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Medicine

Un modelo de pez cebra de la diabetes mellitus y la memoria metabólica

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232
Automatic Translation
1, 1, 2
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

Memoria metabólica es el fenómeno por el cual las complicaciones diabéticas persistir y progresar sin obstáculos, incluso después de euglucemia se logra farmacéuticamente. Aquí se describe un modelo de pez cebra diabetes mellitus, que es la única que permite el examen de los componentes epigenéticos mitóticamente transmisibles de memoria metabólica

Abstract

La diabetes mellitus afecta actualmente a 346 millones personas y se prevé que aumente a 400 millones para el 2030. Evidencia desde el laboratorio y ensayos clínicos grandes escala ha revelado que el progreso complicaciones diabéticas sin obstáculos a través del fenómeno de la memoria metabólica incluso cuando el control glucémico se logra farmacéuticamente. La expresión génica puede ser alterada de forma estable a través de cambios epigenéticos que no sólo permiten a las células y los organismos para responder rápidamente a las cambiantes estímulos ambientales pero también confieren la capacidad de la célula de "memorizar" estos encuentros, una vez que el estímulo se retira. Como tal, los papeles que desempeñan estos mecanismos en el fenómeno de memoria metabólica se están estudiando actualmente.

Hemos informado recientemente el desarrollo de un modelo de pez cebra de tipo I diabetes mellitus y caracterizado este modelo para demostrar que el pez cebra diabético no sólo mostrar las complicaciones conocidas secundarias, incluyendo los cambios asociadoscon la retinopatía diabética, nefropatía diabética y curación de la herida, pero también presentan regeneración afectada aleta caudal. Este modelo es único en que el pez cebra es capaz de regenerar su páncreas dañada y restaurar un estado euglucémico similar a lo que sería de esperar en post-trasplante de pacientes humanos. Además, múltiples rondas de amputación aleta caudal permiten la separación y el estudio de los efectos epigenéticos puros en un sistema in vivo sin posibles factores de complicación desde el estado diabético anterior. Aunque la euglucemia se consigue después de la regeneración de páncreas, la complicación de la diabetes secundaria de la regeneración de la aleta y la curación de heridas de piel persiste indefinidamente. En el caso de la regeneración de aleta alterada, esta patología se conserva incluso después de múltiples rondas de regeneración de aleta en los tejidos hija de aleta. Estas observaciones apuntan a un proceso subyacente epigenética existente en la memoria de estado metabólico. A continuación se presentan los métodos necesarios para pasar satisfactoriamente geneRate los grupos de memoria diabéticos y metabólicos de los peces y discutir las ventajas de este modelo.

Introduction

La diabetes mellitus (DM) es un problema de salud grave y creciente que da lugar a la esperanza de vida reducida debido a la enfermedad microvascular específica (retinopatía, nefropatía, neuropatía, curación lenta de heridas) y macrovasculares (enfermedad cardiaca y accidente cerebrovascular) Complicaciones 1. Una vez iniciadas, las complicaciones diabéticas continuará progresando sin interrupciones, incluso cuando el control glucémico se consigue 2,3 y este fenómeno se ha denominado memoria metabólica o el efecto legado. La presencia de este fenómeno fue reconocido clínicamente durante la década de 1990 como el "The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" progresado y ya ha recibido el apoyo de múltiples ensayos clínicos adicionales 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Los modelos animales de DM han sido críticos para los descubrimientos relacionados con la fisiopatología de las complicaciones diabéticas y la memoria metabólica. De hecho, la persistencia de las complicaciones diabéticas se documentó por primera vez en un modelo canino de diabéticaretinopatía que desde entonces ha sido apoyado por varias líneas de evidencia experimental utilizando una variedad de sistemas de cultivo in vitro y modelos animales 15,16,17,18,19,20,21. Estos estudios muestran claramente que un período inicial de resultados hiperglucémicos en anomalías permanentes (incluyendo la expresión génica aberrante) de los órganos diana y / células mecánicamente sugiere la participación del epigenoma.

