Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En zebrafisk Model af diabetes mellitus og Metabolic Memory

Published: February 28, 2013 doi: 10.3791/50232
Automatic Translation
1, 1, 2
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

Summary

Metabolic hukommelse er det fænomen, som diabetiske komplikationer fortsætter og fremskridt uhindret, selv efter euglykæmi opnås farmaceutisk. Her beskriver vi en diabetes mellitus zebrafisk model, som er enestående, fordi det giver mulighed for undersøgelse af de mitotisk overførbare epigenetiske komponenter af metabolisk hukommelse

Abstract

Diabetes mellitus øjeblikket påvirker 346 millioner individer, og dette forventes at stige til 400 millioner i 2030. Beviser fra både laboratoriet og store kliniske undersøgelser har afsløret, at diabetiske komplikationer fremskridt uhindret via fænomenet metabolisk hukommelsen, selv når glykæmisk kontrol er farmaceutisk opnås. Genekspression kan stabilt ændres gennem epigenetiske ændringer, som ikke kun tillader celler og organismer til hurtigt at reagere på ændrede miljømæssige stimuli, men også bibringe evnen af ​​cellen til at "huske" disse møder, når stimulus er fjernet. Som sådan er de roller, disse mekanismer spiller i den metaboliske hukommelse fænomen øjeblikket undersøges.

Vi har for nylig rapporteret om udviklingen af ​​et zebrafisk model af type I diabetes mellitus og karakteriseres denne model til at vise, at diabetisk zebrafisk ikke kun vise de kendte sekundære komplikationer, herunder de associerede ændringermed diabetisk retinopati, diabetisk nefropati og nedsat sårheling, men også udviser nedsat halefinne regenerering. Denne model er unik ved, at zebrafisk er i stand til at regenerere sin beskadigede bugspytkirtel og genoprette en euglykæmisk tilstand svarer til, hvad man kunne forvente hos post-transplantations menneskelige patienter. Desuden flere runder af halefinnen amputation muligt at udskille og undersøgelse af rene epigenetiske virkninger i et in vivo system uden potentielle komplicerende faktorer fra det foregående diabetisk tilstand. Selv euglykæmi opnås efter pankreatisk regenerering, den diabetiske sekundære komplikation ved fin regenerering og huden sårheling fortsætter uendeligt. I tilfælde af nedsat fin regenerering, er denne patologi bevares, selv efter flere runder af fin regenerering i datterdirektiverne finne væv. Disse observationer peger på en underliggende epigenetisk proces findes i den metaboliske hukommelse tilstand. Her præsenterer vi de nødvendige metoder for at kunne generate de diabetiske og metaboliske hukommelse grupper af fisk og diskutere fordelene ved denne model.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) er et alvorligt og voksende sundhedsproblem, som resulterer i nedsat levetid på grund af sygdom specifik mikrovaskulære (retinopati, nefropati, neuropati, nedsat sårheling) og makrovaskulære (hjertesygdomme og slagtilfælde) komplikationer 1. Når først, diabetiske komplikationer fortsat at gøre uafbrudt, selv når glykæmisk kontrol opnås 2,3, og dette fænomen er blevet betegnet metabolisk hukommelse eller arven virkning. Tilstedeværelsen af dette fænomen blev anerkendt klinisk i begyndelsen af 1990'erne som "The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" skred frem, og siden er blevet støttet af flere yderligere kliniske forsøg 4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Dyremodeller af DM har været afgørende for opdagelser relateret til patofysiologi af diabetiske komplikationer og metaboliske hukommelse. Faktisk blev de vedvarende diabetiske komplikationer første gang dokumenteret i en hundemodel af diabetiskeretinopati som siden er blevet støttet af flere linjer af eksperimentelle beviser ved hjælp af en række forskellige in vitro dyrkningssystemer og dyremodeller 15,16,17,18,19,20,21. Disse undersøgelser viser klart, at en første hyperglykæmiske periode resulterer i permanente abnormiteter (herunder afvigende genekspression) af målorganer / celler, og mekanistisk foreslår inddragelse af epigenome.

