Summary
La reconstitución de proteínas de membrana funcionales en los liposomas gigantes de composición definida es un enfoque poderoso cuando se combina con la electrofisiología de patch-clamp. Sin embargo, la producción convencional de liposomas gigante puede ser incompatible con la estabilidad de la proteína. Se describen protocolos para producir liposomas gigantes de lípidos puros o pequeños liposomas que contienen canales iónicos.
Abstract
La reconstitución de los canales iónicos en las membranas de lípidos definidos químicamente para registro electrofisiológico ha sido una técnica poderosa para identificar y explorar la función de estas importantes proteínas. Sin embargo, las preparaciones clásicas, tales como bicapas planas, limitan las manipulaciones y experimentos que se pueden realizar en el canal reconstituido y su entorno de la membrana. La estructura más como una celda de liposomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionales sin sacrificar el control del medio ambiente de lípidos.
Electroformation es un medio eficiente para producir liposomas gigantes> 10 micras de diámetro que se basa en la aplicación de una tensión alterna a una, película de lípido ordenada delgada depositada sobre una superficie de electrodo. Sin embargo, ya que el protocolo clásico llama para los lípidos para ser depositados a partir de disolventes orgánicos, no es compatible con proteínas de la membrana menos robustos como canales de iones y debe ser modificado. Recientemente, protocols se han desarrollado para electroform liposomas gigantes de pequeños liposomas parcialmente deshidratadas, que hemos adaptado a los liposomas que contienen proteínas en nuestro laboratorio.
Presentamos aquí el fondo, equipo, técnicas, y las trampas de electroformation de liposomas gigantes de pequeñas dispersiones de liposomas. Comenzamos con el protocolo clásico, que debe ser dominado primero antes de intentar los protocolos más desafiantes que siguen. Se demuestra el proceso de deshidratación parcial controlada de pequeños liposomas usando equilibrio vapor con soluciones saturadas de sal. Por último, demostrar el propio proceso de electroformation. Vamos a describir un equipo simple, de bajo costo que se puede hacer en casa para producir liposomas de alta calidad, y describir la inspección visual de la preparación en cada etapa para garantizar los mejores resultados.
Introduction
Liposomas gigantes (a menudo llamado vesículas unilamelares gigantes, o Guvs) principalmente se han utilizado para estudiar la física y la química física de bicapas de lípidos, incluyendo los estudios de deformación bicapa, la coexistencia fase lateral ("balsas"), la fusión de membranas, etc 1-4. Tienen una estructura groseramente similar a la célula: cáscara esférica de la membrana que rodea un interior acuoso que puede ser fácilmente hecho diferente que el tampón acuoso circundante. Ellos son, por definición, ≈ 1-100 micras de diámetro, por lo que se pueden obtener imágenes usando una variedad de enfoques de microscopía de luz. Pueden ser hechos tensa el uso de gradientes osmóticos o tensión aplicada mecánicamente, de modo que mientras que generalmente suave, sus propiedades pueden ser manipuladas para un fácil manejo. En particular, el control de la "rigidez" del liposoma hace que sea fácil para formar parches "liposomas adjuntos" o extirpado para electrofisiología. En el pasado, la reconstitución canal de iones se llevó a cabo en gran medida en los lípidos plana bilayers. Ahora, la capacidad para formar parches de liposomas gigantes y utilizar la considerable carcaj de herramientas desarrolladas para electrofisiología convencional (microscopía de fluorescencia, micropipeta de aspiración, la perfusión rápida y control de la temperatura, etc) hace que los liposomas gigantes cada vez más atractivo para los estudios de reconstitución de 5,6.
Liposomas gigantes han hecho muchas estrategias. De hecho, los liposomas gigantes se forman espontáneamente por un proceso de hinchamiento cuando una película de lípido seca se rehidrata 4,7,8. El deseo de preparar más rápidamente más grande, liposomas más uniformes llevó a los investigadores a otros enfoques, entre los que electroformation 1,9. Electroformation también se basa en la hidratación de una película lipídica seca, pero acelera el proceso a través de la aplicación de un campo eléctrico oscilante a través de la película de lípido. El campo se aplica a través de dos electrodos, ya sea en alambres de platino o de indio-estaño-óxido (ITO) portaobjetos de vidrio recubiertos, separados por el agua otampón y en la que los lípidos se depositan. Al acelerar la hinchazón de los liposomas, se logra un mayor rendimiento de los liposomas más grandes. Por lo tanto, electroformation ha convertido en el método por defecto para producir liposomas gigantes 4.
