Préparation des liposomes de géant pour l'imagerie et de patch-clamp électrophysiologie

Summary

La reconstitution de protéines membranaires fonctionnelles dans des liposomes géants de composition définie est une approche puissante lorsqu'elle est combinée avec l'électrophysiologie patch-clamp. Cependant, la production de liposome géant conventionnel peut être incompatible avec la stabilité des protéines. Nous décrivons les protocoles de production de liposomes géants de lipides purs ou des petits liposomes contenant des canaux ioniques.

Abstract

La reconstitution des canaux ioniques dans les membranes lipidiques chimiquement définis pour l'enregistrement électrophysiologique a été une technique puissante pour identifier et d'explorer la fonction de ces protéines importantes. Cependant, les préparations classiques, tels que les bicouches planaires, limiter les manipulations et expérimentations qui peuvent être effectuées sur le canal reconstitué et son environnement membranaire. La structure cellulaire plus comme des liposomes géants permet des expériences de patch-clamp traditionnels sans pour autant sacrifier le contrôle de l'environnement lipidique.

Électroformation est un moyen efficace pour produire des liposomes géants> 10 um de diamètre, qui repose sur l'application de la tension alternative d'un mince film lipidique ordonnée déposée sur une surface d'électrode. Toutefois, depuis le protocole classique appelle les lipides à déposer à partir de solvants organiques, il n'est pas compatible avec les protéines membranaires moins robustes comme les canaux ioniques et doit être modifié. Récemment, protocols ont été développés pour électroforme liposomes géants de petits liposomes partiellement déshydratés, que nous avons adapté à des liposomes contenant des protéines dans notre laboratoire.

Nous présentons ici l'arrière-plan, de l'équipement, les techniques et les pièges de électroformation de liposomes géants de petites dispersions de liposomes. Nous commençons avec le protocole classique, qui doivent être maîtrisées avant de tenter les protocoles les plus difficiles qui suivent. Nous démontrons le processus de déshydratation partielle contrôlée de petits liposomes en utilisant équilibre vapeur avec des solutions salines saturées. Enfin, nous démontrons le processus de électroformation lui-même. Nous allons décrire l'équipement simple et peu coûteuse qui peut être fait en interne pour produire des liposomes de haute qualité, et de décrire l'inspection visuelle de la préparation à chaque étape afin d'assurer les meilleurs résultats.

Introduction

Liposomes géants (souvent appelés vésicules unilamellaires géantes, ou GUVS) ont principalement été utilisées pour étudier la physique et la chimie physique de bicouches lipidiques, y compris les études de déformation bicouche, la coexistence de phase latérale ("rafts"), la fusion de la membrane, etc ^1-4. Elles ont une structure cellulaire grossière comme: coque sphérique de la membrane entourant un intérieur aqueux qui peut facilement être fait différent de celui du tampon aqueux environnant. Ils sont, par définition, ≈ 1-100 m de diamètre, de sorte qu'ils peuvent être visualisés en utilisant une variété de méthodes de microscopie optique. Ils peuvent être fabriqués en utilisant des gradients osmotiques tendue ou la tension appliquée mécaniquement, de sorte que même si généralement doux, leurs propriétés peuvent être manipulées pour une manipulation aisée. En particulier, le contrôle de la "rigidité" du liposome, il est facile de former des plaques "liposome-inscrits" ou excisés pour l'électrophysiologie. Dans le passé, la reconstitution des canaux ioniques a été en grande partie réalisée en plan lipidique bilayers. Maintenant, la capacité à former des plaques de liposomes géants et utiliser le carquois considérable d'outils développés pour l'électrophysiologie classique (microscopie à fluorescence, micropipette aspiration, perfusion rapide et un contrôle de la température, etc) rend liposomes géants de plus en plus attrayant pour les études de reconstitution ^5,6.

