Summary
Reconstituindo as proteínas da membrana funcionais em lipossomas gigantes de composição definida é uma abordagem poderosa quando combinado com eletrofisiologia patch-clamp. No entanto, a produção de lipossomas gigante convencional pode ser incompatível com a estabilidade da proteína. Descrevemos protocolos para a produção de lipossomas gigantes de lípidos puros ou de pequenos lipossomas contendo canais de iões.
Abstract
A reconstituição de canais de iões em membranas de lípidos quimicamente definidos para a gravação electrofisiológico tem sido uma técnica poderosa para identificar e explorar a função destas proteínas importantes. No entanto, as preparações clássicas, tais como bicamadas planares, limitar as manipulações e experiências que podem ser realizadas sobre o canal reconstituída e seu ambiente de membrana. A estrutura mais células como de lipossomas gigantes permite experimentos de patch-clamp tradicionais, sem sacrificar o controle do ambiente lipídico.
Eletropolimerização é um meio eficiente para a produção de lipossomas gigantes> 10 m de diâmetro, que se baseia na aplicação de tensão alternada a um filme lipídico fina, ordenado depositado sobre uma superfície do eletrodo. No entanto, uma vez que o protocolo clássico chama para os lipidos a ser depositados a partir de solventes orgânicos, que não é compatível com as proteínas de membrana menos robustas como canais iónicos e devem ser modificadas. Recentemente, protocols têm sido desenvolvidos para electroform lipossomas gigantes parcialmente desidratadas de lipossomas pequenos, que se adaptaram aos lipossomas contendo proteína no nosso laboratório.
Apresentamos aqui a fundo, equipamentos, técnicas e armadilhas da eletropolimerização de lipossomas gigantes de pequenas dispersões de lipossomas. Começamos com o protocolo clássico, que deve ser dominado antes de tentar os protocolos mais difíceis que se seguem. Demonstramos o processo de desidratação parcial controlada de pequenos lipossomas utilizando o equilíbrio do vapor com as soluções salinas saturadas. Finalmente, demonstramos o próprio processo de eletroformação. Iremos descrever equipamentos, simples e barato, que pode ser feita em casa para produzir lipossomas de alta qualidade, e descrevem a inspecção visual da preparação, em cada fase para assegurar os melhores resultados.
Introduction
Lipossomas gigantes (muitas vezes chamado de vesículas unilamelares gigantes, ou GUVs) foram principalmente usados para estudar a física ea química física de bicamadas lipídicas, incluindo estudos de deformação bicamada, a convivência fase lateral ("jangadas"), a fusão da membrana, etc 1-4. Eles têm uma estrutura de célula grosseira, como: concha esférica de membrana que envolve um interior aquoso, que pode ser feita facilmente diferente do tampão aquoso circundante. Eles são, por definição, ≈ 1-100 um de diâmetro, de forma que possam ser visualizados utilizando uma variedade de abordagens de microscopia de luz. Elas podem ser feitas usando tenso gradientes osmóticos ou tensão aplicadas mecanicamente, de modo que, embora geralmente macia, as suas propriedades podem ser manipuladas para um manuseamento fácil. Em particular, controlando a "dureza" do lipossoma torna mais simples para formar manchas "lipossoma inscritos" ou excisada para electrofisiologia. No passado, a reconstituição do canal iónico foi amplamente praticada em planar lípido bilayers. Agora, a capacidade para formar manchas de lipossomas gigantes e usar o tremor considerável de ferramentas desenvolvidas para electrofisiologia convencional (microscopia de fluorescência, micropipeta aspiração, perfusão rápida e controlo de temperatura, etc), faz com que os lipossomas gigantes cada vez mais atraente para os estudos de reconstituição 5,6.
Lipossomas gigantes tenham sido feitas por muitas estratégias. Na verdade, os lipossomas formam-se espontaneamente gigantes por um processo de inchamento quando um filme de lípido seco é reidratado 4,7,8. O desejo de preparar mais rapidamente maior, lipossomas mais uniformes levou os pesquisadores a outras abordagens, o principal deles eletropolimerização 1,9. Eletroformação também depende da hidratação de uma película de lípido seca, mas acelera o processo através da aplicação de um campo eléctrico oscilante do outro lado da película de lípido. O campo é aplicada através de dois eletrodos, tanto fios de platina ou de índio-estanho-Oxide (ITO) lâminas de vidro revestidas, separados por água outamponar e sobre o qual são depositados os lípidos. Ao acelerar o inchaço dos lipossomas, se consegue um maior rendimento de lipossomas maiores. Assim, eletropolimerização tornou-se o método padrão para a produção de lipossomas gigantes 4.