El mecanismo de electroformation no se entiende completamente, y la mayoría de los protocolos se han desarrollado empíricamente (por ejemplo, 10,11). Sin embargo, podemos aprender un poco acerca de lo que puede esperar teniendo en cuenta la teoría y algunos resultados empíricos. La opinión generalizada es que electroformation se produce por la conducción del flujo electro-osmótico de amortiguación entre las bicapas lipídicas individuales apiladas en la película de lípidos depositados 10,11. Acoplamiento electrostático a las fluctuaciones térmicas de la bicapa lipídica es probable que también involucró 12. Estas hipótesis cualitativamente predicen los límites superiores de la frecuencia del campo eléctrico y la fuerza que se puede utilizar 10,12. En particular, se prevé que las soluciones de alta conductividad (
Sin embargo, proteínas de la membrana es probable que sean incompatibles con el método habitual de depósito de lípidos en electrodos para el procedimiento electroswelling, a saber, en disolventes orgánicos que luego se evapora para dejar una película delgada de lípido. Hay dos rutas principales en torno a esta dificultad: para incorporar proteínas después de la formación de liposomas gigantes, o adaptar la forma en se depositan los lípidos. Nuestro enfoque se basa en otros 5,11 para depositar los lípidos y reconstitucióntuido proteína de membrana, junto a una suspensión de pequeñas o grandes "proteoliposomas". Se describe el largo y más difícil proceso de producción de proteoliposomas de proteínas y lípidos purificados en otro lugar (Collins y Gordon, en revisión). A continuación se describe el protocolo en ausencia de cualquier proteína, pero es lo mismo cuando se incorpora proteínas; incluimos los resultados muestran que proteoliposomas contienen el canal iónico TRPV1 se pueden transformar en GUVs y utilizados para patch-clamp electrofisiología. En cualquier enfoque electroformation, la inspección visual de la muestra de lípidos durante el proceso de deposición de lípidos es crítica para el éxito.
Nuestro enfoque puede ser relevante más allá de la aplicación especializada para la reconstitución canal de iones. En el tiempo desde que nos desarrollamos este protocolo y, ahora, también se ha demostrado que la forma en que los lípidos se depositan en los electrodos de electroformation afecta a la heterogeneidad de composición de los GUVs resultantes. Baykal-Caglar et. al 14 mostraron que GUVs cuidadosamente formados a partir de liposomas deshidratados tenían un 2,5 veces menor variación en la temperatura de transición miscibilidad de GUVs formados a partir de mezclas de diferentes fosfolípidos y colesterol. Su trabajo indica que los lípidos, y especialmente el colesterol, puede precipitar de la mezcla de lípidos cuando se depositan a partir de disolventes orgánicos, lo que resulta en una variación espacial en la composición de la película de lípido depositada. Esto es especialmente importante para los estudios de comportamiento de fase de lípidos de membrana, pero también puede ser crítico para experimentos cuantitativos en función del canal iónico. Protocolo Baykal-Caglar et al. 'S es similar pero no idéntica a la nuestra, y se anima a los lectores a estudiar también.
Este protocolo (véase el resumen, la Figura 1) es uno de los muchos que se podría utilizar. En principio electroformation éxito depende de la mezcla de lípidos, la hidratación, la temperatura, otros solutos (especialmente iones), y dePor supuesto, el voltaje y la frecuencia utilizada en la formación. Como electroformation se entiende mejor, esperamos refinar nuestro protocolo más.
Por último, a menudo hay una pronunciada curva de aprendizaje en galvanoplastia liposomas gigantes. Sugerimos dominar el protocolo convencional (secciones 1 y 4, y de ser necesario, la Sección 5) antes de aprender a depositar los lípidos a partir de suspensiones de liposomas (Secciones 2-5).