Epigenomas consistirá en todas las modificaciones de la cromatina para un determinado tipo de células y son responsables de perfil único gen de una célula de expresión. Las modificaciones cromosómicas son dinámicos durante el desarrollo, la diferenciación de células de soporte, responden a estímulos externos, están mitóticamente establemente heredados 22,23 y puede ser alterado en la enfermedad 24,25,26. Estos mecanismos epigenéticos incluyen: después de la traducción modificaciones de las histonas y no histonas variante canónica de inclusión en octomers, cambios en la cromatina de acceso a través de la metilación del ADN y los genescontrol de la expresión a través de no codificante RNAs micro 27,28,29,30. En conjunto, los procesos epigenéticos permitir que las células / organismos para responder rápidamente a las cambiantes estímulos ambientales 31,32,33, también confieren la capacidad para la célula "aprende" estos encuentros, una vez que el estímulo se retira 23,22. Por lo tanto, como alteración de perfiles de expresión génica que resultan de los procesos epigenéticos son estables en ausencia de la señal (s) que los inició y se heredables a través de la división celular, que han adquirido gran interés como mecanismos moleculares subyacentes de patologías humanas, incluyendo la memoria metabólica. Los resultados que surgen en el contexto de la MS y la epigenética avances paralelos en otras enfermedades en las que una gran cantidad de cambios epigenéticos inducidos por la hiperglucemia producen notables cambios persistentes en las redes transcripcionales de las células (revisado en 34,35,36,37,38).

El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo principal para estudiantesdy desarrollo de los vertebrados sin embargo en los últimos 15 años ha experimentado un crecimiento exponencial en la utilización de este organismo para el estudio de las enfermedades humanas. 39. Modelos de pez cebra de la enfermedad humana han establecido que abarca una amplia gama de patologías humanas, incluyendo trastornos genéticos y las enfermedades adquiridas 40,41,42. Las muchas ventajas del pez cebra con respecto a otros organismos vertebrados modelo incluyen alta fecundidad, corto tiempo de generación, la transparencia a través de la edad adulta temprana, la reducción de los costos de vivienda y una serie de herramientas para la manipulación de genes. Además, debido a la conservación extensa de las vías genéticas y la fisiología celular entre los vertebrados y de la capacidad para llevar a cabo exámenes de drogas de alto rendimiento, el pez cebra se ha utilizado con éxito para el descubrimiento farmacéutico.

Hemos desarrollado un modelo de pez cebra adulto de diabetes mellitus tipo I que usaban el medicamento diabetogénico, estreptozocina. Hemos caracterizado este modelo para mostrar que el pez cebra diabético not sólo muestran las conocidas complicaciones secundarias humanos pero, además, exponer regeneración extremidad afectada (regeneración aleta caudal) como consecuencia del medio ambiente hiperglucémico. Además, se ha informado que el pez cebra hiperglucémico volver a normalizar la glucemia dentro de las 2 semanas de eliminación del fármaco debido a la regeneración de células beta pancreáticas endógenas resultantes en un estado glucémico fisiológicamente normal. Sin embargo, en contraste, la regeneración de miembros en estos peces sigue siendo afectada en la misma medida que en el estado diabético agudo indicando esta complicación persiste y es susceptible a la memoria metabólica. El principal impulso para la generación de este modelo era proporcionar un sistema para estudiar los componentes epigenéticos mitóticamente estables que soportan el fenómeno de memoria metabólica en ausencia del ruido de fondo del entorno hiperglucémico anterior. A la conclusión del protocolo al que aquí los tejidos de pez cebra o selectivos y pueden ser procesados ​​por cualquier ensayo adecuado para la researchers necesita. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para identificar los cambios persistentes en todo el genoma en la metilación del ADN inducidos por la hiperglucemia que se mantienen en la memoria de estado metabólico 21.

Creemos que este modelo de pez cebra de diabetes mellitus tipo I tiene varias ventajas sobre los sistemas innovadores de otros modelos de examen de memoria metabólica. 1) Todos nuestros estudios pueden llevarse a cabo in vivo y como el pescado hiperglucémico anterior volver a la euglucemia a través de la regeneración de la producción de insulina endógena, que no requieren inyecciones de insulina exógena. Por lo tanto, esto evita los picos y valles de complicación en el control glucémico que pueden ocurrir en los animales que necesitan insulina exógena. 2) Como se ha descrito anteriormente, la estimulación de fondo desde el estado diabético anterior (es decir, la presencia continuada de la glucosilación avanzada de productos finales y reactivos marcadores de especies de oxígeno) son eliminados y por lo tanto, se puede examinar el puramente epigfactores Enetic de memoria metabólica. 3) Los experimentos se pueden realizar rápidamente, ya que toma aproximadamente 80 días a partir de la inducción de diabetes hasta que el examen memoria metabólica. 4) la regeneración Aleta caudal es experimentalmente muy accesible y permite una fácil manipulación genética y experimental para el que hay una gran variedad de herramientas. 5) la regeneración Aleta caudal proporciona un método muy simple y cuantificables para evaluar la memoria metabólica y por lo tanto permitirá el descubrimiento de fármacos futuro.