O mecanismo de eletropolimerização não é totalmente compreendida, e a maioria dos protocolos são desenvolvidos empiricamente (por exemplo, 10,11). No entanto, podemos aprender um pouco sobre o que esperar, considerando a teoria e alguns resultados empíricos. Acredita-se que eletropolimerização ocorre por condução fluxo eletro-osmótico de tampão entre bicamadas lipídicas individuais empilhados no filme lipídico depositado 10,11. Acoplamento electrostático a flutuações térmicas das bicamadas lipídicas é também provavelmente envolvidos 12. Estas hipóteses qualitativamente prever os limites superiores para a frequência e a força do campo eléctrico que pode ser usado 10,12. Em particular, prevê-se que as soluções de elevada condutividade (
No entanto, as proteínas de membrana são susceptíveis de ser incompatível com o método usual de lípidos para depositar eléctrodos electroswelling para o procedimento, isto é, em solventes orgânicos, os quais são, em seguida, evapora-se para deixar uma fina película de lípido. Existem dois caminhos principais contornar esta dificuldade: a incorporar proteínas após a formação de lipossomas gigante, ou para adaptar a forma como os lípidos sejam depositados. Nossa abordagem baseia-se em outros 5,11 para depositar os lipídios e reconstituiçãotuído proteína de membrana juntos a partir de uma suspensão de pequenas ou grandes "proteolipossomos". Nós descrevemos o processo demorado e mais difícil de produzir proteolipossomos de proteína e lipídios purificada em outro lugar (Collins e Gordon, em revisão). Aqui descrevemos o protocolo, na ausência de qualquer proteína, mas é o mesmo quando a proteína é incorporada, que incluem os resultados que mostram que proteolipossomas contendo o canal de TRPV1 de iões pode ser transformado em GUVs e usado para de patch-clamp electrofisiologia. Em qualquer abordagem eletropolimerização, a inspeção visual da amostra de lipídios durante o processo de deposição de lipídios é fundamental para o sucesso.
Nossa abordagem pode ser relevante para além da aplicação especializada para canal de reconstituição de íons. No momento, uma vez que este protocolo desenvolvido pela primeira vez e, agora, tem sido também demonstrado como a maneira em que os lípidos são depositadas sobre os eléctrodos para eletroformação afecta a heterogeneidade da composição dos GUVs resultantes. Baykai-Caglar et al. mostrou que 14 GUVs formados a partir de lipossomas cuidadosamente desidratados apresentou uma menor variação de 2,5 vezes na temperatura de transição de miscibilidade GUVs formados a partir de misturas de diferentes fosfolipidos e colesterol. O trabalho indica que os lípidos, e especialmente o colesterol, pode precipitar a partir da mistura de lípidos, quando depositados a partir de solventes orgânicos, o que resulta em grande variação espacial da composição do filme de lípidos depositado. Isto é especialmente importante para os estudos de comportamento de fase da membrana lipídica, mas também pode ser crucial para as experiências quantitativas na função do canal iónico. Protocolo Baykal-Caglar et al 's. É semelhante, mas não idêntico ao nosso, e os leitores são encorajados a estudar também.
Este protocolo (ver descrição, a Figura 1) é uma das muitas que poderiam ser usadas. Em princípio, o sucesso da eletroformação depende da mistura de lípidos, a hidratação, a temperatura, outros solutos (principalmente iões), e deClaro que a tensão ea frequência usada em formação. Como eletropolimerização torna-se melhor compreendida, esperamos aperfeiçoar nosso protocolo mais.
Finalmente, muitas vezes há uma curva de aprendizagem em galvanoplastia lipossomas gigantes. Sugerimos dominar o protocolo convencional (Seções 1 e 4, e, se necessário, Seção 5) antes de aprender a depositar lipídios a partir de suspensões de lipossomas (seções 2-5).