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Protocol
1. La deposición de lípidos a partir de disolventes orgánicos: Protocolo Clásica
- Eliminar los lípidos de almacenamiento a -20 ° C o -80 ° C; se calentó a TA Precaución:. Lípidos son extremadamente higroscópicos, y muchos son sensibles al oxígeno. Cubra lípidos en argón seco o nitrógeno gaseoso y en todos los pasos minimizar la exposición al aire.
- Si es necesario, suspender los lípidos en cloroformo o ciclohexano en mg / ml 1-10, tenga en cuenta que las concentraciones indicadas del fabricante suelen nominal sólo PRECAUCIÓN: Use guantes y otros equipos de protección personal cuando se utilizan disolventes orgánicos.. Retire el PPE rápidamente si solvente se derramó sobre ellos, como la mayoría de los materiales están siendo permeable a estos disolventes y sólo proporcionan una protección temporal.
- Limpie ambos lados de dos x 25 mm ITO portaobjetos de vidrio recubiertas con 37,5 etanol
- Mezclar los lípidos para conseguir las proporciones molares deseadas. Por cada 1 cm 2 de área de ITO se desliza a recubrir con el labioid, mix ~ 15-20 g de lípidos. Por ejemplo, si ambos diapositivas 25 x 37,5 mm iban a ser totalmente revestido, que se utilizaría normalmente 30 l de 10 mg / ml de mezcla de lípidos Nota:. Añadir 0,1% en moles Rojo Texas-DPPE para formación de imágenes fluorescentes, y ver a continuación para precauciones acerca colorantes fluorescentes.
- Verifique que el lado recubierto ITO de las placas de vidrio se enfrenta por la medición de la resistencia de la superficie con un polímetro o multímetro.
- Aspirar los lípidos en un resistente a los disolventes jeringa Precaución:. No hay colas o plástico, excepto PTFE, debe ponerse en contacto con el disolvente orgánico.
- Con la aguja de la jeringa sin llegar a tocar la superficie de ITO, aplicar lentamente el lípido mover la aguja hacia atrás y adelante a través de la corredera. Cubra la superficie de la forma más uniforme, en busca de un "arco iris brillo" en la superficie del vidrio.
- Coloque las diapositivas rápidamente bajo <1 Torr (1 mm Hg) de vacío durante 0,5-1 horas para eliminar cualquier traza de disolvente. Suelte vacío con gas inerte.
- Aplique una junta de silicona, con uncapa fina de grasa de vacío de silicona en ambos lados. Deje al menos 5 mm de diapositivas descubierta expuesta en un extremo de la corredera.
- Siga en la sección 4.
2. Preparación de liposomas pequeños para la deshidratación controlada
- Preparar la mezcla de lípidos que en los pasos 1.1 a 1.4.
- Secar los lípidos usando una corriente de gas argón o nitrógeno en un tubo de cultivo de 10-15 mm de diámetro. Para pequeñas cantidades de lípidos, ≤ 0,5 mg, la película resultante puede ser hidratado directamente después de colocarla bajo vacío durante 0,5-1 horas para eliminar el disolvente residual; continúe en el paso 2.5. Grandes cantidades de lípidos tienden a atrapar disolventes orgánicos en un gel espeso, incluso bajo vacío, y están mejor preparados por liofilización; consulte los pasos 2.3-4.
- Suspender la película lipídica seca en ciclohexano, cubierta con argón y sellado con un tapón, colocar el tubo en un bloque frío y se congelan a -80 ° C durante 1 hora mínimo.
- Coloque el bloque frío y la muestra de lípidos en un sistema de vacíocapaz de alcanzar los 100 mTorr. Aplicar un vacío, sino que va a "pararse" en alrededor de 1 Torr tan sublimes solventes libres. Una vez disolvente se elimina por completo (aproximadamente 1 hora) de vacío caerá por debajo de este nivel. Liberar el vacío con gas inerte y sellar el tubo o hidrato inmediatamente.
- Mientras que los lípidos están bajo vacío, tampón de hidratación degas usando vacío y rociado 15-17.