Liposomes géants ont été faites par de nombreuses stratégies. En effet, les liposomes géants forment spontanément par un processus de gonflement lors d'un film lipidique séché est réhydraté ^4,7,8. Le désir de préparer plus rapidement plus, les liposomes plus uniformes conduit les chercheurs à d'autres approches, au premier rang desquels électroformation ^1,9. Électroformation s'appuie également sur l'hydratation d'un film lipidique séché, mais accélère le processus par l'application d'un champ électrique oscillant à travers le film lipidique. Le champ est appliqué au moyen de deux électrodes, soit des fils de platine ou de l'indium-étain (ITO) des lames de verre recouvertes, séparés par de l'eau outampon et sur laquelle les lipides sont déposées. En accélérant le gonflement des liposomes, on obtient un rendement plus élevé des grands liposomes. Ainsi, électroformation est devenue la méthode par défaut pour produire des liposomes géants ^4.

Le mécanisme de électroformation n'est pas entièrement comprise, et la plupart des protocoles sont développés de manière empirique (par exemple ^10,11). Néanmoins, nous pouvons en apprendre un peu plus sur ce à quoi s'attendre en tenant compte de la théorie et des résultats empiriques. Il est largement admis que électroformation se produit en conduisant flux électro-osmotique de tampon entre les bicouches lipidiques individuels empilés dans le film lipidique déposé ^10,11. Couplage électrostatique aux fluctuations thermiques des bicouches lipidiques est probablement aussi impliquée ^12. Ces hypothèses prédisent qualitativement limites supérieures de la fréquence du champ électrique et de la force qui peut être utilisé ^10,12. En particulier, il est prévu que les solutions à haute conductivité ( 12. Taux d'écoulement électro-osmotique diminuent généralement avec l'augmentation de la concentration en sel et sont fréquemment atteint un sommet à une certaine fréquence d'oscillation du champ électrique (par exemple, bien que dans une géométrie différente, Green et al. ^13). Ainsi, les intensités de champ supérieures et des fréquences plus élevées sont raisonnables pour des solutions à haute conductivité, dans les limites de ^10.

Toutefois, les protéines membranaires sont susceptibles d'être incompatible avec la méthode habituelle de dépôt de lipides sur des électrodes pour la procédure electroswelling, notamment dans les solvants organiques qui sont ensuite évaporés pour laisser un film lipidique mince. Il ya deux voies principales de contourner cette difficulté: pour incorporer des protéines après la formation du liposome géant, ou d'adapter la manière dont les lipides sont déposés. Notre approche s'appuie sur d'autres ^5,11 à déposer les lipides et reconstitutiontuait une protéine de la membrane ainsi que d'une suspension de petites ou grandes "protéoliposomes". Nous décrivons le processus long et plus difficile de produire des protéoliposomes de protéines et de lipides purifiés ailleurs (Collins et Gordon, en révision). Nous décrivons ici le protocole en l'absence de toute protéine, mais il est le même lorsque la protéine est constituée, nous incluons les résultats montrant que protéoliposomes contenant le canal TRPV1 ion peuvent être transformés en GUVs et utilisés pour patch-clamp électrophysiologie. Dans toute approche électroformation, une inspection visuelle de l'échantillon de lipides au cours du processus de dépôt lipidique est essentielle au succès.

Notre approche peut être pertinent au-delà de l'application spécialisée pour la reconstitution du canal ionique. Dans le même temps depuis que nous avons mis au point ce protocole, et maintenant, il a également été montré comment la façon dont les lipides sont déposés sur des électrodes pour électroformation affecte l'hétérogénéité compositionnelle des GUVs en résultent. Bayk¹⁴ Al-Caglar et al. ont montré que GUVs liposomes formés à partir soigneusement déshydratés ont un 2,5 fois plus faible variation de la température de transition de miscibilité de GUVs formés à partir de mélanges de divers phospholipides et de cholestérol. Leurs travaux indiquent que les lipides, et en particulier le cholestérol, peut précipiter à partir du mélange de lipides déposés lors de solvants organiques, ce qui entraîne une grande variation spatiale dans la composition du film lipidique déposé. Ceci est particulièrement important pour les études sur le comportement de phase de membrane lipidique, mais peut aussi être critique aux expériences quantitatives sur le fonctionnement des canaux ioniques. Baykal-Caglar et al 's. Protocole est similaire, mais pas identique à la nôtre, et les lecteurs sont encouragés à étudier aussi.

Ce protocole (voir l'aperçu, figure 1) est l'un des nombreux qui pourrait être utilisé. Dans succès de électroformation de principe dépend du mélange de lipides, de l'hydratation, de la température, d'autres solutés (en particulier des ions), et deBien entendu la tension et la fréquence utilisée dans la formation. Comme électroformation devient mieux comprise, nous nous attendons à affiner notre protocole plus.