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Protocol
1. Deposição de lipídios a partir de solventes orgânicos: Protocolo Classical
- Remover os lípidos de armazenamento à temperatura de -20 ° C ou -80 ° C, aquecer até à TA Cuidado:. Lípidos são extremamente higroscópico, e muitos são sensíveis ao oxigénio. Cobertura de lípidos em árgon seco ou azoto gasoso e em todos os passos para minimizar a exposição ao ar.
- Se necessário, suspender os lipídios em clorofórmio ou ciclo-hexano em mg / ml 1-10, nota que as concentrações indicadas pelo fabricante são tipicamente nominal só CUIDADO: Use luvas apropriadas e outros equipamentos de proteção individual, quando a utilização de solventes orgânicos.. Retire o PPE rapidamente se solvente é derramado sobre eles, como a maioria dos materiais ainda são permeáveis a estes solventes e eles só fornecem protecção temporária.
- Limpe ambos os lados de duas 25 x 37.5 mm ITO lâminas de vidro revestidas com etanol
- Misturar os lípidos para alcançar as proporções molares desejadas. Por cada 1 cm2 de área de ITO desliza para ser revestido com lábioid, mix ~ 15-20 mg de lipídios. Por exemplo, se os dois 25 x 37.5 mm lâminas eram para ser totalmente revestido, teríamos tipicamente usam 30 ul de 10 mg / ml de mistura de lípidos Nota:. Adicionar 0,1% em mol de DPPE-vermelho do Texas para imagiologia fluorescente, e ver abaixo para cuidados cerca corantes fluorescentes.
- Verifique se ITO lado revestido das lâminas de vidro está voltada para cima, medindo a resistência da superfície com um ohmímetro ou multímetro.
- Aspirar os lipídios em um solvente resistente à seringa Cuidado:. Há colas ou plástico, excepto PTFE, deve contactar o solvente orgânico.
- Com a agulha da seringa não é bem tocando a superfície de ITO, aplicam-se lentamente os lipídios se movendo a agulha para trás e para a frente através do slide. Cubra a superfície o mais uniformemente, procura um "arco-íris brilho" na superfície do vidro.
- Coloque os slides rapidamente sob <1 Torr (1 mm Hg) de vácuo para 0,5-1 horas para remover qualquer traço do solvente. Solte a vácuo com gás inerte.
- Aplicar uma junta de vedação de silicone, com umfina camada de gordura de silicone vácuo em ambos os lados. Adicione pelo menos 5 mm de corrediça descoberta exposta a uma extremidade da lâmina.
- Proceder de imediato à Secção 4.
2. Preparação de lipossomas pequeno para desidratação controlada
- Preparar a mistura de lípidos como nos Passos 1.1 a 1.4.
- Secar os lípidos utilizando uma corrente de gon ou azoto gasoso num tubo de cultura de 10-15 mm de diâmetro. No caso de pequenas quantidades de lípidos, ≤ 0,5 mg, o filme resultante pode ser hidratado imediatamente após a sua colocação sob vácuo durante 0,5-1 horas para remover o solvente residual, prosseguir para o passo 2.5. Grandes quantidades de lipídios tendem a prender solventes orgânicos em um gel grosso, mesmo sob vácuo, e estão melhor preparados por liofilização, veja os passos 2.3-4.
- Suspender o filme de lípido seco em ciclo-hexano, cobrir-se com árgon e de vedação com uma tampa, colocar o tubo num bloco frio e congelamento a -80 ° C durante um mínimo de horas.
- Coloque o bloco da amostra fria e lípido num sistema de vácuocapaz de atingir 100 mTorr. Aplique vácuo, que vai "parar" em cerca de 1 Torr como sublima solventes fora. Uma vez que o solvente é completamente removido (~ 1 h) de vácuo irá cair abaixo deste nível. Libertação de vácuo com o gás inerte e selar o tubo ou hidrato imediatamente.
- Enquanto os lípidos estão sob vácuo, o buffer de hidratação desgaseificar usando vácuo e aspersão de 15-17.
