のための商業食品容器。充填した後に棚を交換し、流体はシェルフの下5〜10ミリメートルであることを確認してください。
- セクション1のようにITOコートしたスライドを清掃してください。導電性のある側面を決定し、サンプル名と非導電性の面にラベルを付けるためにマルチメータを使用します。
- 軽くグリースつまたは複数の孔を有するシリコーン（USPグレードVI）ガスケット（複数可）の両側。
- ベンチの上に導電性のスライド側を上に置き、電鋳装置に接続するための一方の端部に露出したスライドの少なくとも5mmがあることを確認し、脂質が適用される各スライドにシリコーンガスケット（s）を適用する。良好なシール性を確保するためにガスケットを滑らかに。
- 〜1-2 mg / mlのに低塩等張緩衝液中の小胞の準備を希釈。我々は、より高いconcentrを見つける管理ポイントが悪い結果を生む。
- 1-10液滴内のスライドに脂質を適用します。小さな液滴は、一般的に良い結果を生む。
- 飽和塩溶液上記のインテリア棚の上にスライドを置き、しっかりと容器を密封する。 O / Nに3時間室温で残す容器を4℃で配置することができるが、いくつかの塩のために、RH、温度、およびその冷たいに強く依存することに注意が平衡時間を増加させる。
- 得られたフィルムは、それにわずかに虹の光沢を持っているかもしれませんが、いずれにしてもほぼ乾燥表示されるはずです。高い浸透開始ソリューションは、脂質膜に完全に乾燥することは不可能かもしれないが、これは逆に結果には影響しません。
4。ジャイアントリポソームの電鋳
- 特に、脂質膜、脱水リポソームから形成されたものは、容易に外れている。 慎重水和物各ウェルは、ガスケット27の端部にGの注射針を配置し、 徐々にバッファを適用することによって。バッファができます水、≤200mMのスクロース、ソルビトール≤1 Mと≤の5mM HEPESを含む。以上の10mM塩溶液は、代替電鋳電圧プロトコルを必要とするかもしれない。 〜10％よくあふれ各ガスケット。
- 注：一度脂質が水和している、脂質膜はすぐに剥離し始めているので、残りの手順をすばやく進める。電鋳は、速やかに始まる場合収量とサイズが最大化されています。
- 1滑らかな動きでは、ガスケットの一番上に、第二のITOスライド、導電性の顔を適用します。ガスケットエリア外と最初のオーバーハング反対オーバーハングの少なくとも5ミリメートルを持っていることを確認してください。良好なシール性を確保するために軽く押します。
- エタノールを使用して2オーバーハングを清掃し、ガスケットが直面している側面があなたのマルチメータを有する導電性であることを確認します。
- 必要に応じてチャンバーはパラフィルムや光テンションスプリングクリップでさらに固定することができる。
- "、アルミニウムまたは銅バーを固定することによって、電圧源にEMI gaskを電鋳槽を接続するら2つのスライドの導電性表面に泡"、または導電性粘着テープ。私たちはEMIガスケットの泡を使用しています。具とクランプのための計画は、 図5に示します。
- 接点間には電気的短絡がないことを確認し、マルチメータを使用して、連絡先がITO表面に適切に接続すること。
- 52にDPPC用など 、熱42のチェーン融解温度℃以上、最低10℃℃、室内は10℃現在の脂質のうちのいずれかの最高溶融温度以上Cを加熱
- 低塩バッファの場合、60〜90分間、10 Hzの正弦波、2 ITOコーティングされた表面間の各ミリギャップ〜0.7 V RMSを適用。高塩緩衝液については、他の電圧プロトコル（参考文献を参照）を使用すべきである。
5。イメージングとトラブルシューティング
- イメージローダミンまたはテキサスレッド染料用のフィルタキューブ装備倒立顕微鏡を用いてリポソームを。リポソームは、球状であるべき主に目で単層、およびそのようなリポソームをオフにぶら下がって "文字列"として欠陥。
- リポソームが小さすぎると、より少ない脂質を使用する。
- 多くの欠陥または少数のリポソームがある場合、これは、ゲル相脂質に起因する可能性がある。電鋳の温度を上昇させることを検討してください。
- 脱水小さなリポソームから全く形成少ない又は全く巨大リポソーム場合、リポソームバッファの浸透強度を低下させる、または電鋳バッファの浸透強度を高める。濃縮された間質性緩衝液中にバッファの突入は、堆積脂質フィルムの剥離を引き起こす可能性があります。