- Hidratar los lípidos usando tampón desgasificado a una concentración final de 1-10 mg / ml. Permitir que los lípidos para hidratar lentamente. Después de 30 min-1 hora, remolino para romper los grumos que quedan. Espere un 0,5-1 horas más para permitir la hidratación completa. Utilice un osmoticant, tal como sorbitol o sacarosa hasta 200 mM, para prevenir la deshidratación completa en los pasos siguientes.
- Prepare liposomas 100-200 nm de diámetro por extrusión. Ver protocolo de extrusión del fabricante para obtener más información. Tenga en cuenta que el buffer debe tener menos de ~ 25 mM fuerza iónica, o protocolos de voltaje electroformation especiales serán necesarias en la Sección 4.
3.La deposición de lípidos por deshidratación controlada de liposomas pequeños
- Precaución: Nuestro protocolo requiere lípidos para ser colocados en equilibrio vapor con soluciones salinas saturadas para muchas horas. Recomendamos realizar el protocolo en una atmósfera de gas inerte, con una caja de guantes o recinto similar.
- Precaución: Si la preparación de muestras que contienen proteínas, evitar la deshidratación completa. Hidratar la atmósfera en un lugar cerrado con un vaso de agua tibia, o un humidificador basado en ultrasonidos. Utilice un higrómetro para asegurarse de que existe al menos 30% de humedad relativa. Usa sorbitol o sacarosa en el pequeño tampón de liposoma como una precaución adicional para prevenir la deshidratación total.
- Preparar una solución de sal saturada de humedad relativa apropiada. Humedad del objetivo depende de la osmolaridad de la preparación de vesículas. Para las preparaciones con osmolaridad fisiológica, utilice el 30-45% de humedad relativa, mientras que las preparaciones de vesículas de baja osmolaridad pueden ser adecuadamente deshidratados enequilibrio con 75-90% de humedad relativa (Véase también la Tabla 1).
- Ponga la solución saturada de sal y el exceso de sal en un recipiente herméticamente sellable con un estante interior. Contenedores de alimentos comerciales para yogurt y granola funcionan muy bien. Vuelva a colocar el estante después del llenado, y asegúrese de que el fluido es de 5-10 mm por debajo de la plataforma.
- Limpie portaobjetos recubiertos de ITO como en la Sección 1. Utilice el multímetro para determinar cuál es el lado conductor, y etiquetar el lado no conductor con el nombre de la muestra.
- Engrase ligeramente ambos lados de la (grado USP VI) junta de silicona (s) con uno o múltiples agujeros.
- Coloque el lado conductor desliza en el banco, y aplicar la junta de silicona (s) a cada diapositiva a la que se aplicará lípidos, asegurándose de que hay por lo menos 5 mm de diapositiva expuesta en un extremo a conectar al aparato electroformation. Alise la junta para asegurar un buen sellado.
- Se diluye la preparación de vesículas en un tampón isotónico bajo contenido de sal a ~ 1-2 mg / ml. Nos parece que el aumento de concentrciones producen resultados pobres.
- Aplique grasa a la diapositiva en gotas l 1-10. Las gotas más pequeñas generalmente producen mejores resultados.
- Posicionar el cursor en la plataforma interior por encima de la solución saturada de sal y sellar el recipiente herméticamente. Dejar a temperatura ambiente durante 3 horas a O / N. El recipiente se puede colocar a 4 ° C, pero tenga en cuenta que para algunas sales, la humedad relativa depende fuertemente de la temperatura, y que el frío aumentará el tiempo de equilibración.
- La película resultante puede tener un arco iris ligero brillo a él, pero en cualquier caso debe aparecer casi desecado. Soluciones de partida muy osmóticos pueden ser imposibles de secar completamente a una película de lípidos, lo que no afectará negativamente a los resultados.
4. Electroformation de liposomas gigantes
- Películas de lípidos, especialmente los formados a partir de liposomas deshidratados, se desencajan fácilmente. Cuidadosamente hidrato de cada pocillo mediante la colocación de un G aguja de la jeringa 27 en el borde de la junta y aplicar lentamente tampón. Buffers puedeincluyen agua, ≤ 200 mM de sacarosa, ≤ 1 M sorbitol y ≤ 5 mM HEPES. Solución de sal de más de 10 mm puede requerir protocolos de voltaje electroformation alternos. Sobrellenado de cada junta y de ~ 10%.