Epigenomes omfatte alle de chromatin modifikationer for en given celletype og er ansvarlige for en celle unikke genekspression profil. Kromosomet modifikationer er dynamiske under udvikling, support celledifferentiering, der reagerer på eksterne stimuli, er mitotisk nedarves stabilt 22,23 og kan ændres i sygdommen 24,25,26. Disse epigenetiske mekanismer omfatter: posttranslationelle histon modifikationer, ikke-kanonisk histon variant medtagelse i octomers, kromatin adgang ændringer gennem DNA-methylering, og gen-udtryk kontrol gennem ikke-kodende mikro RNA'er 27,28,29,30. Alt i alt epigenetiske processer tillade celler / organismer til hurtigt at reagere på skiftende miljømæssige stimuli 31,32,33, de også giver mulighed for at cellen kan "huske" disse møder, når stimulus er fjernet 23,22. Derfor som ændret genekspression profiler som følge af epigenetiske fremgangsmåder er stabile i fravær af signalet (e), der indledte dem og arvelige gennem celledeling, har de vundet stor interesse som underliggende molekylære mekanismer for humane patologier, herunder metabolisk hukommelse. De resultater, der dukker op i forbindelse med DM og epigenetik parallelle fremskridt på andre sygdomme, at en overflod af epigenetiske forandringer som følge af hyperglykæmi forårsager bemærkelsesværdige vedvarende ændringer i transkriptionelle netværk af celler (revideret i 34,35,36,37,38).

Det zebrafisk har længe været en premier model organisme til studerendedy hvirveldyr udvikling dog de ​​sidste 15 år har oplevet en eksponentiel vækst i anvendelse af denne organisme til studiet af sygdom hos mennesker. 39. Zebrafisk modeller af human sygdom er blevet fastlagt spænder over et bredt spektrum af humane sygdomme, herunder genetiske sygdomme og erhvervede sygdomme 40,41,42. De mange fordele ved zebrafisk over andre hvirveldyr modelorganismer omfatter høj frugtbarhed, korte generationstid, gennemsigtighed gennem den tidlige voksenalder, reducerede boligudgifter og en vifte af værktøjer til genmanipulation. Som følge af den omfattende bevaring af genetiske veje og cellulær fysiologi blandt hvirveldyr og evnen til at udføre high throughput lægemiddel-screening, er zebrafisk succes været anvendt til farmaceutiske opdagelser.

Vi har udviklet en voksen zebrafisk model af type I diabetes mellitus ved hjælp af diabetogene stof, streptozocin. Vi har karakteriseret denne model at vise, at diabetisk zebrafisk ikket kun vise de kendte humane sekundære komplikationer, men derudover svækkede lem regenerering (halefinne regenerering) udviser som følge af hyperglykæmisk miljø. Desuden har vi rapporteret, at hyperglykæmisk zebrafisk vende tilbage til normal glycemia inden for 2 uger fjerne lægemidlet på grund regenerering af endogene bugspytkirtlens betaceller resulterer i en fysiologisk normal glykæmisk tilstand. I modsætning, forbliver led regenerering i disse fisk nedsat i samme grad som i den akutte diabetiske tilstand angiver denne komplikation fortsætter og er modtagelige for metabolisk hukommelse. Den væsentligste drivkraft til generering af denne model var at tilvejebringe et system til at studere mitotisk stabile epigenetiske komponenter, der understøtter den metaboliske hukommelse fænomen i fravær af baggrundsstøjen i det foregående hyperglykæmiske miljø. Ved afslutningen af ​​protokollen i henhold her de zebrafisk og eller selektive væv kan behandles ved enhver analyse er egnet til researchers behov. Har vi med succes anvendt denne fremgangsmåde til at identificere de genom-dækkende vedvarende ændringer i DNA-methylering induceret af hyperglykæmi, der vedligeholdes i den metaboliske lagertilstand 21.