- 小胞の収量、品質、またはサイズが悪く、あなたは電鋳やリポソームバッファー中の塩またはpH緩衝液が含まれている場合、代替電鋳電圧プロトコルを検討してください。例えば、ポットら 11は 、90分間保持して、Vppは50-1,300 / mで30分かけてからの電圧を上昇させる、500Hzの正弦波を用いて3段階プロトコルを推薦するnは30〜60分かけて50 Hzに周波数を下げる。白金またはチタン電極は、この場合には必要とされ得るが、これは実質的にプロトコルを変更しません。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我々の実施例では、約55モル％のPOPC（1 -パルミトイル-2 -オレオイル-sn-グリセロ-ホスホコリン）、15モル％ポップ（1 -パルミトイル-2 -オレオイル-sn-グリセロホスホセリンの混合物からリポソームを調製、30モル％コレステロール、および0.1モル％テキサス1,2 -ジパルミトイル-SN-ホスホエタノールアミン（TxRは-DPPE）赤標識。この組成物は、18後根神経節の脂質の約代表として選ば れた。我々は15モル％の充電に注意脂質（ここではPOPS）は（ 例えばヴァルデら 4）電鋳で使用することができるものの限界に近いです。
加水分解と過酸化脂質によって降伏が（説明を参照）、多くの脂質混合物と多くの敏感な実験のための特に重要な課題である。一人で明確にするために、我々はビデオプレゼンテーションに不活性ガス雰囲気を使用しないでください。以下の図から明らかなように、これは著しく又はリポソームの品質に影響を与えるが、敏感な研究のためにません。高不飽和脂質を使用するときには、脂質破壊を防止することが重要である。
電鋳の主要なハードルは乾燥が重要であるときに脂質膜がどのように見えるかを知って、酸化インジウムスズ（ITO）基板上に良好な脂質膜を形成することであるため。しかし、電鋳が失敗したとき、それはしばしば無感知できる巨大なリポソーム製造に生じるので、全くない。しばしば、かなりの残骸が観察され、これは、典型的にはあまりにも多くの脂質が使用されていることを示している。我々の数字は1つが成功を見るために期待するものを示しています。
図2はクロロホルムの外に堆積脂質から電鋳リポソームの二つの異なるパッチを示しています。左側のパネルで、密接に矢印2と3で示されるパッチを調べます。矢印2が悪い区別リポソームでパッチを示している間は、リポソームを矢印3で示された領域に焦点に持ち込まないことができます。一緒に、これらの調査結果は、一般的に貧しい人々を示すあまりにも脂質であることそこにおそらく準備は、この地域に堆積。右側のパネルで、このような "ファジー"の領域は、一般的に良い準備を示す、あまり一般的である。我々は、それは完全にそのような欠陥を解消することはまれであることがわかります。
図3は 、正常脂質から電鋳リポソームは、2倍率で、小さなリポソームの脱水により堆積テキ サスレッドエピ蛍光を用いて画像化を示しています。リポソームはまばらですが、いくつかの良い標本があります。大きさが異なるため、いくつかは、フォーカスから外れている。矢印は、40倍の倍率の画像に表示され、そのうちの2つ〜5-20μmの、からサイズの範囲の3つの良い品質のリポソームを示す。エッジで明確な "リング"注意：これは単層またはほぼ単層リポソームを示します。脂質のいくつかのスポットが脂質を崩壊または形成されたことがないように見えるが、これは質の良い結果です。
最後に、このプロトコルを開発し、公開中の我々の目的従来のパッチクランプ電気生理学に適してそのまま、機能的な哺乳動物のイオンチャネルとGUVsを準備することです。 図4では、我々は、このプロトコルを用いて形成さGUVsから切り出し脂質膜パッチに記録されたカプサイシン活性TRPV1イオン電流を示す。電流は、ルテニウムレッドによって遮断することができ、カプサイシン車両（0.1％エタノール、138のNaCl、3mMのHEPES緩衝液（pH7.4））のみによって活性化されない。電気生理学実験のためのプロテオリポソームの調製は、はるかに現在のプロトコルの範囲を超えていますが、提出され記事の主題である。
| 塩 | モル濃度@ 20℃、飽和 | ％RH @ 10℃ | ％RH @ 20℃ | ％RH @ 30℃ |
| 塩化マグネシウム六水和物 | 5.8 | 33 | 33 32 | |
| 炭酸カリウム水和物 | 8.0 | 47 | 44 | 42 |
| 臭化ナトリウム | 4.6 | 58 | 57 | 57 |
| 塩化銅 | 5.6 | 68 | 68 | 67 |
| 塩化ナトリウム | 6.13 | 75 | 75 | 75 |
| 塩化カリウム | 4.61 | 87 | 86 | 84 |
表1。いくつかの一般的な塩の相対湿度（％RH）グリーンスパン19とロックランド20から相対湿度データ;。国際重要な表21から彩度データ。
図1。小さ なリポソームから巨大リポソーム電鋳の回路図 （左上）小さなリポソームを小さな液滴の配列内に堆積している、<5μlの。 （上中央）リポソームは飽和塩溶液上記密閉容器にそれらを置くことによって、制御さ相対湿度下に脱水されています。湿度計はオプションです。 （右上）ソルビトールなどの脂質と、（おそらく）osmoticantの粘着性フィルムに一旦脱水、脂質（プロトコルセクション5を参照）高浸透圧バッファーで再水和されています。 （左下）電鋳槽は、上部に第2のITOスライドで封止されている。 （右下）最後に、チャンバは脂質鎖の融解温度以上に加熱し、二ITOスライド全体の振動電場を提供する信号源に接続されている。