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Protocol

Todos los procedimientos se realizaron siguiendo las pautas descritas en "Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio" (Institutos Nacionales de la Salud de la publicación no. 85-23, revisado 1985) y la aprobación Universidad Rosalind Franklin Cuidado de Animales institucional y el uso de animales Comité de protocolo 08-19.

Hay 2 abreviaturas importantes que se utilizan en este manuscrito. 1) DM: se refiere a los peces que se encuentran en un estado de hiperglucemia aguda (300 mg / dl) y han sido por lo menos 3 semanas. 2) MM: se refiere a los peces que fueron 21 días (ver protocolo) DM pescado y se deja restaurar el control glucémico mediante la regeneración del páncreas. Esto se logra dentro de (14) días a partir de la eliminación del fármaco. Los peces se consideran peces MM desde este punto en adelante. También es importante tener en cuenta que el pescado que se conoce como control se tratan de manera idéntica como pescado DM o MM en términos del número de inyecciones (solución salina solamente), los tiempos de incubación a las temperaturas diferentes y el número y el momentode las amputaciones de la aleta caudal.

1. Generación de pez cebra con diabetes mellitus, Fish DM

  1. Preparar la recuperación y tanques de agua anestésicos. La recuperación es agua peces de agua normal. Para agregar suficiente agua anestésico 2-fenoxietanol para que una dilución 1:1.000 en los peces de agua normal se alcanza.
  2. Preparar una solución de 0,3% (en una campana de humos) de estreptozocina (STZ) mediante la adición de 6 mg de STZ a 2 ml de cloruro de sodio 0,09% e inmediatamente colocar la solución en hielo. Esto proporcionará suficiente solución de inyección para la inyección de aproximadamente 20 peces en 20 min. Si supera los 20 minutos, detener y hacer una nueva solución STZ antes de continuar. En una alícuota separada tubo suficiente solución salina para peces de control. Una vez que la STZ se solubiliza todos los pasos subsiguientes no requieren el uso campana de humos.
  3. Llene una jeringa de ½ cc equipada con una aguja de calibre 27 1/2 con las soluciones de STZ o control que garantice que no haya burbujas de aire atrapadas.
  4. AnestesiaTize cada pez individual colocando el pez en el agua anestésico, y espere hasta que su movimiento de natación cesa (1-2 min).
  5. Una vez anestesiaron brevemente colocar el pescado sobre una toalla de papel para absorber el exceso de agua, colocar el pescado en peso barco y medir la masa de los peces.
  6. Coloque el pescado en una superficie firme (tapa plato Petri) para inyección.
  7. Inyectar la STZ o solución de control en la cavidad peritoneal de los peces mediante la inserción de la aguja más allá del bisel en la cara posterior del peritoneo ventral.
  8. 0,35 mg / g (350 mg / kg) de STZ deben ser entregados a cada pez y el volumen de la solución de 0,3% requerido se puede calcular de la siguiente manera.
    1. Multiplicar la masa de pescado (g) por 0,35 para obtener la cantidad de STZ en mg requerida.
    2. dividir el producto generado por encima de 3 para producir el volumen de la solución de 0,3% requerido para la inyección en l.
      Muestra: Para un pez 0,5 g: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 0,058 = 3 ml= 58 l.
      El mismo volumen sin la STZ sería inyectado para un control de los peces. Una hoja de volúmenes a inyectar por masa de pescado se genera y se utiliza como referencia rápida.
  9. Después de la inyección colocar los peces en el tanque de recuperación de agua y supervisarlos para la actividad de natación normal. Una vez que esto se ha logrado el pescado se transfiere a un tanque vida normal que se mantiene en el intervalo de temperatura reducida de 22 ° C - 24 ° C. Esta reducción de temperatura es crítico para la inducción eficiente de la hiperglucemia (diabetes mellitus, DM).
  10. Aunque la hiperglucemia se detecta dentro de 24 horas de la primera inyección, con el fin de inducir un estado de hiperglucemia prolongada muy alto el pez cebra requieren una fase de inyección frecuente inducción seguida de inyecciones semanales de mantenimiento tal como se muestra a continuación.