Vi føler, at dette zebrafisk model af type I diabetes mellitus har flere innovative fordele frem for andre modelsystemer for at undersøge metabolisk hukommelse. 1) Alle vores undersøgelser kan udføres in vivo, og som det tidligere hyperglykæmiske fiskene tilbage til euglykæmi ved regenerering af endogen insulinproduktion, kræver de ikke exogene insulininjektioner. Derfor er dette undgår komplicerende spidser og dale i glykæmisk kontrol, der kan forekomme i dyr, der kræver eksogen insulin. 2) Som beskrevet ovenfor er baggrunden stimulation fra det foregående diabetisk tilstand (dvs. den fortsatte tilstedeværelse af fremskreden glycosylering-slutprodukter og reaktive oxygenarter markører) elimineret, og derfor kan man undersøge rent epigenetic faktorer metabolisk hukommelse. 3) Forsøgene kan udføres hurtigt, som det tager cirka 80 dage fra diabetes induktion, indtil metabolisk memory undersøgelse. 4) halefinnen regenerering er eksperimentelt meget tilgængelig og giver mulighed for nem genetisk og eksperimenterende manipulation, hvor der er en bred vifte af værktøjer. 5) halefinnen regenerering giver en meget enkel og kvantificerbar metode til vurdering af metabolisk hukommelse og derfor vil muliggøre fremtidig lægemiddelopdagelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer udføres efter de retningslinjer, der er beskrevet i "Principles of Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikation no. 85-23, revideret 1985) og den godkendte Rosalind Franklin University Institutional Animal Care og brug Udvalg dyr protokol 08-19.

Der er to vigtige forkortelser, der anvendes i dette håndskrift. 1) DM: refererer til fisk, der er i en akut (300 mg / dl) hyperglykæmisk tilstand og har været det i mindst 3 uger. 2) MM: refererer til fisk, der var 21 dage (se protokol) DM fisk og får lov til at genoprette glykæmisk kontrol gennem bugspytkirtlen regenerering. Dette opnås inden (14) dage efter fjernelse af stoffet. Fiskene anses MM fisk fra dette punkt og fremefter. Det er også vigtigt at bemærke, at fisk, der omtales som kontrol, behandles på samme måde som DM eller MM fisk med hensyn til antallet af injektioner (saltvand alene), er inkubationstider på de forskellige temperaturer og antallet og timingenaf halefinnen amputationer.

1. Generering af zebrafisk med diabetes mellitus, DM Fish

  1. Forbered både genopretning og bedøvende vandtanke. Recovery vand er normalt fisk vand. For anæstetisk vand tilsættes tilstrækkelig 2-phenoxyethanol, således at en 1:1000 fortynding i normalt fisk vand er opnået.
  2. Der fremstilles en 0,3% opløsning (i et stinkskab) af streptozocin (STZ) ved tilsætning af 6 mg STZ til 2 ml 0,09% natriumchlorid og anbringes straks opløsningen på is. Dette vil give nok injektionsopløsning til injektion af cirka 20 fisk i 20 min. Hvis du overskrider de 20 minutter mærke, stoppe og gøre en frisk STZ løsning, før du fortsætter. I et separat rør aliquot tilstrækkelig saltopløsning til styring fisk. Når STZ solubiliseres alle efterfølgende trin kræver ikke stinkskab brug.
  3. Fyld en ½ cc sprøjte udstyret med en 27 1/2 gauge nål med STZ eller kontrol løsninger, der sikrer, at ingen luftbobler er fanget.
  4. Anesthetize hver fisk individuelt ved at placere fisk i narkose vand, og vente, indtil deres svømning bevægelse ophører (1-2 min).
  5. Når bedøvet kortvarigt placere fisken på et stykke køkkenrulle til at absorbere overskydende vand, skal du placere fisk i veje båd og måle massen af ​​fisken.
  6. Læg fisken på et fast underlag (petriskål låg) til injektion.
  7. Injicere STZ eller kontrolopløsning i bughulen på fiskene ved at indsætte nålen forbi den skrå kant i den bageste del af den ventrale peritoneum.
  8. 0,35 mg / g (350 mg / kg) af STZ bør leveres til hver fisk og volumen af ​​0,3% opløsning kræves, kan beregnes på følgende måde.
    1. Multiplicer masse af fisk (g) med 0,35 for at give mængden af ​​STZ i mg påkrævet.
    2. opdele produktet frembragt ovenfor med 3 til opnåelse af volumenet af 0,3% opløsning, der kræves til injektion i pi.
      Prøve: For en 0,5 g fisk: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) .0175 / 3 = 0,058 ml= 58 pi.
      Det samme volumen uden STZ ville blive injiceret i en kontrol fisk. Et ark for mængder til injektion per fisk masse skal genereres og anvendes til hurtig reference.
  9. Efter indsprøjtning placere fisk i recovery vandtanken og overvåge dem for normal svømning aktivitet. Når dette er blevet opnået fiskene overføres til en normal living tank, der holdes ved den reducerede temperatur på 22 ° C - 24 ° C. Denne reducerede temperatur er kritisk for effektiv induktion af hyperglykæmi (diabetes mellitus, DM).
  10. Selv hyperglykæmi detekteres inden for 24 timer fra den første indsprøjtning, for at inducere en forlænget tilstand af meget høj hyperglykæmi den zebrafisk kræver en hyppig injektion induktionsfasen efterfulgt af ugentlige vedligeholdelse injektioner som vist nedenfor.