図3。電鋳巨大リポソームは脱水蒸着脂質。（左）10倍の倍率でから形成された 、いくつかのリポソームが表示されます。三リポソームはラベルが付いています。 （右）と同じで40倍の倍率で同左ビューは、リポソーム（2,3）標識。これらのリポソームの数は、典型的には、溶媒堆積脂質から電鋳時よりもはるかに小さいが、多くの目的のために完全に十分である。クロマ41004テキサスレッドフィルターキューブとスタンフォードフォトニクスXR/MEGA-10 S30激化CCDカメラを搭載した倒立落射蛍光顕微鏡を用いて撮像。 
図4。カプサイシンはGUVから切り出し膜パッチで記録TRPV1電流は、このプロトコルを使用して形成され活性化した。A.は、カプサイシンが追加される前MΩ抵抗を密封するリーク電流が500を示した。B.飽和カプサイシン（0.1％エタノール中> 20μMは、）を活性化大電流TRPV1、電流がルテニウムレッドによってブロックされ、C.（データは示さず）単独（緩衝液中の0.1％エタノール）車両が現在戻り、活性化されない。カプサイシンとして近いベースラインにパッチの外に洗浄される。 
図5。電鋳槽の計画。含まれている完全なアセンブリを示し、上部と下部のプラスチック片のための回路図に寸法、概要です。アクリルまたは他の容易に加工透明なプラスチックを使用してください。薄膜カプトン膜ヒータは、温度コントローラ（特異的試薬および装置の表を参照）に接続されるべきであり、EMIガスケット発泡体は、正弦波信号は、2つのITO被覆スライドの両端に印加されるように、関数発生器に接続されるべきである。孔は、温度プローブが提供される。皿10-32ねじをボトムピースに皿穴に入れ、上部片を通過している。 10-32ナットアセンブリを固定するために使用される。ときに完全にとしてsembled、上部と下部のプラスチック片（EMIガスケットに平行な辺）。両側に互いに同一平面であるべきより大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
巨大リポソームの電鋳は、多様な脂質、準備、およびバッファとの互換性が柔軟な手法へと発展しています。脂質堆積プロセスの注意深い制御が成功にとって最も重要である。私たちは小さなリポソーム製剤簡単なプロセスからの脂質の制御された堆積を作るための簡単なツールを提示している。相対湿度は、初期リポソームの適切な脱水するために重要であり、最適値は、リポソーム懸濁液中の溶質の初期濃度によって変化する。下の相対湿度が十分なレベルに、より濃縮サンプルを脱水する必要があります。
電鋳ために使用される正確な水和プロトコル電界がまだ1,4,7,10,11,22点のままである。最も単純なプロトコルは、高塩濃度、荷電脂質、または高メルトの非常に高濃度の存在下でリポソーム電鋳を行う前に、最初に習得すべきである温度脂質をる。初期の腫れ、成長、および剥離：これらのスキルを習得したら、より高度なプロトコルは、一般的に三つの部分に電鋳プロセスを分割します。初期の膨潤をゆっくり印加電界11を増加させることによって好まれると思われる。固定された電界強度の第二は、オプションの段階は、リポソームの最終的なサイズを制御するのに役立ちます。最後に、振動磁場の周波数を小さくするとITO表面からリポソームを切り離すのに役立つことがあります。より高い周波数は、生理食塩条件11に、リポソームを電鋳するために必要とされるが、リポソームは、フィールド周波数と振幅10の非常に広い範囲に亘って形成することができる。
巨大リポソームは低刺激浸透バッファ7と脱水リポソームの再水和によって自発的に形成することになるという観測が成功への複数のキーを示します。まず、リポソーム腫れプロセスはように電鋳のため、いくつかの、すぐに開始されます基も、それが有用な脂質膜10を再水和前に交流電界を印加することを見出した。第二に、流体の流れは、リポソームの膨潤プロセスを駆動している可能性があり、そのためには、電鋳、電気浸透駆動流から少なくとも部分的に起こる。この場所での電鋳10に用いることができる有用な周波数および振幅の範囲に制限。
過去数年間の議論の主なポイントは、脂質の加水分解と過酸化23,24の可能性となっています。いかなる種類の脂質分解に対する最初の防衛は、GUVの準備で使用されるすべての材料から酸素を除去することですが、過酸化酸素分子23に依存するので、これはかなりのプロセスを遅くする必要があります。不活性ガスと真空とスパージングの組み合わせが可能15-17限り酸素を除去するために使用されるべきである。超音波処理と光真空が効果がありません。我々はVへの酸素テストキット（Chemetrics K7501）を使用我々は可能な限り徹底的に酸素を削除したことerify。加水分解は、より有害であるが、中性pH 25と、電鋳24で使用される電圧を低減することによって維持することによって低減される。一部の著者は、ITOスライド23,24,26,27の代わりにチタン電極を使用することを提唱しています。それは過去にリポソーム実験28,29と干渉することが知られているので我々は、チタン（または任意の金属）で我々のサンプルを汚染する可能性を回避することを好むが、それはいくつかの過酸化や加水分解の影響を防止するために役立つかもしれない。これは、高温に長時間さらされるが、脂質故障30を加速させることは言うまでもない。最後に、薄層クロマトグラフィー24,31、比色アッセイ23、および他の方法31は、脂質分解を定量化するために存在する。