- Hidratos dos lípidos utilizando tampão desgaseificado a concentração final de 1-10 mg / ml. Permitir que os lípidos para hidratar lentamente. Depois de 30 min-1 hora e vortex para quebrar pedaços restantes. Espera um 0,5-1 horas adicionais para permitir a hidratação completa. Usar um osmoticant, tal como sorbitol ou sacarose até 200 mm, para evitar a desidratação completa nos passos seguintes.
- Prepara lipossomas 100-200 nm de diâmetro por extrusão. Veja protocolo extrusão do fabricante para obter mais detalhes. Note-se que o buffer deve ter menos de ~ 25 mM força iônica, ou protocolos especiais de tensão eletropolimerização serão necessários na seção 4.
3.Deposição de Lipídeos por desidratação controlada de pequenas Lipossomas
- Atenção: Este protocolo requer lípidos para ser colocado em equilíbrio com vapor de soluções salinas saturadas durante muitas horas. Recomendamos realizar o protocolo em uma atmosfera de gás inerte, usando uma caixa de luva ou gabinete similar.
- Cuidado: Se preparando amostras contendo proteínas, evitar a desidratação completa. Hidratar a atmosfera em qualquer recinto com um copo de água morna, ou um umidificador base de ultra-sons. Usar um higrómetro para garantir que há, pelo menos, 30% de humidade relativa. Use sorbitol ou sacarose na pequena tampão lipossoma como precaução adicional para evitar a desidratação total.
- Prepare uma solução saturada de umidade relativa do ar apropriada sal. Humidade alvo depende da osmolaridade da preparação das vesículas. No caso das preparações com osmolaridade fisiológica, utilizar 30-45% de HR, enquanto que as preparações de vesículas de baixa osmolaridade pode ser desidratado adequadamenteequilíbrio com 75-90% RH (Ver também Tabela 1).
- Coloque a solução saturada de sal e excesso de sal em um recipiente hermeticamente selado com uma prateleira interior. Embalagens de alimentos comerciais para iogurte e granola funciona muito bem. Substitua a prateleira após o enchimento, e certifique-se de líquidos é 5-10 mm abaixo da prateleira.
- Limpe ITO lâminas revestidas como na seção 1. Usar o multímetro para determinar qual dos lados está condutor, e rotular o lado não-condutora com o nome da amostra.
- Levemente graxa ambos os lados do silicone (Grau USP VI) junta (s) com um ou vários furos.
- Coloque o lado lâminas condutoras em cima da bancada, e aplicar a junta de silicone (s) em cada lâmina para que lípido será aplicada, tornando-se que há pelo menos 5 mm de lâmina exposta numa extremidade para ligar ao aparelho eletroformação. Alise a junta para assegurar uma boa vedação.
- Dilui-se a preparação das vesículas num tampão de baixo teor de sal isosmótica de ~ 1-2 mg / ml. Nós achamos que a maior concentrções produzir maus resultados.
- Aplicar lipídico para o slide em gotas ul de 1-10. Pequenas gotas geralmente produzem melhores resultados.
- Colocar a lâmina no interior de prateleira acima da solução salina saturada e selar o recipiente hermeticamente. Deixe em temperatura ambiente por 3 horas para O / N. O recipiente pode ser colocado a 4 ° C, mas nota que, para alguns sais, a HR depende fortemente da temperatura e, em que o frio vai aumentar o tempo de equilíbrio.
- O filme resultante pode ter um ligeiro brilho arco-íris para isso, mas em qualquer caso, devem aparecer quase desidratado. Soluções a partir altamente osmóticos pode ser impossível para secar completamente a um filme lipídico, o que não irá afectar negativamente os resultados.
4. Eletropolimerização de lipossomas gigantes
- Películas lipídicas, em especial as formadas a partir de lipossomas desidratados, são facilmente desalojado. Hidrato cuidadosamente cada poço pela colocação de uma agulha G 27, a seringa na borda do anel de vedação e aplicando lentamente tampão. Buffers podemincluem água, ≤ 200 mM sacarose, ≤ 1 M sorbitol e ≤ 5 HEPES. Solução salina mais de 10 mm podem exigir protocolos de tensão eletropolimerização alternados. Transbordamento cada junta assim por ~ 10%.
- Nota: uma vez que os lipídios são hidratados, avançar rapidamente através das etapas restantes, desde filmes lipídicos começar a descamar imediatamente. Rendimento e tamanho são maximizados se eletropolimerização começa pontualmente.
- Com um movimento suave, aplicar uma segunda corrediça de ITO, cara condutora no interior, para a parte superior da junta. Certifique-se de ter pelo menos 5 mm de saliência fora da área de vedação e em frente à primeira saliência. Pressione suavemente para assegurar uma boa vedação.
- Limpe as duas saliências usando etanol e verificar que os lados que enfrentam a junta são condutoras com o multímetro.
- A câmara pode ainda ser protegido com parafilme luz ou grampos de mola de tensão, se o desejar.
- Ligação da câmara eletroformação a uma fonte de tensão, assegurando barras de alumínio ou de cobre, "EMI gasket espuma ", ou fita adesiva condutora às superfícies condutoras das duas lâminas. Usamos EMI junta de espuma. Planos para um gabarito e fixação são mostrados na Figura 5.
- Verifique se não há curto-circuito entre os contatos, e que os contatos se conectar corretamente às superfícies de ITO, usando o multímetro.
- Aquece-se a câmara de 10 ° C acima da temperatura de fusão mais elevada de qualquer um dos lípidos presentes, por exemplo, para o DPPC, o calor a 52 ° C, mínimo, 10 ° C acima da temperatura de fusão da cadeia de 42 ° C.
- Para buffers com pouco sal, aplique uma onda senoidal de 10 Hz, ~ 0,7 V rms para cada milímetro de diferença entre as duas superfícies revestidas ITO, por 60-90 min. Para buffers elevados de sal, outros protocolos de tensão deve ser utilizado (ver referências).
5. Imaging and Troubleshooting
- Imagem do lipossoma utilizando um microscópio invertido equipado com um cubo de filtro para rodamina ou corantes Texas Red. O lipossoma deve ser de forma esférica,predominantemente unilamelar por olho, e livre de defeitos, tais como "strings" pendurado do lipossoma.
- Se os lipossomas forem demasiado pequenas, usar menos lípido.
- Se existem muitos defeitos ou alguns lipossomas, isto pode ser devido a lípidos em fase de gel. Considerar o aumento da temperatura eletropolimerização.
- Se alguns ou nenhum lipossomas gigantes formada em tudo de pequenos lipossomas desidratados, reduzir a resistência osmótica do tampão de lipossoma, ou aumentar a resistência osmótica do tampão eletroformação. Um influxo de tampão para a solução concentrada de tampão intersticial pode provocar a delaminação da película de lípido depositado.
- Se o rendimento da vesícula, qualidade ou tamanho é pobre, e você incluiu sais ou tampões de pH nos buffers eletropolimerização ou lipossomas, considere protocolos alternativos de tensão eletropolimerização. Por exemplo, Pott, et ai. 11, recomendado um protocolo de três passos utilizando uma onda sinusoidal de 500 Hz, o aumento da tensão de 50-1,300 Vpp / h durante 30 minutos, mantendo durante 90 minutos, on diminuindo a frequência de 50 Hz em 30-60 min. Eléctrodos de platina ou de titânio pode ser necessário neste caso, mas isso não irá alterar substancialmente o protocolo.
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Representative Results
Nos nossos exemplos, podemos preparar lipossomas a partir de uma mistura de cerca de 55 mol% de POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfocolina), 15% molar POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-fosfo , 30 mol% de colesterol e 0,1% molar de Texas Red-rotulado 1,2-dipalmitoil-sn-fosfoetanolamina (TxR-DPPE). Esta composição foi escolhida como representante de aproximadamente lípidos do gânglio da raiz dorsal 18. Notamos que 15% em mol carregada lípido (aqui POP) está perto do limite do que pode ser usado em eletroformação (por exemplo, Walde et al. 4).
Quebra de lipídios por hidrólise e peroxidação é uma questão especialmente importante para muitas misturas de lipídios e muitas experiências sensíveis (ver Discussão). Para sozinho clareza, nós não usamos atmosfera de gás inerte na apresentação de vídeo. Como é evidente a partir das figuras abaixo, isto não visivelmente afectar a qualidade dos lipossomas, mas para estudos ou sensíveisquando se utiliza lípidos altamente insaturados é importante para evitar a quebra lipídica.