Uge 1: 3 injektioner (dag 1, 3, 5), Uge 2: 1 injektion (dag 12), Uge 3: 1 injektion (dag 19),
Uge 4: (Day 21) Udførassay af interesse.

På dette tidspunkt zebrafisk anses for at have været i en forlænget tilstand af hyperglykæmi og udviser de diabetiske komplikationer af retinopati, nefropati og også nedsat fin regenerering. Disse betegnes som DM fisk. Derudover hvis det ønskes fisken kan opretholdes i hyperglykæmisk tilstand med ugentlige vedligeholdelse injektioner. Ca. 5% død under denne proces bør forventes.

2. Blod Indsamling og fastende blodsukker niveau (FBGL) Bestemmelse

  1. Hver gruppe af DM og kontrol fisk skal indeholde fisk nok til præcist at bestemme den gennemsnitlige FBGL af gruppen som denne analyse kræver disse fisk skal ofres.
  2. Der fremstilles en mærket PCR-rør for hver blodprøve indeholdende 5 ul sterilt normalt saltvand.
  3. For blodtapning, fisk bedøver som ovenfor, skal du fjerne alt vand, skal du placere fisken på et objektglas og ved hjælp af en skalpel, fjerne hovedet af fiskenved bunden af ​​Laag.
  4. Opsaml blod (op til 2 ul), som frigives fra fisken på objektglasset og hurtigt at tilføje den til 5 pi sterilt normalt saltvand pipettering op og ned for at sikre, at blodet ikke tilstoppes. Umiddelbart placere prøven på is.
  5. Bestemme blod prøvevolumen ved at måle det totale volumen af ​​væske (saltopløsning + blod) og derefter trække ud af 5 pi af saltvand.
  6. Overfør 5 pi af den fortyndede blod fra hvert PCR-rør i et 1,5 ml mikrofugerør og bestemme blodglucosekoncentrationen hjælp af QuantiChrome Glucose Assay Kit. Dette udføres ved at følge fabrikantens protokol uden undtagelse. Forventede resultater: normal / kontrol fisk 60 mg / dl og DM fisk 310 mg / dl.

3. Halefinnen Regeneration Studies

  1. Bedøve fisk som beskrevet i 1,0-1,4.
  2. Sted fisk på en petriskål låg og amputere halefinnen i en lige linie under anvendelse af en steril størrelse10 skalpel proksimalt i forhold til den første lepidotrichia forgreningspunktet under visning finnen gennem et dissektionsmikroskop.
  3. Tillader fisk at inddrive så i 1,10 men placere fisken ved 33 ° C i den regenerative vækstfase af assayet. Dette er en etableret temperatur for accelereret fin regenerering analyse.
  4. Finnerne kan afbildes som helst efter amputation vi imidlertid rutinemæssigt undersøge den regenerative vækst ved 24, 28 og 72 timer efter trans-sektion.
  5. Bedøve fisk som før (se 1,0-1,4), placer fisken under et dissektionsmikroskop udstyret med et kamera (vi bruger et Nikon SMZ-1500 er udstyret med en Q-imaging Camera) og indsamle alle fin billeder ved 1X forstørrelse med NIS elementer software . Finnen skal spredes til billeddannelse, således at den er fuldt udstrakt uden at strække eller beskadige vævet og bør være fri for vanddråber. For konsekvens altid placere den dorsale side til højre.
  6. Udskriv billeder og måle regenerative Growth område ved hjælp af billedet J software og anvendelsen af ​​en tegning pad. Spore langs hele området for ny vækst og bestemme området. Hver måling bør gøres fem gange og gennemsnittet for at sikre nøjagtigheden af ​​sporing. Det er vigtigt, at de anvendte billederne ikke har skygger eller vanddråber idet disse bidrager til fejl i måling af udvæksten området.
  7. Måle længden af ​​amputation sted langs dorsal-ventral-aksen og opdele området bestemt i 3,6 ved denne måling. Dette tillader fisk af forskellige størrelser skal sammenlignes direkte.