同様の問題は、特に横方向の相分離30,32の研究のために、画像GUVsに使用される蛍光色素脂質に関し30,33、及び最小の濃度で使用される。
私たちは、ITO電極スライドを再利用できるかどうかを上の任意のコンセンサスを認識していません。多くのグループがいくつかありませんが、彼らのITOスライドを再利用を行う。最近の研究では、スライドが時間の経過とともに劣化しないことを示しますが、高性能34を回復するためにアニールすることができ、この劣化は両性イオンまたは陰イオン性脂質を含む脂質混合物のためにわずかな効果があったが、カチオン性脂質を含む混合物のために重要だった。私たちは、アニーリングなしで我々のスライドを再利用します。
巨大リポソームを電鋳に使用されるプロトコルに大きなばらつきがあるが、技術と理論的な理解と実践的な経験は絶えず向上している。リポソームは既に荷電した脂質の、または高塩緩衝液中に大量に形成することができる。キーはwhic、電極表面上の脂質の効率的な堆積のままhは我々のプロトコルの中核です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、電鋳装置を構築するためにブライアンVenema氏とエリック·マーティンソンに感謝します。この作品は、国立衛生研究所の総合医科学の国立研究所からの補助金（SEGへR01GM100718）と国立衛生研究所の国立眼研究所（SEGへR01EY017564）によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
- Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. Journal of Physics-Condensed Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
- Giant Vesicles. Luisi, P. L., Walde, P. , John Wiley & Sons Ltd. (2000).
- Riquelme, G., Lopez, E., Garcia-Segura, L. M., Ferragut, J. A., Gonzalez-Ros, J. M. Giant liposomes: a model system in which to obtain patch-clamp recordings of ionic channels. Biochemistry. 29 (51), 11215-11222 (1990).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Aimon, S., Manzi, J., Schmidt, D., Poveda Larrosa, J. A., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. Functional reconstitution of a voltage-gated potassium channel in giant unilamellar vesicles. PLoS. One. 6 (10), e25529 (2011).
- Girard, P., Pecreaux, J., Lenoir, G., Falson, P., Rigaud, J. L., Bassereau, P. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophys. J. 87 (1), 419-429 (2004).
- Manley, S., Gordon, V. D. Making giant unilamellar vesicles via hydration of a lipid film. Curr. Protoc. Cell. Biol. 24, 1-13 (2008).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Angelova, M. I., Soleau, S., Meleard, P., Faucon, J. F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Kinetics and applications. Progressin Colloid & Polymer Science. 89, 127-131 (1992).