Uma vez que o principal obstáculo na eletropolimerização é formar um bom filme lipídico no substrato de óxido de índio-estanho (ITO), sabendo que o filme lipídico deve ser parecida quando seco é crucial. No entanto, quando eletropolimerização falhar, muitas vezes não tão completamente, resultando em ausência de produção de lipossomas gigante apreciável. Freqüentemente, os detritos substanciais serão observados, o que normalmente indica que o excesso de lipídios tem sido utilizado. Nossos números mostram o que se espera ver em cima de sucesso.
A Figura 2 mostra duas manchas diferentes de lipossomas a partir de lípidos eletroformada depositados de clorofórmio. No painel esquerdo, examinar atentamente as correções indicadas pelas setas 2 e 3. Embora seta 2 indica uma mancha com lipossomas fracamente distinguíveis, sem lipossomas podem ser postos em destaque na área indicada pela seta 3. Juntos, estes resultados indicam uma baixapreparação, provavelmente devido à existência de excesso de lípidos depositado nesta área. No painel direito, tais regiões "fuzzy" são menos comuns, indicando geralmente melhor preparação. Nós achamos que é raro para eliminar completamente essas imperfeições.
A Figura 3 mostra lipossomas eletroformada depositada com sucesso a partir de lípidos, por desidratação de lipossomas pequenos, em duas ampliações, fotografada usando vermelho de Texas de epifluorescência. Os lipossomas são escassos, mas há vários bons exemplares. Porque o tamanho varia, alguns estão fora de foco. As setas indicam três lipossomas de boa qualidade variam em tamanho de ~ 5-20 um, dois dos quais aparecem na imagem em 40x. Observe o "anel" clara na borda: indica um lipossomas unilamelares ou quase unilamelares. Enquanto algumas manchas de lípidos parecem ter colapsado ou nunca lípido formado, este é um resultado de boa qualidade.
Finalmente, o nosso propósito em desenvolver e publicar este protocoloé preparar GUVs intactas, com canais de iões funcionais de mamífero que são adequados para electrofisiologia de patch-clamp convencional. Na Figura 4 nós demonstramos capsaicina ativados TRPV1 correntes iônicas gravados em placas de membrana de lipídios retirados de GUVs formadas usando esse protocolo. A corrente pode ser bloqueada por ruténio vermelho, e não é activado por capsaicina do veículo (etanol a 0,1%, NaCl a 138 mM, 3 mM de HEPES pH 7,4) sozinha. A preparação das proteolipossomos para experimentos de eletrofisiologia é muito além do âmbito do presente protocolo, mas é o assunto de um artigo apresentado.
| Sal | Molalidade @ 20 ° C e a saturação | % HR @ 10 ° C | % HR @ 20 ° C | % RH @ 30 ° C |
| Cloreto de Magnésio hexa-hidratada | 5.8 | 33 | 33 32 | |
| Carbonato de potássio dihidratado | 8 | 47 | 44 | 42 |
| Brometo de sódio | 4.6 | 58 | 57 | 57 |
| Cloreto de cobre | 5.6 | 68 | 68 | 67 |
| Cloreto de Sódio | 6.13 | 75 | 75 | 75 |
| Cloreto de Potássio | 4.61 | 87 | 86 | 84 |
Tabela 1. Umidade relativa (% RH) de vários sais comuns de dados de umidade relativa do Greenspan 19 e 20; Rockland. Dados de saturação das tabelas críticos internacionais 21.
Figura 1. Esquema de eletropolimerização lipossomas gigantes de pequenos lipossomas. (Canto superior esquerdo) Pequenos lipossomas são depositados em uma série de pequenas gotículas, <5 mL. (Centro superior) Os lipossomas são desidratadas com umidade relativa controlada, colocando-os em um recipiente fechado acima de uma solução saturada de sal. Um higrômetro é opcional. (Canto superior direito) Uma vez desidratado para um filme pegajoso de lipídios e (possivelmente) osmoticant como sorbitol, os lipídios são reidratados em um tampão hiperosmótico (ver secção protocolo 5). (Inferior esquerdo), a câmara de eletroformação é selado com uma segunda corrediça de ITO em cima. (Inferior direito) Por último, a câmara é aquecida acima da temperatura de fusão da cadeia de lípido, e ligado a uma fonte de fornecimento do sinal de um campo eléctrico oscilante entre as duas lâminas de ITO.