4. Generering af Metabolic Memory (MM) zebrafisk

  1. Indled en gruppe af DM fisk og deres passende kontrol som beskrevet i afsnit 1.
  2. Med 21 dages bestemme FBGL for en delmængde af gruppen og opdele DM fisk i 2 undergrupper. Fortsat ugentligt STZ injektioner for en af ​​de grupper som DM kontroller for eksperimentets varighed. Ophøre STZ injektion til den anden gruppe og incubate fisken ved normal temperatur. Inden 14 dage disse zebrafisk vil genoprette normale blod insulin og glucose kontrol via bugspytkirtlen regenerering. Disse fisk kaldes nu MM (metabolisk hukommelse fisk).
  3. På dag 30 efter fjernelse af stoffet amputere de caudale finner af kontrol, DM og MM fisk via fremgangsmåden beskrevet i 3.2.
  4. Retur fisk til normale vandforhold for fin regenerering i 30 dage. Dette giver mulighed for vækst i det, vi kalder, metabolisk hukommelse væv.
  5. På dag 60 udføre en anden amputation (som beskrevet i 3.2) i vævet, som blev regenereret i perioden 30 til 60 dage og udføre halefinnen regenerering assay (3,1-3,7) Figur 1.
  6. Isoler væv og udføre analyse af interesse. Se Tabel 1 for en protokol resumé.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Type I diabetisk zebrafisk ikke kun vise de kendte sekundære komplikationer af retinopati og nefropati, men også udviser en yderligere komplikation: nedsat halefinne regenerering. Denne senere komplikation fortsætter skyldes metabolisk hukommelse i fisk, der har gendannet normal blodsukkerregulering efter en hyperglykæmisk periode. I figur 2A (kontrol) og Figur 2B (metabolisk hukommelse) repræsentative billeder af regenererende finner, der blev fanget ved 72 timer efter amputation præsenteres. Underskuddet kan kvantificeres og som vist i figur 2C DM og MM zebrafisk udviser et underskud på omkring 40% på 72 timer sammenlignet med kontrolpatienter fisk. Selv om de data, som indgår i figur 2C slutter på 90 dage denne samme nedskrivninger er blevet observeret så langt ude som 150 dage.

Tabel 1. Protokol Summary.

Figur 1
Figur 1. Cartoon afbilder amputation sites for metaboliske hukommelse eksperimenter. Den blå farve repræsenterer væv, der blev udsat for den tidligere hyperglykæmisk tilstand. Den grønne farve indikerer det væv, der blev vokset fra 30-60 dage efter hyperglykæmi. Den sorte stiplede linje angiver den første amputation sted på dag 30 og den røde viser et potentielt amputation site, der ville forekomme i 60 dage.

Figur 2
Figur 2. Halefinnen Regeneration reduceres i Diabetic (DM) og Stofskifte Memory (MM) zebrafisk. A. Et repræsentativt halefinnen billede fra en kontrol injiceret fisk viser en normal mængde af regenerative vækst 72 timer efter amputation. Den hvide stiplede linie repræsenterer amputation plan og den lyserøde optrukne linie demarks den regenerative udvækst. Mængden af regenerering bestemmes ved at spore området indeholdt i pink og hvide linier delt med længden af den hvide streg at normalisere fin størrelse forskelle. B. Et repræsentativt halefinne billede fra enten DM eller MM illustrerer en reduceret mængde regenerative vækst 72 timer efter amputation. De linjer og arealet er de samme som for panel A. C. Grafisk præsentation af den relative regenereringen af DM og MM zebrafisk sammenlignet med kontroller. Den relative procentdel (til kontrol på 100%) af DM og MM zebrafisk regenerative udvækst på 72 timer er vist. Tiden i afbildede dage er i forhold til da STZ administration blev standset for den metaboliske hukommelse gruppe. Disse data hvor generere af flere forskere og indarbejde over 1.000 fisk per gruppe. <strong> Figur 2A og 2B blev tilpasset med tilladelse fra Olsen et al 43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Diabetes mellitus er en sygdom i metabolisk dysregulation, først diagnosticeret som hyperglykæmi, der til sidst resulterer i beskadigelse af blodkar, der fører til mange komplikationer som alle fortsætter selv efter euglykæmi opnås selvom farmaceutisk intervention. Denne vedvarende komplikationer kaldes metabolisk hukommelse og flere nylige studier har undersøgt den rolle, epigenetiske mekanismer spille på dette fænomen. Her har vi beskrevet en protokol, der giver mulighed for generering af både akut diabetiske og metabolisk hukommelse (genoprettet glukosekontrol) zebrafisk. Vi yderligere beskrevet den metode, der kan anvendes til at adskille epigenetiske bidrag fra de potentielt komplicerende komponenterne i den tidligere diabetisk tilstand. Vi vil gerne understrege, at fisk kan undersøges på ethvert punkt med nogen analyse af interesse for særlige forsker og derfor downstream-applikationer for fremtidig opdagelse er uendelige.