- Nota: una vez que los lípidos se hidratan, proceder rápidamente a través de los pasos restantes, ya que las películas de lípidos comienzan a exfoliar inmediatamente. Rendimiento y tamaño se maximizan si electroformation comienza puntualmente.
- En un movimiento suave, aplique una segunda diapositiva, cara conductora ITO en, en la parte superior de la junta. Asegúrese de tener al menos 5 mm de voladizo fuera del área de empaque y frente a la primera proyección. Presione suavemente para asegurar un buen sellado.
- Limpie los dos voladizos utilizan etanol y verificar que los lados que se enfrenta la junta son conductores con su multímetro.
- La cámara se puede asegurar aún más con parafilm o ligeras pinzas de resorte de tensión si se desea.
- Conectar la cámara de electroformation a una fuente de tensión, asegurando de aluminio o de cobre bares, "EMI Gasket espuma ", o cinta conductora-adhesivo a las superficies conductoras de las dos correderas. Utilizamos espuma junta EMI. Planes para una plantilla y la abrazadera se muestran en la Figura 5.
- Compruebe que no hay cortocircuito eléctrico entre los contactos, y que los contactos se conectan adecuadamente a las superficies de ITO, usando el multímetro.
- Se calienta la cámara de 10 ° C por encima de la temperatura de fusión más alta de cualquiera de los lípidos presentes, por ejemplo, para DPPC, calentar a 52 ° C, como mínimo, 10 ° C por encima de la temperatura de fusión de cadena de 42 ° C.
- Para amortiguadores bajos en sal, aplique una onda sinusoidal 10 Hz, ~ 0.7 V rms para cada hueco milímetros entre las dos superficies revestidas de ITO, de 60 a 90 min. Para buffers de sal, otros protocolos de tensión se deben utilizar (ver referencias).
5. Imágenes y solución de problemas
- Imagen del liposoma utilizando un microscopio invertido equipado con un cubo filtro para rodamina o colorantes rojos de Texas. El liposoma debe ser esférica,predominantemente unilamelar por ojo, y libre de defectos tales como "cuerdas" que cuelgan del liposoma.
- Si los liposomas son demasiado pequeños, utilizar menos lípidos.
- Si hay muchos defectos o unos liposomas, esto puede ser debido a los lípidos de gel-fase. Considere la posibilidad de elevar la temperatura electroformation.
- Si pocos o ningún liposomas gigantes formaron en absoluto de pequeños liposomas deshidratados, reducir la fuerza osmótica de la memoria intermedia de liposoma, o aumentar la fuerza osmótica de la memoria intermedia de electroformation. Una corriente de entrada de tampón en la solución tampón intersticial concentrada puede provocar la deslaminación de la película de lípido depositada.
- Si el rendimiento de la vesícula, la calidad o el tamaño son pobres, y que incluyen sales o tampones de pH en los electroformation o liposoma buffers, tenga en cuenta los protocolos de voltaje electroformation alternativas. Por ejemplo, Pott, et al. 11, recomendar un protocolo de tres etapas utilizando una onda sinusoidal de 500 Hz, el aumento de la tensión de 50-1,300 Vpp / m durante 30 minutos, manteniendo durante 90 min, lan la disminución de la frecuencia de 50 Hz en 30-60 min. Platino o titanio electrodos pueden ser necesarios en este caso, pero esto no alterarán sustancialmente el protocolo.
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Representative Results
En nuestros ejemplos, preparamos liposomas a partir de una mezcla de aproximadamente 55% en moles de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% en moles POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfoserina , 30 moles% de colesterol, y 0,1% en moles marcados con Rojo Texas 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composición fue elegido como representante de aproximadamente el ganglio de la raíz dorsal lípidos 18. Observamos que 15% en moles cargada lípidos (aquí POPS) está cerca del límite de lo que puede ser utilizado en electroformation (por ejemplo Walde et al. 4).