Semana 1: 3 inyecciones (día 1, 3, 5), Semana 2: 1 inyección (día 12), Semana 3: 1 inyección (día 19),
Semana 4 (Día 21) Realizarensayo de interés.

En este punto, el pez cebra se considera que han estado en un estado de hiperglucemia prolongada y mostrar las complicaciones diabéticas de la retinopatía, la nefropatía y la regeneración también se deteriora la aleta. Estos se conocen como peces DM. Además, si se desea, el pescado se puede mantener en el estado hiperglucémico con inyecciones semanales de mantenimiento. Aproximadamente el 5% la muerte durante este proceso se debe esperar.

2. Extracción de sangre y el nivel de glucemia en ayunas (FBGL) Determinación

  1. Cada grupo de peces DM y control debe incluir suficiente pescado para determinar con precisión la FBGL promedio del grupo en este ensayo requiere que estos peces que ser sacrificado.
  2. Preparar una etiqueta tubo de PCR para cada muestra de sangre que contiene 5 l de solución salina normal estéril.
  3. Para la recolección de sangre, anestesiar los peces que el anterior, retire toda el agua, colocar el pescado sobre un portaobjetos de microscopio y utilizando un bisturí, quitar la cabeza de los pecesen la base del opérculo.
  4. Recoger la sangre (hasta 2 l) que se libera de los peces en la diapositiva y rápidamente añadirlo a la 5 l de solución salina normal estéril pipeteando arriba y abajo para asegurarse de que la sangre no obstruye. Colocar inmediatamente la muestra en hielo.
  5. Determinar el volumen de muestra de sangre mediante la medición del volumen total del líquido (solución salina + sangre) y después de restar la 5 l de solución salina.
  6. Transferir 5 l de la sangre diluida a partir de cada tubo de PCR en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y determinar la concentración de glucosa en sangre usando el Kit de Ensayo de Glucosa QuantiChrome. Esto se realiza siguiendo el protocolo del fabricante, sin excepción. Resultados esperados: normal / pescado de control 60 mg / dl y DM pescado 310 mg / dl.

3. Aleta caudal Regeneración Estudios

  1. Anestesiar pescado que se describe en 1.0-1.4.
  2. Coloque el pescado en una tapa de la placa Petri y amputar la aleta caudal en una línea recta con un tamaño estéril10 escalpelo proximal a la primera lepidotrichia punto de ramificación durante la visualización de la aleta a través de un microscopio de disección.
  3. Permiten a los peces recuperar como en 1,10 pero colocar el pescado a 33 º C para la fase de crecimiento regenerador del ensayo. Esta es una temperatura establecida para el análisis acelerado de la regeneración de la aleta.
  4. Las aletas se pueden obtener imágenes en cualquier momento posterior a la amputación sin embargo que examinan rutinariamente el crecimiento regenerador a las 24, 28 y 72 horas después de trans-sección.
  5. Anestesie pescado como antes (ver 1,0-1,4), coloque el pescado en un microscopio equipado con una cámara (nosotros usamos una Nikon SMZ-1500 equipado con una cámara Q-imagen) y recoge todas las imágenes de la aleta con una ampliación 1X con NIS elementos software . La aleta debe extenderse para formación de imágenes de modo que se extienda totalmente sin estirar o dañar el tejido y debe estar libre de cualquier gota de agua. Por consistencia siempre colocar el lado dorsal hacia la derecha.
  6. Imprime imágenes y medir el gro regenerativaárea wth utilizando software Image J y el uso de una almohadilla de dibujo. Trace alrededor de toda el área de nuevo crecimiento y determinar el área. Cada medición se realizó cinco veces y se promediaron para asegurar la precisión de localización. Es importante que las imágenes utilizadas no tienen sombras o gotitas de agua dado que contribuyen a errores en la medición de la zona de derivación.
  7. Medir la longitud de la zona de la amputación a lo largo del eje dorsal-ventral y dividir la superficie determinada en un 3,6 por esta medida. Esto permite que los peces de diferentes tamaños para ser comparados directamente.