There er flere trin i den protokol, som fortjener nogle yderligere diskussion og vægt. Det er vores erfaring på 0,3% STZ i opløsning forringes og mister sin effektivitet efter cirka 20 minutter. Derfor foreslår vi, at en timer skal anvendes, og en frisk opløsning foretages med 20 minutters intervaller. Under vores første forsøg på at generere diabetisk zebrafisk vi kun ved hjælp af en indsprøjtning i løbet af den første uge og havde succes med omkring 40% af fiskene. Som sådan er der ikke et strengt krav til tre injektioner, men når tre er udført succesrate over 95%. For det andet, når injektionen STZ i zebrafisk er det vigtigt, at nålen er indsat således, at affasningen af ​​nålen er helt inde i fisken for at tillade korrekt dosering af opløsningen, dog skal der udvises forsigtighed, at den ikke trænger for langt til forhindre indre skader. Når STZ eller kontrolopløsning administreres fisken inkuberes ved en reduceret temperatur (22 ° C - 24 og df. eks C). Vi kan ikke over understrege vigtigheden af ​​den reducerede temperatur som uden den zebrafisk vil regenerere deres betaceller (STZ injiceret) og hyperglykæmi kan ikke effektivt induceret. Endelig i vores hænder zebrafisk blodpropper meget hurtigt, som forhindrer den nødvendige kapillarvirkning kræves til effektiv glucometer brug, og derfor har vi ikke går ind for deres anvendelse. Vi har fundet, at QuantiChrome beskrevne assay ikke kun den mest pålidelige, men det letteste at udføre og at undervise laboratoriepersonalet. Kollektivt teknikkerne beskrevet i protokollen, er ikke svært, og hvis de rette forholdsregler er truffet med de ovenfor beskrevne trin genereringen af ​​diabetisk zebrafisk er alle, men forsikrede.

Der er meget få begrænsninger i den procedure, der er beskrevet i dette manuskript, men alle lægemiddelinduceret modeller af sygdom altid har kritikken af ​​off target effekter rejst mod dem. Vi henviser læseren til vores indledende manuskript detailing denne model som vi gav 5 uafhængige linjer af beviser (herunder direkte STZ injektion i finner), der dokumenterer, at der ikke er nogen forbi mål effekter af STZ 43. En anden potentiel begrænsning kommer ikke fra selve proceduren, men fra det faktum, at reagenser til zebrafisk forskning endnu ikke er på niveau med andre modelorganismer, såsom mus. Heldigvis da zebrafisk bliver i stigende grad brugt som en model organisme for human sygdom denne mangel bliver hurtigt afhjulpet.

Sammenfattende som beskrevet i indledningen til zebrafisk model for diabetes mellitus er beskrevet her, har flere fordele frem for andre modelorganismer. Vigtigt er det, det giver mulighed for undersøgelse af de rent epigenetiske komponenter, der understøtter den metaboliske hukommelse fænomen. Da det forventes, at 400 millioner mennesker vil blive ramt af denne lidelse vi føler, at bidraget fra forsøg, hvori denne model kan have betydelig indvirkning på menneskers sundhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en forskningsbevilling fra Iacocca Family Foundation, Rosalind Franklin University nystartede fonde, og National Institutes of Health Grant DK092721 (til RVI). Forfatterne vil gerne takke Nikki Intine om støtte i manuskriptet forberedelse.