Lípidos desglose por hidrólisis y la peroxidación es un tema especialmente importante para muchas mezclas de lípidos y muchos experimentos sensibles (ver Discusión). Para mayor claridad, solo, no utilizamos atmósferas de gas inerte en el vídeo de presentación. Como es evidente a partir de las figuras siguientes, este no afecta notablemente la calidad de los liposomas, pero para los estudios o sensiblescuando se utilizan lípidos altamente insaturados es importante para evitar la degradación de lípidos.
Dado que el principal obstáculo en electroformation es formar una buena película de lípidos en el sustrato de óxido de estaño e indio (ITO), a sabiendas de lo que la película de lípidos debe ser similar a cuando se seca es crucial. Sin embargo, cuando no electroformation, con frecuencia lo hace por completo, lo que no hay apreciable producción de liposomas gigante. Con frecuencia, se observan restos sustanciales, lo que suele indicar que el exceso de grasa se ha utilizado. Nuestras cifras muestran lo que uno espera ver en el éxito.
La Figura 2 muestra dos parches diferentes de liposomas electroformadas a partir de lípidos depositados a cabo de cloroformo. En el panel izquierdo, examinar de cerca los parches indicadas por las flechas 2 y 3. Mientras flecha 2 indica un parche con liposomas mal distinguibles, sin liposomas pueden ser enfocados en el área indicada por la flecha 3. En conjunto, estos resultados indican un generalmente pobrepreparación, probablemente debido a que hay demasiada grasa depositada en esta zona. En el panel derecho, esas regiones "borrosa" son menos comunes, lo que indica en general una mejor preparación. Nos parece que es raro para eliminar por completo esas imperfecciones.
La Figura 3 muestra liposomas electroformadas con éxito a partir de lípidos depositados por deshidratación de liposomas pequeños, a los dos aumentos, utilizando imágenes de Texas Red epifluorescencia. Los liposomas son escasos, pero hay varios buenos ejemplares. Porque el tamaño varía, varios están fuera de foco. Las flechas indican tres liposomas buena calidad que van desde ~ 5.20 m, dos de los cuales aparecen en la imagen 40 aumentos. Tenga en cuenta el "ring" claro en el borde: indica un liposoma unilamelar o casi unilamelar. Mientras que algunas manchas de lípidos parecen haber colapsado o nunca formada de lípidos, esto es un resultado de buena calidad.
Por último, nuestro propósito en la elaboración y publicación de este protocoloes preparar GUVs, con canales iónicos funcionales intactas de mamíferos que son adecuados para electrofisiología convencional de patch-clamp. En la Figura 4 se demuestra TRPV1 corrientes iónicas capsaicina activados registrados en parches de lípidos de membrana extirpados de GUVs formados usando este protocolo. La corriente puede ser bloqueada por rojo de rutenio, y no es activado por la capsaicina vehículo (etanol al 0,1%, 138 mM de NaCl, 3 mM de HEPES pH 7,4) solo. La preparación de los proteoliposomas para experimentos de electrofisiología es mucho más allá del alcance de la presente protocolo, sino que es el objeto de un artículo presentado.
| Sal | La molalidad @ 20 ° C y la saturación | % RH @ 10 ° C | % HR @ 20 ° C | % RH @ 30 ° C |
| Cloruro de magnesio hexahidrato | 5.8 | 33 | 33 32 | |
| Dihidrato de carbonato de potasio | 8.0 | 47 | 44 | 42 |
| Bromuro de sodio | 4.6 | 58 | 57 | 57 |
| Cloruro cúprico | 5.6 | 68 | 68 | 67 |
| Cloruro de Sodio | 6.13 | 75 | 75 | 75 |
| Cloruro de Potasio | 4.61 | 87 | 86 | 84 |
Tabla 1. Humedad relativa (% HR) de varias sales comunes datos de humedad relativa de Greenspan, 19 y 20; Rockland. Datos de saturación de los International Critical Tables 21.
Figura 1. Esquema de electroformation liposomas gigantes de pequeños liposomas (parte superior izquierda) liposomas pequeños son depositados en una serie de pequeñas gotas., <5 l. (Centro superior) Los liposomas son deshidratados en condiciones de humedad relativa controlada, colocándolos en un recipiente sellado por encima de una solución saturada de sal. Un higrómetro es opcional. (Arriba a la derecha) Una vez deshidratado a una película pegajosa de lípidos y (posiblemente) osmoticant tales como sorbitol, los lípidos se rehidrata en un tampón hiperosmótico (véase la sección 5 del protocolo). (Inferior izquierda) de la cámara de electroformation se sella con una segunda corredera de ITO en la parte superior. (Inferior derecha) Finalmente, la cámara se calienta por encima de la temperatura de fusión de la cadena lipídica, y conectado a una fuente de señal que proporciona un campo eléctrico oscilante a través de las dos correderas de ITO.
Figura 3. Liposomas gigantes electroformada formados por deshidratación-depositados lípidos. (Izquierda) en un aumento de 10x, varios liposomas son visibles. Tres liposomas están etiquetados. (Derecha) La misma vista que en la izquierda, con un aumento de 40x, con la mismaliposomas (2 y 3) etiquetados. El número de estos liposomas es típicamente mucho menor que cuando electroformación de disolvente lipídico-depositado, pero es completamente adecuado para muchos propósitos. Imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con un Chroma 41004 Texas Red filtro de cubo y cámara Stanford Fotónica XR/MEGA-10 S30 CCD intensificada. 
La Figura 4. La capsaicina activado TRPV1 actual registrada en un parche de membrana extirpados de un GUV forma usando este protocolo. A. La corriente de fuga indicó un 500 mW sellar la resistencia antes de añadir la capsaicina. B. saturar la capsaicina (> 20 mM en etanol al 0,1%) activa un grandes TRPV1 actuales;. la corriente es bloqueada por rojo de rutenio, y no se activa en vehículo (etanol al 0,1% en tampón) por sí sola (datos no mostrados) C. Los rendimientos actualesa cerca de línea de base como la capsaicina se lava del parche. 
Figura 5. Los planes para la cámara electroformation. Incluido es una vista general, que muestra el conjunto completo, y dimensionada esquemas para las piezas de plástico superior e inferior. Utilizar acrílico u otro plástico claro fácilmente mecanizada. El calentador de película delgada Kapton debe estar conectada al controlador de temperatura (véase la Tabla de reactivos y equipos específicos), y la espuma junta EMI debe estar conectado al generador de función, de modo que la señal de onda sinusoidal se aplica a través de los dos portaobjetos recubiertos de ITO. Un agujero se proporciona una sonda de temperatura. Tornillos de cabeza plana de 10-32 se colocan en los agujeros avellanados en la pieza inferior, y pasan a través de la pieza superior. 10-32 frutos secos se utilizan para fijar el conjunto. Cuando está completamente comoensamblada, las piezas de plástico superior e inferior deben estar alineados entre sí en dos partes (los lados paralelos a la junta EMI.) Haga clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
Electroformation de liposomas gigantes se ha convertido en una técnica flexible, compatible con diversos lípidos, preparaciones y tampones. El control cuidadoso del proceso de deposición de lípidos es más crítico para el éxito. Hemos presentado herramientas simples para hacer deposición controlada de los lípidos de las pequeñas preparaciones de liposomas un proceso sencillo. La humedad relativa es crítica a la deshidratación adecuada de los liposomas iniciales, y el valor óptimo variará con la concentración inicial de solutos en la suspensión de liposomas. Se requiere una humedad relativa inferior a deshidratar las muestras más concentradas a un nivel adecuado.
El protocolo de hidratación exacta y el campo eléctrico se utiliza para electroformation sigue siendo un punto de discusión 1,4,7,10,11,22. Los protocolos más simples deben ser dominadas primero antes de intentar electroformation liposomas en presencia de altas concentraciones de sal, lípidos cargados, o concentraciones muy altas de alto punto de fusiónción lípidos de temperatura. Una vez que estas habilidades se dominan, los protocolos más avanzados normalmente dividen el proceso electroformation en tres partes: hinchazón inicial, el crecimiento y el desapego. Hinchazón inicial parece estar favorecida por el aumento lentamente el campo eléctrico aplicado 11. Una segunda etapa, opcional en la intensidad de campo fija puede ayudar a controlar el tamaño final de los liposomas. Por último, la disminución de la frecuencia del campo oscilante puede ayudar a separar los liposomas de la superficie de ITO. Las frecuencias más altas son necesarias para Electroform liposomas en condiciones fisiológicas de sal 11, pero liposomas se pueden formar a través de una gama extremadamente amplia de frecuencias y amplitudes de campo 10.