Enfin, il ya souvent une courbe d'apprentissage abrupte dans galvanoplastie liposomes géants. Nous suggérons la maîtrise du protocole classique (articles 1 et 4, et, si nécessaire, la section 5) avant d'apprendre à déposer lipides à partir de suspensions de liposomes (articles 2-5).

Protocol

1. Dépôt de lipides parmi les solvants organiques: protocole classique

1. Éliminer les lipides de stockage à -20 ° C ou -80 ° C, réchauffer à température ambiante. Attention: les lipides sont très hygroscopiques, et beaucoup sont sensibles à l'oxygène. Couvrir lipides dans l'argon sec ou gaz azote et à toutes les étapes de minimiser l'exposition à l'air.
2. Si nécessaire, suspendre les lipides dans le chloroforme ou le cyclohexane à mg / ml 1-10; noter que les concentrations indiquées par le fabricant sont généralement nominale seulement ATTENTION: Porter des gants appropriés et d'autres équipements de protection individuelle lors de l'utilisation de solvants organiques.. Retirez le PPE rapidement si solvant est déversé sur eux, comme la plupart des matériaux sont encore perméables à ces solvants et ils ne fournissent qu'une protection temporaire.
3. Nettoyez les deux côtés de deux 25 37,5 mm ITO lames de verre enduites x avec de l'éthanol
4. Mélanger les lipides pour atteindre les ratios molaires souhaités. Pour chaque 1 cm ² de surface de l'ITO coulisse à revêtir avec la lèvreid, mélange ~ 15-20 mg de lipides. Par exemple, si les deux 25 x 37,5 diapositives mm devaient être entièrement recouvert, nous aurions utilisent généralement 30 ul de 10 mg / mélange lipidique ml. Remarque: ajouter 0,1% en moles Texas Red-DPPE pour l'imagerie de fluorescence, et voir ci-dessous met en garde les colorants fluorescents.
5. Vérifiez que le côté enduit ITO des lames de verre est orientée vers le haut par la mesure de la résistance de surface avec un ohmmètre ou un multimètre.
6. Aspirer les lipides dans un solvant résistant à la seringue. Attention: Pas de colles ou de matières plastiques, autres que PTFE, doivent communiquer avec le solvant organique.
7. Avec l'aiguille de la seringue n'est pas tout à fait de toucher la surface d'ITO, appliquer doucement le lipide déplacer l'aiguille et d'autre de la glissière. Couvrez la surface de manière aussi uniforme, à la recherche d'un «éclat Rainbow" sur la surface du verre.
8. Placer les lames rapidement sous <1 Torr (1 mmHg) vide pendant 0,5-1 heures pour éliminer toute trace de solvant. Relâcher vide avec un gaz inerte.
9. Appliquer un joint de silicone, avec unefine couche de graisse à vide de silicone sur les deux côtés. Laisser au moins 5 mm de la lame exposée non recouverte d'un côté de la glissière.
10. Procéder immédiatement à la section 4.

2. Petit Préparation des liposomes pour déshydratation contrôlée

1. Préparer le mélange de lipides que dans les étapes 1.1 à 1.4.
2. Sécher les lipides en utilisant un courant d'argon ou de l'azote gazeux dans un tube de culture de diamètre de 10-15 mm. Pour les petites quantités de lipides, ≤ 0,5 mg, le film qui en résulte peut être hydraté directement après l'avoir placé sous vide pendant 0,5-1 heures pour éliminer le solvant résiduel, passez à l'étape 2.5. De plus grandes quantités de lipides ont tendance à piéger les solvants organiques en un gel épais, même sous vide, et sont mieux préparés par lyophilisation; voir les étapes 2.3-4.
3. Suspendre le film lipidique séché dans le cyclohexane, le couvercle à l'Argon et sceller avec un bouchon, placer le tube dans un bloc froid et le gel à -80 ° C pendant 1 heure minimum.
4. Placer le bloc froid et de l'échantillon de lipide dans un système de videcapable d'atteindre 100 mTorr. Appliquer le vide, il sera «décrochage» à environ 1 Torr comme sublimes solvant de congé. Une fois solvant est complètement enlevé (~ 1 heure) vide descend en dessous de ce niveau. Relâchez vide avec un gaz inerte et sceller le tube ou hydrate immédiatement.
5. Alors que les lipides sont sous vide, tampon d'hydratation Degas utilise vide et barbotage ^15-17.
6. Hydrater les lipides en utilisant un tampon dégazée à une concentration finale 1-10 mg / ml. Autoriser les lipides pour hydrater doucement. Après 30 min-1 heure, vortex pour briser les mottes restantes. Attendre une 0,5-1 heures supplémentaires pour permettre une hydratation complète. Utiliser un osmoticant, tels que le sorbitol ou le saccharose jusqu'à 200 mm, pour éviter la déshydratation complète dans les étapes ci-dessous.
7. Préparer 100-200 liposomes nm de diamètre par extrusion. Consultez le protocole d'extrusion du fabricant pour plus de détails. Notez que le tampon doit avoir moins de ~ mM force ionique 25 ou protocoles spéciaux de tension électroformation seront nécessaires dans la section 4.

3.Dépôt de lipides par déshydratation contrôlée de petits liposomes

1. Attention: Notre protocole nécessite lipides pour être placés dans l'équilibre vapeur avec des solutions salines saturées pendant de nombreuses heures. Nous vous recommandons vivement d'effectuer le protocole dans une atmosphère de gaz inerte, en utilisant une boîte à gants ou un endroit similaire.
2. Attention: Si la préparation des échantillons contenant des protéines, éviter la déshydratation complète. Hydratez l'atmosphère dans une enceinte avec un gobelet d'eau tiède, ou un humidificateur à base d'ultrasons. Utilisation d'un hygromètre pour assurer qu'il ya au moins 30% d'humidité relative. Utilisez le sorbitol ou le saccharose dans le petit tampon liposome comme une précaution supplémentaire pour éviter la déshydratation totale.
3. Préparer une solution de sel saturée d'humidité relative approprié. humidité cible dépend de l'osmolarité de la préparation de vésicules. Pour les préparations avec osmolarité physiologique, utiliser 30-45% d'humidité relative, tandis que de faibles préparations de vésicules d'osmolarité peuvent être suffisamment déshydratééquilibre avec 75-90% d'humidité relative (voir aussi tableau 1).
4. Mettez la solution saturée de sel et l'excès de sel dans un récipient hermétiquement scellé avec une tablette intérieure. Contenants d'aliments commerciaux pour le yogourt et granola fonctionnent très bien. Remplacer le plateau après le remplissage, et assurez-vous fluide est de 5-10 mm en dessous de la tablette.
5. Nettoyer les lames recouvertes d'ITO de l'article 1. Utilisez le multimètre pour déterminer de quel côté est conducteur, et d'étiqueter le côté non-conducteur avec le nom de l'échantillon.
6. Graisser légèrement deux côtés de l'(USP classe VI) joint en silicone (s) avec un ou plusieurs trous.
7. Placez le côté conducteur de diapositives sur le banc, et appliquer le joint silicone (s) à chaque diapositive à laquelle lipidique sera appliqué, s'assurer qu'il ya au moins 5 mm de lame exposée à une extrémité pour se connecter à l'appareil de électroformation. Lisser le joint d'étanchéité pour assurer une bonne étanchéité.
8. Diluer la préparation de vésicules dans un tampon pauvre en sel iso-osmotique à ~ 2.1 mg / ml. Nous constatons que concentr supérieurtions produisent des résultats médiocres.
9. Appliquer lipidique à la diapositive en gouttes ul 1-10. Gouttes plus petites produisent généralement de meilleurs résultats.
10. Placer la lame sur le plateau intérieur au-dessus de la solution de sel saturée et sceller hermétiquement le récipient. Laisser à température ambiante pendant 3 heures à O / N. Le récipient peut être placé à 4 ° C, mais il faut noter que, pour certains sels, l'humidité relative dépend fortement de la température, et que le froid va augmenter le temps d'équilibration.
11. Le film qui en résulte peut avoir un léger éclat d'arc-en pour lui, mais en tout cas devrait apparaître presque desséché. Solutions de départ très osmotiques peuvent être impossibles à sécher complètement à un film lipidique, ce qui n'affectera pas les résultats.

4. Électroformation de liposomes géants

1. films lipidiques, en particulier ceux formés à partir des liposomes déshydratés, sont facilement délogés. soigneusement hydrate chaque puits en plaçant une aiguille de seringue 27 sur le bord du joint et l'application d'un tampon lentement. Tampons peuventinclure l'eau, ≤ 200 mM de saccharose, ≤ 1 M sorbitol et ≤ 5 HEPES. Solution de sel de plus de 10 mM peut exiger de rechange protocoles de tension électroformation. Débordement chaque joint et par environ 10%.
2. Remarque: une fois que les lipides sont hydratés, procéder rapidement à travers les étapes restantes, depuis films lipidiques commencent à se décoller immédiatement. Le rendement et la taille sont maximisés si électroformation commence rapidement.
3. Dans un mouvement lisse, appliquer une deuxième lame ITO, face conductrice dans, vers le haut de la garniture. Assurez-vous d'avoir au moins 5 mm de débord extérieur de la zone du joint et en face de la première porte à faux. Appuyez doucement pour assurer une bonne étanchéité.
4. Nettoyez les deux surplombs à l'éthanol et de vérifier que les côtés face à la garniture sont conductrices avec votre multimètre.
5. La chambre peut encore être fixée avec du parafilm ou des pinces à ressort de traction légères, si désiré.
6. Branchez la chambre de électroformation à une source de tension en obtenant des barres en aluminium ou en cuivre, "EMI gasket mousse ", ou bande conductrice adhésive aux surfaces conductrices des deux diapositives. Nous employons la mousse joint EMI. plans pour un gabarit et le collier sont illustrés à la figure 5.
7. Vérifiez qu'il n'ya pas de court-circuit électrique entre les contacts, et que les contacts se connectent correctement aux surfaces d'ITO, en utilisant le multimètre.
8. Chauffer la chambre à 10 ° C supérieure à la température de fusion le plus élevé de l'un des lipides présents, par exemple pour la DPPC, de la chaleur à 52 ° C au minimum, de 10 ° C supérieure à la température de fusion de la chaîne de 42 ° C.
9. Pour tampons faible teneur en sel, appliquer une onde sinusoïdale 10 Hz, ~ 0,7 V _RMS pour chaque millimètre écart entre les deux surfaces revêtues d'ITO, pour 60-90 min. Pour tampons élevées de sel, d'autres protocoles de tension devraient être utilisés (voir références).

5. Imagerie et dépannage

1. Image du liposome en utilisant un microscope inversé équipé d'un cube de filtre pour la rhodamine ou Texas colorants rouges. Le liposome doit être de forme sphérique,majoritairement unilamellaires à l'oeil, et exempt de défauts tels que les "cordes" pendait au liposome.
2. Si les liposomes sont trop petites, utilisez moins de lipides.
3. S'il ya beaucoup de défauts ou quelques liposomes, cela peut être dû à des lipides en phase de gel. Envisager de relever la température de électroformation.
4. Si peu ou pas de liposomes géants formées à partir de tous les petits liposomes déshydratés, de réduire la force osmotique du tampon de liposomes, ou augmenter la force osmotique du tampon de électroformation. Un appel d'un tampon dans la solution tampon interstitielle concentré peut provoquer une délamination du film lipidique déposé.
5. Si le rendement de la vésicule, la qualité ou la taille sont pauvres, et tu inclus sels ou tampons de pH dans les électroformation ou liposome tampons, envisager des protocoles de tension électroformation alternatives. Par exemple, Pott, et al. ^11, recommander un protocole en trois étapes en utilisant une onde sinusoïdale de 500 Hz, augmentant la tension de 50-1,300 Vpp / m en 30 min, maintien pendant 90 mn, l'n diminuant la fréquence de 50 Hz sur 30 à 60 min. Platinum ou titane électrodes peuvent être nécessaires dans ce cas, mais cela ne modifie pas substantiellement le protocole.

Representative Results

Dans nos exemples, nous préparons des liposomes à partir d'un mélange d'environ 55% mol POPC (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-phosphocholine), 15% mol POPS (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-phosphoserine , 30% mol de cholestérol, et de 0,1% en moles Texas Red-étiqueté 1,2-dipalmitoyl-sn-phosphoéthanolamine (TxR-DPPE). Cette composition a été choisi comme environ représentant des dorsales lipides ganglions de la racine ^18. Nous constatons que 15% molaires chargé lipides (ici POPS) est proche de la limite de ce qui peut être utilisé dans électroformation (par exemple Walde et al. ^4).

répartition des lipides par hydrolyse et la peroxydation est une question particulièrement importante pour de nombreux mélanges de lipides et de nombreuses expériences sensibles (voir la discussion). Pour plus de clarté seuls, nous n'utilisons pas atmosphères de gaz inertes dans la vidéo de présentation. Comme le montrent les chiffres ci-dessous, cela ne se répercute pas sensiblement la qualité des liposomes, mais pour des études ou sensibleslors de l'utilisation des lipides hautement insaturés, il est important de prévenir la dégradation des lipides.

Depuis l'obstacle majeur à électroformation est de former un bon film lipidique sur l'oxyde d'indium-substrat d'étain (ITO), sachant que le film lipidique devrait ressembler lorsque séché est crucial. Toutefois, lorsque électroformation échoue, elle le fait souvent complètement, résultant en un rien de notable production liposome géant. Souvent, les détritus importantes seront observées, ce qui indique généralement que trop de lipides a été utilisé. Nos chiffres montrent ce que l'on s'attend à voir en cas de succès.

La figure 2 montre deux taches différentes de liposomes ÉLECTROFORMÉ de lipides déposés sur le chloroforme. Dans le panneau de gauche, examiner de près les taches indiquées par les flèches 2 et 3. Alors que la flèche 2 indique un patch avec des liposomes mal discernables, aucun liposomes peuvent être mis au point dans la zone indiquée par la flèche 3. Ensemble, ces résultats indiquent une généralement pauvrespréparation, probablement en raison de la trop grande lipides déposés dans ce domaine. Dans le panneau de droite, ces régions «floues» sont moins fréquentes, ce qui indique une manière générale une meilleure préparation. Nous trouvons qu'il est rare d'éliminer complètement ces imperfections.

La figure 3 montre liposomes ÉLECTROFORMÉ succès de lipides déposés par déshydratation de petits liposomes, à deux grossissements, imagées par Texas Red épifluorescence. Les liposomes sont rares, mais il ya plusieurs bons spécimens. Parce que la taille varie, plusieurs sont hors foyer. Les flèches indiquent trois liposomes de qualité allant de ~ 5-20 um, dont deux qui apparaissent dans l'image de grossissement 40x. Notez le "ring" clair au bord: cela indique un liposome unilamellaire ou presque unilamellaires. Alors que certaines taches de lipides semblent avoir échoué ou n'ont jamais formé de lipides, c'est un résultat de bonne qualité.

Enfin, notre but, en développant et en publiant ce protocoleest de préparer GUVs avec chaînes intactes et fonctionnelles mammifères ion qui sont appropriés pour l'électrophysiologie patch-clamp conventionnel. Dans la figure 4, nous démontrons TRPV1 courants ioniques activés par la capsaïcine enregistrées en plaques de membranes lipidiques excisés de GUVs formées en utilisant ce protocole. Le courant peut être bloqué par le rouge de ruthénium, et n'est pas activé par le véhicule capsaïcine (éthanol de 0,1%, NaCl 138 mM, 3 mM HEPES pH 7,4) seul. La préparation des protéoliposomes pour des expériences d'électrophysiologie est bien au-delà de la portée du présent protocole, mais fait l'objet d'un article soumis.

Sel	Molalité @ 20 ° C et la saturation	% HR @ 10 ° C	% HR @ 20 ° C	% HR @ 30 ° C
Chlorure de magnésium hexahydraté	5.8	33	33 32
Dihydraté de carbonate de potassium	8.0	47	44	42
bromure de sodium	4.6	58	57	57
Chlorure de cuivre	5.6	68	68	67
Chlorure de sodium	6.13	75	75	75
Chlorure de Potassium	4,61	87	86	84

Tableau 1. Humidité relative (% RH) de plusieurs sels communs de données d'humidité relative de Greenspan ¹⁹ et ^20; Rockland. Données de saturation des International Critical Tables ^21.

Figure 1. Schéma d'électroformation liposome géant de petits liposomes. (En haut à gauche) Petits liposomes sont déposés dans un réseau de petites gouttelettes, <5 pl. (En haut au centre) Les liposomes sont déshydratés sous une humidité relative contrôlée en les plaçant dans un récipient hermétique au-dessus d'une solution saturée de sel. Un hygromètre est facultatif. (En haut à droite) Une fois déshydraté pour un film collant des lipides et (éventuellement) osmoticant tels que le sorbitol, les lipides sont réhydratés dans un tampon hyperosmotique (voir section protocole 5). (En bas à gauche) de la chambre de électroformation est scellé avec un deuxième diapositive ITO sur le dessus. (En bas à droite) Enfin, la chambre est chauffé au-dessus de la température de fusion de la chaîne lipidique, et relié à une source de signal fournissant un champ électrique oscillant à travers les deux lames d'ITO.

Figure 3. Liposomes géants électroformés formés à partir de lipides déshydratation déposé. (À gauche) à un grossissement de 10x, plusieurs liposomes sont visibles. Trois liposomes sont étiquetés. (À droite) Le même point de vue à gauche, à un grossissement de 40x, avec le mêmeliposomes (2 et 3) étiquetés. Le nombre de ces liposomes est généralement beaucoup plus faible que lors de galvanoplastie de lipides solvant déposé, mais il est tout à fait adapté à de nombreuses fins. Imagée en utilisant un microscope à épifluorescence inversé équipé d'un Chroma 41004 Texas Red filtre cube et une caméra CCD Stanford Photonics XR/MEGA-10 S30 intensifiée.

Figure 4. La capsaïcine activé TRPV1 actuel enregistré dans un patch de membrane excisée à partir d'une GUV formé en utilisant ce protocole. A. Le courant de fuite indiqué une 500 MQ sceller la résistance avant d'ajouter la capsaïcine. B. Saturating capsaïcine (> 20 uM, dans l'éthanol 0,1%) active une grandes TRPV1 actuels;. le courant est bloqué par le rouge de ruthénium, et n'est pas activé par véhicule (éthanol de 0,1% en tampon) seul (données non présentées) C. Les rendements actuelsPrès de base comme la capsaïcine est lavé sur le patch.

Figure 5. Les plans pour la chambre de électroformation. Inclus est une vue d'ensemble, montrant l'assemblage complet, et dimensionné schémas pour les pièces en plastique du haut et du bas. Utiliser l'acrylique ou autre plastique transparent facile à usiner. Le mince de chauffage à film Kapton doit être connecté au contrôleur de température (voir le tableau de réactifs et le matériel spécifiques), et la mousse joint EMI doit être reliée au générateur de fonction, de telle sorte que le signal d'onde sinusoïdale est appliquée entre les deux lames recouvertes d'ITO. Un trou est prévu pour une sonde de température. 10-32 vis à tête plate sont placées dans les trous fraisés dans la pièce inférieure, et passent à travers la pièce supérieure. 10-32 noix sont utilisées pour fixer l'ensemble. Lorsqu'il sera pleinement queassemblé, les pièces en plastique du haut et du bas doivent être alignés les uns avec les autres sur les deux côtés (les côtés parallèles à la joint EMI). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Électroformation de liposomes géants s'est développé en une technique souple compatible avec divers lipides, des préparations et des tampons. Un contrôle minutieux du processus de dépôt de lipides est plus critique pour le succès. Nous avons présenté des outils simples pour rendre dépôt contrôlé de lipides provenant de petites préparations de liposomes un processus simple. L'humidité relative est essentielle à la bonne déshydratation des liposomes initiaux, et la valeur optimale varie avec la concentration initiale de solutés dans la suspension de liposomes. Abaisser l'humidité relative est nécessaire pour déshydrater les échantillons plus concentrés à un niveau adéquat.

Le protocole d'hydratation exacte et champ électrique utilisé pour électroformation reste un point de discussion ^{1,4,7,10,11,22.} Les protocoles plus simples doivent être maîtrisées avant de tenter électroformation liposome en présence de fortes concentrations de sels, lipides chargés, ou des concentrations très élevées de fusion élevétion des lipides de la température. Une fois ces compétences sont maîtrisées, les protocoles les plus avancés se divisent généralement le processus de électroformation en trois parties: gonflement initial, la croissance et le détachement. Gonflement initial semble être favorisé en augmentant lentement le champ électrique appliqué ^11. Une deuxième étape facultative au champ fixe peut aider à contrôler la taille finale des liposomes. Enfin, la diminution de la fréquence du champ oscillant peut aider à détacher les liposomes à partir de la surface d'ITO. Des fréquences plus élevées sont nécessaires pour électroforme liposomes dans des conditions salines physiologiques ^11, mais liposomes peuvent être formés sur une très large gamme de fréquences et des amplitudes de champ ^10.

L'observation que les liposomes géants se forment spontanément lors de la réhydratation des liposomes déshydratés avec un tampon hypo-osmotique ⁷ indique plusieurs clés de la réussite. Tout d'abord, le processus de gonflement liposome commence immédiatement, de sorte que pour électroformation, certainsgroupes ont même jugé utile d'appliquer le champ électrique alternatif avant de réhydrater le film lipidique ^10. Deuxièmement, il est probable que l'écoulement du fluide entraîne le processus de gonflement liposomale, et que électroformation se produit au moins en partie à cause de l'électro-osmose flux entraîné. Ceci impose des limites à la fréquence utile et la plage d'amplitude qui peuvent être utilisées dans électroformation ^10.

Un des principaux points de discussion au cours des dernières années a été le potentiel d'hydrolyse des lipides et de la peroxydation ^23,24. Le premier moyen de défense contre la dégradation des lipides de toute nature est à éliminer l'oxygène de tous les matériaux utilisés dans la préparation GUV: depuis la peroxydation dépend de l'oxygène moléculaire ^23, ce qui devrait ralentir considérablement le processus. Une combinaison de vide et barbotage avec un gaz inerte doit être utilisé pour enlever autant d'oxygène que possible ^15-17. Sonication et léger sous vide sont inefficaces. Nous utilisons un kit de test d'oxygène (Chemetrics K7501) à vÉRIFIEZ que nous avons supprimé l'oxygène aussi complètement que possible. L'hydrolyse est plus pernicieux, mais elle est réduite par le maintien d'un pH neutre ^25, et en réduisant la tension utilisée dans électroformation ^24. Certains auteurs préconisent l'utilisation d'électrodes en titane à la place de ITO glisse ^23,24,26,27. Nous préférons éviter le risque de contamination de nos échantillons de titane (ou tout autre métal), car il a dans le passé été connus pour interférer avec les expériences de liposomes ^28,29, mais il pourrait aider à prévenir certains effets de la peroxydation ou l'hydrolyse. Il va sans dire que l'exposition prolongée à des températures élevées accélère répartition des lipides ^30. Enfin, chromatographie sur couche mince ^{24,31, 23} essais colorimétriques, et d'autres méthodes existent pour quantifier ³¹ la dégradation des lipides.

Un problème similaire concerne les colorants lipidiques fluorescents utilisés pour GUVs d'image, en particulier pour les études de séparation de phase latérale ^30,32 30,33, et utilisés à une concentration minimale.

Nous ne sommes pas au courant d'aucun consensus à savoir si les diapositives d'électrode ITO peuvent être réutilisés. De nombreux groupes font réutiliser leurs lames ITO, tandis que d'autres ne le font pas. Des travaux récents indiquent que les lames ne se dégradent avec le temps, mais peut être recuit pour regagner la haute performance ^34; cette dégradation n'a eu qu'un effet limité pour les mélanges de lipides, y compris les lipides amphotères ou anioniques, mais était critique pour les mélanges contenant des lipides cationiques. Nous réutilisons nos diapositives sans recuit.

Bien qu'il existe une grande variabilité dans les protocoles utilisés pour électroforme liposomes géants, la compréhension théorique et une expérience pratique de la technique est en constante amélioration. Déjà liposomes peuvent être formés avec de grandes quantités de lipides chargés, ou dans des tampons élevées de sel. La clé reste efficace dépôt des lipides à la surface de l'électrode, which est au cœur de notre protocole.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667