- Politano, T. J., Froude, V. E., Jing, B., Zhu, Y. AC-electric field dependent electroformation of giant lipid vesicles. Colloids. Surf. B. Biointerfaces. 79 (1), 75-82 (2010).
- Pott, T., Bouvrais, H., Méléard, P. Giant unilamellar vesicle formation under physiologically relevant conditions. Chem. Phys. Lip. 154 (2), 115-119 (2008).
- Sens, P., Isambert, H. Undulation Instability of Lipid Membranes under an Electric Field. Phys. Rev. Lett. 88 (12), (2002).
- Green, N. G., Ramos, A., González, A., Morgan, H., Castellanos, A. Fluid flow induced by nonuniform ac electric fields in electrolytes on microelectrodes. I. Experimental measurements. Phys. Rev. E. 61 (4), 4011-4018 (2000).
- Baykal-Caglar, E., Hassan-Zadeh, E., Saremi, B., Huang, J. Preparation of giant unilamellar vesicles from damp lipid film for better lipid compositional uniformity. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (11), 2598-2604 (2012).
- Bakalyar, S. R., Bradley, M. P. T., Honganen, R. The role of dissolved gases in high -performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 158 (0), 277-293 (1978).
- Brown, J. N., Hewins, M., Van Der Linden, J. H. M., Lynch, R. J. Solvent degassing and other factors affecting liquid chromatographic detector stability. J. Chromatogr. A. 204, 115-122 (1981).
- Dolan, J. W. Mobile Phase Degassing-Why, When, and How. LC-GC. 17 (10), 909-912 (1999).
- Cheng, H., Jiang, X., Han, X. Alterations in lipid homeostasis of mouse dorsal root ganglia induced by apolipoprotein E deficiency: a shotgun lipidomics study. J. Neurochem. 101 (1), 57-76 (2007).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. J. Res. Natl. Bur. Stand. 81 (1), 89-96 (1977).
- Rockland, L. B. Saturated Salt Solutions for Static Control of Relative Humidity between 5 ° and 40 °C. Anal. Chem. 32 (10), 1375-1376 (1960).
- Washburn, E. W. International Critical Tables of Numerical Data, Physics, Chemistry and Technology (1st Electronic Edition). , 216-249 (2003).
- Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochim. Biophys. Acta. 1712 (2), 152-160 (2005).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid Peroxides Promote Large Rafts: Effects of Excitation of Probes in Fluorescence Microscopy and Electrochemical Reactions during Vesicle Formation. Biophys. J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Morales-Penningston, N. F., Wu, J., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim. Biophys. Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Grit, M., de Smidt, J. H., Struijke, A., Crommelin, D. J. Hydrolysis of phosphatidylcholine in aqueous liposome dispersions. Int. J. Pharm. 50 (1), 1-6 (1989).
- Zhou, Y., Berry, C. K., Storer, P. A., Raphael, R. M. Peroxidation of polyunsaturated phosphatidyl-choline lipids during electroformation. Biomaterials. 28 (6), 1298-1306 (2007).
- Farkas, E. R., Webb, W. W. Multiphoton polarization imaging of steady-state molecular order in ternary lipid vesicles for the purpose of lipid phase assignment. J. Phys. Chem. B. 114 (47), 15512-15522 (2010).
- Hauser, H. O. The effect of ultrasonic irradiation on the chemical structure of egg lecithin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45 (4), 1049-1055 (1971).
- Hauser, H. Phospholipid vesicles. Phospholipids Handbook. Cevc, G. , Marcel Dekker, Inc. New York, New York. (1993).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Meth. Mol. Biol. 398, 59-72 (2007).
- Kim, R. S., LaBella, F. S. Comparison of analytical methods for monitoring autoxidation profiles of authentic lipids. J. Lipid. Res. 28 (9), 1110-1117 (1987).
- Veatch, S. L., Leung, S. S. W., Hancock, R. E. W., Thewalt, J. L. Fluorescent probes alter miscibility phase boundaries in ternary vesicles. J. Phys. Chem. B. 111 (3), 502-504 (2007).
- Juhasz, J., Davis, J. H., Sharom, F. J. Fluorescent probe partitioning in GUVs of binary phospholipid mixtures: implications for interpreting phase behavior. Biochim. Biophys. Acta. 1818 (1), 19-26 (2012).
- Herold, C., Chwastek, G., Schwille, P., Petrov, E. P. Efficient electroformation of supergiant unilamellar vesicles containing cationic lipids on ITO-coated electrodes. Langmuir. 28 (13), 5518-5521 (2012).