4. Generación de Memoria Metabólica (MM) El pez cebra

  1. Iniciar un grupo de peces DM y sus controles apropiados como se describe en la sección 1.
  2. A los 21 días determinar la FBGL para un subconjunto del grupo y dividir el pescado DM en 2 subgrupos. Continuar con inyecciones semanales STZ para uno de los grupos como los controles de DM para la duración del experimento. Cesar la inyección de STZ para el segundo grupo y incue el pescado a temperatura normal. Dentro de los 14 días estas pez cebra restaurará la insulina y la glucosa sanguínea normal de control a través de la regeneración del páncreas. Estos peces se llaman ahora MM (pescado memoria metabólica).
  3. En el día 30 después de la eliminación del fármaco amputar las aletas caudales de control, DM y MM pescado a través del método descrito en el punto 3.2.
  4. Volver pescado a las condiciones normales de agua para la regeneración de aleta durante 30 días. Esto permite el crecimiento de lo que el tejido plazo, memoria metabólica.
  5. Al día 60 realizar una amputación segundos (como se describe en 3,2) en el tejido que se regenera en el período de 30 a 60 días y realizar el ensayo de regeneración aleta caudal (03.01 a 03.07) Figura 1.
  6. Aislar tejido y realizar el ensayo de interés. Véase la Tabla 1 para un resumen de protocolo.

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Representative Results

El tipo I de pez cebra diabético no sólo muestran las complicaciones secundarias conocidas de la retinopatía y nefropatía, sino también, exhiben una complicación adicional: la regeneración alteración aleta caudal. Esta complicación más tarde persiste debido a la memoria metabólica en los peces que han restaurado el control normal de la glucosa después de un período de hiperglucemia. En la Figura 2A (control) y la Figura 2B (memoria metabólica) imágenes representativas de la regeneración de las aletas que se capturaron a 72 horas después de la amputación se presentan. El déficit se puede cuantificar y como se muestra en la Figura 2C DM y pez cebra MM exhiben un déficit de aproximadamente el 40% a las 72 horas en comparación con el control pescado. Aunque los datos incluidos en la Figura 2C termina a los 90 días esta misma deficiencia se ha observado tan lejos como 150 días.

Tabla 1. Protocolo de resumen.

Figura 1
Figura 1. Caricatura que representa un sitio de amputación para experimentos de memoria metabólicas. El color azul representa el tejido que fue expuesta a la anterior estado hiperglucémico. El color verde indica que el tejido que se cultivan 30 a 60 días después de la hiperglucemia. La línea punteada de color negro indica el lugar de la amputación estrenada el día 30 y el rojo indica una zona de la amputación potencial que se produciría en 60 días.

Figura 2
Figura 2. La regeneración de la aleta caudal se reduce en diabéticos (DM) y memoria metabólica (MM) El pez cebra. A. Una imagen representativa de la aleta caudal de un control inyectado peces que presenten una cantidad normal de regcrecimiento enerative 72 h después de la amputación. La línea punteada blanca representa el plano de la amputación y la línea continua de color rosa deMarks la consecuencia regenerativa. La cantidad de regeneración es determinado por rastreo de la superficie comprendida entre las líneas blancas y rosadas dividido por la longitud de la línea blanca para normalizar las diferencias de tamaño de las aletas. B. Una imagen representativa de la aleta caudal de DM o MM ilustra una cantidad reducida de crecimiento regenerador 72 h después de la amputación. Las líneas y las mediciones de área son los mismos que para el panel A. C. presentación gráfica de la tasa de regeneración relativa de pez cebra DM y MM en comparación con los controles. El porcentaje relativo (con los controles fijados en 100%) de la excrecencia de pez cebra DM y MM regenerativa a las 72 horas se muestra. El tiempo en días representados es relativa a la administración de STZ cuando se detuvo para el grupo de memoria metabólica. Estos datos donde generar por varios investigadores e incorporar más de 1.000 peces por grupo. <strong> Figura 2A y la figura 2B se han adaptado con permiso de Olsen et al 43.

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Discussion

La diabetes mellitus es una enfermedad de desregulación metabólica, diagnosticado inicialmente como la hiperglucemia, que finalmente resulta en daño del vaso sanguíneo que conduce a muchas complicaciones que todos persistir incluso después de la euglucemia se logra mediante la intervención farmacéutica. Esta persistencia de las complicaciones que se conoce como memoria metabólica y varios estudios recientes han examinado el papel que juegan los mecanismos epigenéticos en este fenómeno. Aquí se han detallado un protocolo que permite la generación de tanto diabética aguda y memoria metabólica (control restaurado glucosa) pez cebra. Nos describe además la metodología que puede ser empleado para separar las contribuciones epigenéticas de los componentes de complicando potencialmente el estado diabético anterior. Queremos hacer hincapié en que los peces pueden ser examinados en cualquier momento con cualquier ensayo de interés para el investigador en particular por lo que las aplicaciones posteriores para el descubrimiento de futuro son infinitas.

There varios pasos en el protocolo que requieren más discusiones y énfasis. En nuestra experiencia la STZ 0,3% en solución se deteriora y pierde su eficacia después de aproximadamente 20 minutos. Por lo tanto, se aconseja que un temporizador se use y una solución fresca se hizo en intervalos de 20 minutos. Durante nuestros intentos iniciales para generar el pez cebra diabética que se utiliza un solo inyección durante la primera semana y fueron exitosos con aproximadamente 40% de los peces. Como tal, no es un requisito estricto de tres inyecciones, sin embargo, cuando tres se realizó la tasa de éxito supera el 95%. En segundo lugar, cuando la inyección de STZ en el pez cebra es importante que se inserta la aguja de modo que el bisel de la aguja está completamente dentro del pez para permitir la correcta dispensación de la solución, sin embargo, se debe tener cuidado de que no penetra demasiado para poder evitar daños internos. Una vez solución STZ o control se administra el pescado se incuban a una temperatura reducida (22 º C - 24 y dpor ejemplo, C). No más puede subrayar la importancia de la temperatura reducida como sin ella el pez cebra se regenera sus células beta (STZ inyectada) y la hiperglucemia no puede ser eficientemente inducida. Por último, en nuestra sangre coagula pez cebra manos muy rápidamente, lo que impide la acción capilar necesaria requerida para el uso eficiente glucómetro y por lo tanto no abogan por su uso. Se ha encontrado que el ensayo QuantiChrome descrito no sólo es la más fiable pero más fácil de realizar y para instruir al personal de laboratorio. Colectivamente las técnicas descritas en el protocolo no son difíciles y si las precauciones adecuadas con los pasos descritos anteriormente, la generación de pez cebra diabética es prácticamente asegurado.

Hay muy pocas limitaciones en el procedimiento que se describe en este manuscrito, sin embargo todos los modelos de la enfermedad inducida por fármacos tienen siempre las críticas de los efectos fuera del objetivo formuladas contra ellos. Remitimos al lector a nuestro detailin manuscrito inicialg este modelo como siempre 5 líneas independientes de evidencia (incluyendo inyección directa de STZ en las aletas) documentan que no hay efectos fuera del objetivo de STZ 43. Otra limitación potencial no viene de procedimiento en sí mismo, sino por el hecho de que los reactivos para la investigación pez cebra no están aún en el nivel de otros organismos modelo tales como ratones. Afortunadamente, como el pez cebra se está utilizando cada vez más como un organismo modelo para la enfermedad humana esta deficiencia está siendo rápidamente subsanado.

En resumen, como se detalla en la introducción, el modelo de pez cebra de la diabetes mellitus se describe aquí tiene varias ventajas sobre otros organismos modelo. Es importante destacar, que permite el examen de los componentes puramente epigenéticos que apoyan el fenómeno de memoria metabólica. Como se prevé que 400 millones de personas se verán afectados por este trastorno creemos que la contribución de los estudios que utilizan este modelo podría tener un impacto significativo en la salud humana.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de la Fundación Familia Iacocca, Rosalind Franklin University fondos iniciales, y los Institutos Nacionales de Salud Grant DK092721 (a RVI). Los autores desean dar las gracias a Nikki intina para la ayuda en la preparación de manuscritos.

Materials

DÍA PROCEDIMIENTO
1
3 DM = STZ inyección (350 mg / dl), Control = inyección de solución salina
5 DM = STZ inyección (350 mg / dl), Control = inyección de solución salina
12 DM = STZ inyección (350 mg / dl), Control = inyección de solución salina
19 DM = STZ inyección (350 mg / dl), Control = inyección de solución salina
21 Cualquiera de realizar análisis de interés para los peces DM o proceder a hacer grupos de MM por la eliminación de la presión de STZ.
51 Amputar las aletas 30 días después de la última inyección de STZ de los controles, DM y grupos STZ a fin de generar tejido MM.
81 Re-amputar las aletas de todos los grupos en el tejido que se cultivan entre 51 y 81 días para realizar estudio de regeneración. Alternativamente tratar peces / tejido con el ensayo de interés.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

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Un modelo de pez cebra de la diabetes mellitus y la memoria metabólica
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Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

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