Materials

DAY PROCEDURE
1
3 DM = STZ Injection (350 mg / dl), Control = saltvandsindsprøjtning
5 DM = STZ Injection (350 mg / dl), Control = saltvandsindsprøjtning
12 DM = STZ Injection (350 mg / dl), Control = saltvandsindsprøjtning
19 DM = STZ Injection (350 mg / dl), Control = saltvandsindsprøjtning
21 Enten udføre analyse af interesse for DM fisk eller fortsætte med at foretage MM grupper ved fjernelse af STZ pres.
51 Amputere Fins 30 dage efter sidste STZ injektion af kontrol, DM og STZ grupper med henblik på at generere MM væv.
81 Re-amputere finner af alle grupper i det væv, der blev dyrket mellem dag 51 og 81 til at udføre regenerering undersøgelse. Alternativt behandle fisk / væv med assayet af interesse.
Name Company Catalog Number Comments
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (size 10) Fisher Scientific 089275A
Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose assay kit. Bioassay Systems DIGL-100
Sodium Chloride Sigma Aldrich S3014
Dissecting Microscope Nikon TMZ-1500 Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging Nikon Q imaging Any camera is suitable.
Image J software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Any imaging software is suitable.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brownlee, M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes. 54, 1615-1625 (2005).
  2. Ihnat, M. A., Thorpe, J. E., et al. Reactive oxygen species mediate a cellular 'memory' of high glucose stress signalling. Diabetologia. 50, 1523-1531 (2007).
  3. Ceriello, A., Ihnat, M. A., Thorpe, J. E. Clinical review 2: The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications. J. Clin. Endocrinol. Metab. 94, 410-415 (2009).
  4. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. The Diabetes Control and Complications Trial Research Group. N. Engl. J. Med. 329, 977-986 (1993).
  5. Turner, R. C., Cull, C. A., Frighi, V., Holman, R. R. Glycemic control with diet, sulfonylurea, metformin, or insulin in patients with type 2 diabetes mellitus: progressive requirement for multiple therapies (UKPDS 49). UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group. JAMA. 281, 2005-2012 (1999).
  6. Gaede, P. H., Jepsen, P. V., Larsen, J. N., Jensen, G. V., Parving, H. H., Pedersen, O. B. The Steno-2 study. Intensive multifactorial intervention reduces the occurrence of cardiovascular disease in patients with type 2. 165, 2658-2661 (2003).
  7. Holman, R. R., Paul, S. K., Bethel, M. A., Matthews, D. R., Neil, H. A. 10-year follow-up of intensive glucose control in type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 359, 1577-1589 (2008).
  8. Nathan, D. M., Cleary, P. A., et al. Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes. N. Engl. J. Med. 353, 2643-2653 (2005).
  9. Retinopathy and nephropathy in patients with type 1 diabetes four years after a trial of intensive therapy. The Diabetes Control and Complications Trial/Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications Research Group. N. Engl. J. Med. 342, 381-389 (2000).
  10. Ismail-Beigi, F., Craven, T., et al. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial. Lancet. 376, 419-430 (2010).
  11. Duckworth, W. C., McCarren, M., Abraira, C. Glucose control and cardiovascular complications: the VA Diabetes Trial. Diabetes Care. 24, 942-945 (2001).
  12. Skyler, J. S., Bergenstal, R., et al. Intensive glycemic control and the prevention of cardiovascular events: implications of the ACCORD, ADVANCE, and VA diabetes trials: a position statement of the American Diabetes Association and a scientific statement of the American College of Cardiology Foundation and the American Heart Association. Diabetes Care. 32, 187-192 (2009).
  13. Riddle, M. C. Effects of intensive glucose lowering in the management of patients with type 2 diabetes mellitus in the Action to Control Cardiovascular Risk in Diabetes (ACCORD) trial. Circulation. 122, 844-846 (2010).
  14. Patel, A., Macmahon, S., et al. Intensive blood glucose control and vascular outcomes in patients with type 2 diabetes. N. Engl. J. Med. 358, 2560-2572 (2008).
  15. Engerman, R. L., Kern, T. S. Progression of incipient diabetic retinopathy during good glycemic control. Diabetes. 36, 808-812 (1987).
  16. Hammes, H. P., Klinzing, I., Wiegand, S., Bretzel, R. G., Cohen, A. M., Federlin, K. Islet transplantation inhibits diabetic retinopathy in the sucrose-fed diabetic Cohen rat. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2092-2096 (1993).