La observación de que los liposomas gigantes se forman de manera espontánea después de la rehidratación de liposomas deshidratados con un tampón hipo-osmótica 7 indica varias claves para el éxito. En primer lugar, el proceso de hinchamiento liposoma comienza inmediatamente, de modo que para electroformation, algunosgrupos han encontrado que es útil aplicar el campo eléctrico de CA antes de rehidratar la película lipídica 10. En segundo lugar, es probable que el flujo de fluido conduce el proceso de hinchamiento liposomal, y que electroformation se produce al menos en parte debido a la electro-osmóticamente flujo impulsado. Esto limita la frecuencia útil y rango de amplitud que se puede utilizar en electroformation 10.
Un punto importante de discusión en los últimos años ha sido el potencial de hidrólisis de lípidos y la peroxidación 23,24. La primera defensa contra la degradación de lípidos de cualquier tipo es para eliminar el oxígeno de todos los materiales utilizados en la preparación GUV: desde la peroxidación depende de oxígeno molecular 23, esto debe retrasar el proceso considerablemente. Una combinación de vacío y burbujeo con gas inerte debe ser utilizado para eliminar la mayor cantidad de oxígeno como sea posible 15-17. Sonicación y el vacío la luz son ineficaces. Se utiliza un kit de prueba de oxígeno (Chemetrics K7501) para verificar que hemos eliminado el oxígeno tan a fondo como sea posible. La hidrólisis es más pernicioso, pero se reduce mediante el mantenimiento de un pH neutro 25, y mediante la reducción de la tensión utilizada en electroformation 24. Algunos autores recomiendan el uso de electrodos de titanio en lugar de ITO desliza 23,24,26,27. Preferimos evitar la posibilidad de contaminación de las muestras con el titanio (o metal), ya que en el pasado ha sido conocido por interferir con los experimentos de liposomas 28,29, pero podría ayudar a prevenir algunos de peroxidación o hidrólisis efectos. No hace falta decir que la exposición prolongada a altas temperaturas acelera la degradación de lípidos 30. Finalmente, la cromatografía en capa fina 24,31, ensayos colorimétricos 23, y otros métodos 31 existen para cuantificar la degradación de lípidos.
Un problema similar se relaciona con los tintes fluorescentes lípidos utilizados para GUVs imagen, especialmente para los estudios de la fase de separación lateral 30,32 30,33, y se utilizan en una concentración mínima.
No tenemos conocimiento de ningún consenso sobre si las diapositivas electrodo ITO pueden ser reutilizados. Muchos grupos hacen volver a utilizar sus diapositivas ITO, mientras que otros no. Un trabajo reciente indica que las diapositivas hacen degradan con el tiempo, pero puede ser recocido para recuperar de alto rendimiento 34; esta degradación tenía sólo un pequeño efecto para las mezclas de lípidos, incluyendo lípidos de ion híbrido o aniónicos, pero era crítico para las mezclas que contienen lípidos catiónicos. Nos reutilizamos nuestras diapositivas sin recocido.
Aunque existe una gran variabilidad en los protocolos utilizados para electroform liposomas gigantes, la comprensión teórica y la experiencia práctica con la técnica está mejorando constantemente. Ya liposomas se pueden formar con grandes cantidades de lípidos cargados o en tampones de sal. La clave sigue siendo la deposición eficiente de los lípidos en la superficie del electrodo, which es el núcleo de nuestro protocolo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Damos las gracias a Bryan Venema y Eric Martinson para construir el aparato electroformation. Este trabajo fue financiado por becas de los Institutos Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (R01GM100718 a SEG) y el Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01EY017564 a SEG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
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