Figura 3. Lipossomas gigantes eletroformada formado a partir de lipídios desidratação depositado. (À esquerda) com ampliação de 10x, vários lipossomas são visíveis. Três lipossomas são rotulados. (Direita) O mesmo ponto de vista quanto à esquerda, com ampliação de 40x, com a mesmalipossomas (2 e 3) marcada. O número destes lipossomas é tipicamente muito menor do que quando electrodeposição de lípido-solvente depositado, mas é inteiramente adequada para muitas finalidades. Fotografada usando um microscópio invertido de epifluorescência equipado com um Chroma 41004 Texas Red filtro cubo e Stanford Photonics XR/MEGA-10 S30 intensificou câmera CCD. 
Figura 4. Capsaicina ativado TRPV1 atual gravado em um remendo de membrana retirado de uma GUV formado usando esse protocolo. A. A corrente de fuga indicada de 500 mohms selar a resistência antes de capsaicina foi adicionado. B. Saturating capsaicina (> 20 mM, em etanol 0,1%) ativa um grandes correntes; TRPV1. corrente é bloqueada por ruténio vermelho, e não é activado por veículo (etanol a 0,1% em tampão) sozinho (dados não mostrados) C. Os resultados actuaispara perto da linha de base, como a capsaicina é lavado fora do patch. 
Figura 5. Planos para câmara de eletropolimerização. Está incluído um resumo, que mostra o conjunto completo, e dimensionada para esquemas que os pedaços de plástico superior e inferior. Use acrílico ou outro plástico transparente facilmente maquinado. A fina película de Kapton aquecedor devem ser ligados ao controlador de temperatura (ver tabela de reagentes e equipamentos específicos) e a EMI junta de espuma deve ser ligado ao gerador de função, de modo que o sinal de onda sinusoidal é aplicado entre as duas lâminas revestidas com ITO. Um buraco está prevista uma sonda de temperatura. Parafusos de cabeça chata 10-32 são colocadas nos furos chanfrados na parte inferior, e passam através da peça superior. 10-32 porcas são usados para fixar o conjunto. Quando completamente quantosembled, as peças de plástico superior e inferior devem ser alinhadas entre si em dois lados (os lados paralelos à EMI junta.) Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
Eletropolimerização de lipossomas gigantes tornou-se uma técnica flexível compatível com diversos lipídios, preparações, e tampões. O controle cuidadoso do processo de deposição de lipídios é o mais crítico para o sucesso. Nós apresentamos ferramentas simples para fazer a deposição controlada de lipídios a partir de pequenas preparações de lipossomas um processo simples. A humidade relativa é crítico para o bom desidratação dos lipossomas iniciais, e o valor óptimo variará com a concentração inicial dos solutos na suspensão de lipossomas. Baixa humidade relativa é necessária para desidratar as amostras mais concentradas a um nível adequado.
O protocolo de hidratação exacto e campo elétrico utilizado para eletropolimerização continua a ser um ponto de discussão 1,4,7,10,11,22. Os protocolos mais simples deve ser dominado antes de tentar eletroformação lipossoma na presença de elevadas concentrações de sal, lípidos carregados ou concentrações muito elevadas de fusão elevadoção lípidos temperatura. Uma vez que essas habilidades são dominados, os protocolos mais avançados normalmente dividem o processo de eletropolimerização em três partes: o inchaço inicial, crescimento e desapego. Inchaço inicial parece ser favorecido pelo aumento lentamente campo elétrico aplicado 11. Uma segunda etapa, opcional na intensidade de campo fixo pode ajudar a controlar o tamanho final dos lipossomas. Finalmente, a diminuição da frequência do campo oscilante pode ajudar a separar lipossomas a partir da superfície de ITO. Frequências mais altas são necessárias para electroform lipossomas em condições salinas fisiológicas 11, mas lipossomas podem ser formados por uma gama extremamente ampla de freqüências e amplitudes de campo 10.
A observação de que os lipossomas gigantes formarão espontaneamente após reidratação dos lipossomas desidratadas com um buffer de hipo-osmótico 7 indica várias chaves para o sucesso. Em primeiro lugar, o processo de inchamento lipossoma começa imediatamente, de modo que para eletroformação, algunsgrupos têm até achei que seria útil para aplicar o campo elétrico AC antes de reidratação do filme lipídico 10. Em segundo lugar, é provável que o escoamento de fluido acciona o processo de inchamento lipossomal, e que eletroformação ocorre pelo menos em parte, por causa do fluxo electro-osmoticamente. Isto coloca limites sobre a frequência útil e gama de amplitude que pode ser usada em eletroformação 10.
Um dos principais pontos de discussão nos últimos anos tem sido o potencial de hidrólise e da peroxidação lipídica 23,24. A primeira defesa contra a degradação dos lípidos de qualquer tipo é para remover o oxigénio a partir de todos os materiais utilizados na preparação GUV: uma vez que a peroxidação depende oxigénio molecular 23, esta deve abrandar consideravelmente o processo. Uma combinação de vácuo e borbulhamento com o gás inerte deve ser usado para remover tanto oxigénio quanto possível 15-17. Sonication e leves de vácuo são ineficazes. Nós usamos um kit de teste de oxigênio (CHEMetrics K7501) para verify que nós removemos oxigênio tão completamente quanto possível. A hidrólise é mais perniciosa, mas é reduzida de manter o pH neutro 25, e pela redução da tensão usada em eletroformação 24. Alguns autores defendem o uso de eletrodos de titânio no lugar de ITO desliza 23,24,26,27. Nós preferimos evitar a possibilidade de contaminação de nossas amostras com titânio (ou qualquer metal), uma vez que, no passado, sido conhecida a interferir com experimentos lipossomas 28,29, mas pode ajudar a prevenir alguns efeitos peroxidação ou hidrólise. Escusado será dizer que a exposição prolongada a altas temperaturas acelera a desagregação lípido 30. Finalmente, a cromatografia em camada fina 24,31, ensaios colorimétricos de 23, e 31 existem outros métodos para quantificar a degradação de lípidos.
Um problema semelhante refere-se os corantes fluorescentes utilizados para lipídicas GUVs da imagem, especialmente para os estudos de separação de fases laterais 30,32 30,33, e utilizada a uma concentração mínima.
Não temos conhecimento de qualquer consenso sobre se os slides eletrodo ITO pode ser reutilizado. Muitos grupos fazem reutilizar seus slides Ito, enquanto outros não. Um trabalho recente indica que as lâminas se degradam ao longo do tempo, mas podem ser recozido para recuperar o elevado desempenho 34; esta degradação teve apenas um pequeno efeito no caso de misturas de lípidos, incluindo lípidos zwitteriónicos ou aniónicos, mas era crítico para as misturas que contêm lípidos catiónicos. Nós reutilizar nossos slides sem recozimento.
Embora exista uma grande variabilidade nos protocolos utilizados para electroform lipossomas gigantes, o conhecimento teórico e experiência prática com a técnica está em constante aperfeiçoamento. Já lipossomas podem ser formados com grandes quantidades de lipídios carregados, ou em buffers elevados de sal. A chave permanece deposição eficiente dos lipídios na superfície do eletrodo, which é o núcleo do nosso protocolo.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos Bryan Venema e Eric Martinson para a construção do aparelho eletropolimerização. Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (R01GM100718 para SEG) eo Instituto Nacional de Eye of the National Institutes of Health (R01EY017564 para SEG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Multimeter | Agilent Technologies, www.agilent.com | U1232A or similar | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. |
| Fluke | 117 or 177 | Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test. | |
| Function Generator | Agilent Technologies, www.agilent.com | 33210A or similar | Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com | CB-90IN-S107 or similar | Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm |
| Temperature controller | Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com | CNi3233 or similar | |
| Hygrometer | Extech, Nashua, NH, www.extech.com | 445815 | |
| Silicone rubber sheet | McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com | 87315K64 | Use USP Grade VI silicone for its high purity |
| EMI gasket | Laird Technologies www.lairdtech.com | 4202-PA-51H-01800 or similar | Distributed by Mouser www.mouser.com |
| TxR-DHPE | Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com | T1395MP | Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable. |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com | 850457P or 850457C | Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C) |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034P/C | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 |
References
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