  17. Kowluru, R. A. Effect of reinstitution of good glycemic control on retinal oxidative stress and nitrative stress in diabetic rats. Diabetes. 52, 818-823 (2003).
  18. Kowluru, R. A., Chakrabarti, S., Chen, S. Re-institution of good metabolic control in diabetic rats and activation of caspase-3 and nuclear transcriptional factor (NF-kappaB) in the retina. Acta Diabetol. 41, 194-199 (2004).
  19. Roy, S., Sala, R., Cagliero, E., Lorenzi, M. Overexpression of fibronectin induced by diabetes or high glucose: phenomenon with a memory. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 404-408 (1990).
  20. Li, S. L., Reddy, M. A., et al. Enhanced proatherogenic responses in macrophages and vascular smooth muscle cells derived from diabetic db/db mice. Diabetes. 55, 2611-2619 (2006).
  21. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. , (2012).
  22. Dolinoy, D. C., Jirtle, R. L. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ. Mol. Mutagen. 49, 4-8 (2008).
  23. Morgan, D. K., Whitelaw, E. The case for transgenerational epigenetic inheritance in humans. Mamm. Genome. 19, 394-397 (2008).
  24. Ho, L., Crabtree, G. R. Chromatin remodelling during development. Nature. 463, 474-484 (2010).
  25. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat. Genet. 33, 245-254 (2003).
  26. Jirtle, R. L., Sander, M., Barrett, J. C. Genomic imprinting and environmental disease susceptibility. Environ. Health Perspect. 108, 271-278 (2000).
  27. Blomen, V. A., Boonstra, J. Stable transmission of reversible modifications: maintenance of epigenetic information through the cell cycle. Cell Mol. Life Sci. , (2010).
  28. Bogdanovic, O., Veenstra, G. J. DNA methylation and methyl-CpG binding proteins: developmental requirements and function. Chromosoma. 118, 549-565 (2009).
  29. Mosammaparast, N., Shi, Y. Reversal of histone methylation: biochemical and molecular mechanisms of histone demethylases. Annu. Rev. Biochem. 79, 155-179 (2010).
  30. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
  31. Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Beedle, A. S. Non-genomic transgenerational inheritance of disease risk. Bioessays. 29, 145-154 (2007).
  32. Bjornsson, H. T., Fallin, M. D., Feinberg, A. P. An integrated epigenetic and genetic approach to common human disease. Trends Genet. 20, 350-358 (2004).
  33. Whitelaw, N. C., Whitelaw, E. Transgenerational epigenetic inheritance in health and disease. Curr. Opin. Genet. Dev. 18, 273-279 (2008).
  34. Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetic mechanisms in diabetic vascular complications. Cardiovasc. Res. , (2011).
  35. Villeneuve, L. M., Reddy, M. A., Natarajan, R. Epigenetics: deciphering its role in diabetes and its chronic complications. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 38, 401-409 (2011).
  36. Pirola, L., Balcerczyk, A., Okabe, J., El-Osta, A. Epigenetic phenomena linked to diabetic complications. Nat. Rev. Endocrinol. 6, 665-675 (2010).
  37. Cooper, M. E., El-Osta, A. Epigenetics: mechanisms and implications for diabetic complications. Circ. Res. 107, 1403-1413 (2010).
  38. Intine, R. V., Sarras, M. P. Jr Metabolic Memory and Chronic Diabetes Complications: Potential Role for Epigenetic Mechanisms. Curr. Diab. Rep. , (2012).
  39. Amsterdam, A., Hopkins, N. Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease. Trends Genet. 22, 473-478 (2006).
  40. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
  41. Mandrekar, N., Thakur, N. L. Significance of the zebrafish model in the discovery of bioactive molecules from nature. Biotechnol. Lett. 31, 171-179 (2009).
  42. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J. Biomed. Biotechnol. 2012, 817341 (2012).
  43. Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb regeneration is impaired in an adult zebrafish model of diabetes mellitus. Wound. Repair Regen. 18, 532-542 (2010).

Tags

Medicin Genetics Genomics fysiologi anatomi Biomedical Engineering Metabolomics zebrafisk diabetes metabolisk hukommelse vævsregeneration streptozocin epigenetik, Dyremodel diabetes mellitus diabetes lægemiddelopdagelse hyperglykæmi
En zebrafisk Model af diabetes mellitus og Metabolic Memory
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras… More

Intine, R. V., Olsen, A. S., Sarras Jr., M. P. A Zebrafish Model of Diabetes Mellitus and Metabolic Memory. J. Vis. Exp. (72), e50232, doi:10.3791/50232 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter