Summary
כאן אנו מתארים מבחן העדפת אור בחושך לזחל דרוזופילה. assay זה מספק מידע על רגולציה מולדת ויממה של photobehavior חישה ועיבוד אור.
Abstract
מעשי אור כאות סביבתית לשלוט בהתנהגות בעלי חיים ברמות שונות. מערכת העצבים תסיסנית הזחל משמשת כמודל ייחודי כדי לענות על שאלות בסיסיות על האופן בו מידע מעובד ואור משותף בין התנהגויות מהירות ויממה. זחלים תסיסנית להציג התנהגות הימנעות סטריאוטיפית בעת חשיפה לאור. כדי לחקור התנהגויות האור תלויות יכולות להיות מיושמות בדיקות בכורה אור כהות comparably פשוטות. בבעלי חוליות ופרוקי רגלי המסלולים העצביים המעורבים בחישה ועיבוד תשומות חזותיות חופפים באופן חלקי עם מידע היממה photic אלה עיבוד. השאלה המרתקת של איך מערכת חישת האור ומערכת היממה אינטראקציה כדי לשמור על תפוקות התנהגות מתואמות נשארה במידה רבה שלא נחקר. דרוזופילה היא מודל משפיע ביולוגי לגשת לשאלות אלה, בשל מספר קטן של תאי עצב במוח ובזמינות של כלים גנטיים לmanipul העצביation. Assay העדפת אור האפל הציג מאפשר החקירה של מגוון רחב של התנהגויות חזותיות כולל בקרה ביולוגי של Phototaxis.
Introduction
כאן אנו מתארים assay התנהגותית המבוסס על העדפת הזחל לכהה (או בהיר). זחלים להגיב עם תגובת photonegative חזקה וסטריאוטיפית בשלבי ליקוט (L1 לתחילת L3) 1. Assay נועד להעריך את התנהגות photophobic של הזחל ומשווה את ההעדפה בהירה או כהה של קבוצה של זחלים לנוע בחופשיות בצלחת פטרי מצופה באגר. assay התנהגותי זה מספק מידע על רגישות, אינטגרציה וזמן הפלסטיות של מערכת הראייה לא רק, זה עוד יותר מספק רמזים על איך רגישות לאור והתהליך שלה נשלט על ידי מערכת היממה.
עין הזחל דרוזופילה (Bowlig איברים מכונים גם: BO), היא האיבר העיקרי לתפיסת אור. כל עין מורכבת מקולטנית אור 12 (PR), שמונה הפורטוריקנים להביע rhodopsin6 הירוק רגיש (RH6) וארבעה הפורטוריקנים להביע rhodopsin5 הכחול הרגישים (rh5) 2,3. בנוסף לPRS, alsנוירונים o Class IV multidendritic, אשר מכסים את קיר גוף הזחל, זוהו להגיב לעוצמות אור רעילים 4,5. כמו כן, ידוע כי נוירונים קוצבים לב הנמצאים במוח הזחל המרכזי להביע רגיש חלבון Cryptochrome האור (Cry) שפועל כחיישן אור כחול שעון פנימי בתוך המוח 6,7. מסקרן photophobicity של בעלי חיים מסוג בר מציג מרכיב ביולוגי בנקודות זמן שונות במהלך היום ובלילה בעת בדיקה עם assay זה. תגובות לאור של זחל L3 ליקוט הראו photophobicity החזק עם שחר וphotophobicity נמוך יותר בשעה בין הערביים, כאשר נבדקו על העדפת אור בחושך 7. מעניין רק Rh5-הפורטוריקנים נדרשים להימנעות אור, ואילו RH6-הפורטוריקנים הם מיותר. שניהם, Rh5-הפורטוריקנים וRH6-הפורטוריקנים מעורבים באיפוס השעון המולקולרי על ידי אור 8. מסלול Cry חייב להיות מתואם עם מסלולי אור חישה-האחרים לתזמר פלט התנהגותי מתאים בבמהלך היום. אצטילכולין בהפורטוריקנים ממלא תפקיד חיוני בהתנהגות הימנעות אור, כמו גם מחדירה של השעון המולקולרי. חסימה עצבית אצטילכולין מהפורטוריקנים לנוירונים קוצב היממה מפחיתה את תגובת photophobic בassay העדפת אור החושך 8. העסקתו assay, שני זוגות סימטריים של נוירונים שזוהו לאחרונה כדי לעבור את העדפת האור של הזחל instar השלישי של דרוזופילה 9. שני זוגות אלו של נוירונים ניתן לתפקד בשלבי זחל מאוחרים, כאשר בעלי חיים להשאיר את האוכל למצוא אתר מתאים pupariation ככל הנראה. עם זאת, השאלה של איך את מסלולי ויזואליים אינטראקציה ולשלוט בהתנהגות חזותית הזחל באופן היממה נותרה במידה רבה ללא מענה. Assay העדפת האור מאפשר השוואות בין נקודות זמן היממה, לטוס קווים ומדינת היממה תחת איכויות אור שונות. Assay הוא קלות מוכן ולא יקר וכבר שימושי בעבר אניn כמה מעבדות לתאר וללמוד את ההתנהגות נגזרת אור בזחל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גידול הזחל
- שמור לטוס זנים או צלבים גנטיים בתרבות המונים של 25 מעלות צלזיוס במדיום קמח תירס תחת אור של 12 שעות מחזור של 12 שעות חשכה בזבוב חממה מצויד באור ושעון עצר.
- לדלל שמרי תומכת במים ליצירת עיסה נוזלית (10 גרם של שמרי תומך מדוללים עם 3-4 מ"ל מזוקק H 2 O). הוסף טיפה קטנה למזון קמח התירס ולכסות את הבקבוקונים. בואו יבש לשעה אחת לפחות, כדי למנוע זבובים בוגרים דבק דבק השמרים. לשים טיפה קטנה של שמרים מדוללים במים על פני השטח של המזון יכול לשפר את ההטלה. לחלופין, ניתן להשתמש בייקר שמרים להדביק, 20% חומצה אצטית (AcOH) (סיגמה אולדריץ, שוויץ A6283-100 מ"ל). לשם כך, טובל את הקצה של Q-טיפ על הפתרון והמרווח על פני שטח מזון קמח התירס.
- שים זבובים בוגרים (לפחות ארבעה ימים, אך לא יותר מעשרה ימים) בבקבוקוני מזון קמח תירס. שים מספיק מבוגרים לכל בקבוקון על מנת לקבל זחלים מספיק כדי לחזור על ההעדפהלבדוק כמה פעמים ולאפשר השוואה סטטיסטית. לצלבים גנטיים, אנו משתמשים בדרך כלל למינימום של 20 נקבות וזכרים 5-10 לכל בקבוקון, אבל כמה קווים דורשים יותר נקבות כדי להשיג צאצאי הזחל מספיק.
- אפשר למבוגרים להטיל ביצים ל12 שעות ולהעבירם לבקבוקונים חדשים. ניתן להעביר מבוגרים בבוקר ובערב. אנחנו בדרך כלל להעביר את המבוגרים במשך שבעה עד עשרה ימים, ואם נדרשו לקחת מבוגרים חדשים.
- שמור את אוספי הביצים שנלקחו בכל שעה 12 בחממה ולתת לגדול זחלים של 25 מעלות צלזיוס, חושך מחזור של 12 שעות אור 12 שעות ו 60% לחות. לבדיקת רכיבי היממה של זחלים חזותיים התנהגות מעבר לחשכה מתמדת (DD) 48 שעות לאחר איסוף ביצים (מקביל לשני מחזורי האור כהים). לשם כך, השתמש בחממה נפרדת בלי אור אבל לשמור על כל תנאים אחרים, כגון טמפרטורה ולחות זהה. הקפד להעביר את הבקבוקונים לחממת DD ממש לפני המעבר לשלב הכהה. לפני שעבר את הבקבוקונים לanothאה חממה לשים בקבוקונים בקופסא קרטון או לעטוף את הבקבוקונים עם רדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור במהלך ההעברה (אריזה בקופסא קרטון או עטיפה שצריך לעשות בזמן "כיבוי האורות בשלב" לפני המשמרת בין חממות). למנוע את בעלי חיים מכל חשיפה לאור לאחר נקודה זו ועד תחילת ניסויים.
- לאחר 4 ימים (84-108 שעות מהטלה) לאסוף מוקדם L3 (זחלי האכלה) בנקודות הזמן שנבדקה (ראה 4. אור העדפת בדיקה, נקודה. 4.4.).
2. התקנת מבחן
- לבצע ניסויים בחדר חשוך עם טמפרטורה קבועה ותנאי לחות.
- כדי לשמור על שני רביעים של צלחת פטרי בחושך, לכסות את המכסה עם סרט שחור ורדיד אלומיניום. כדי לעשות זאת, סמן את מרכז היקף המכסה. גם לסמן ארבע נקודות בגבול של המכסה עם 90 מעלות של הפרדה ביניהם. כדי לעשות את זה קל יותר, לצייר ריבוע 20 ס"מ מחולק לארבעה רבעים באורך 10 ס"מ עלגיליון נייר או בעזרתו של מחשב. לחתוך 10 ס"מ ריבועים של נייר אלומיניום וסרט שחור (איור 1 א). לכסות שני רביעים ההפך על ידי הדבקה של רדיד אלומיניום רבוע, כשכבה ראשונה וסרט שחור מכסה אותו, יש להיזהר גם כדי לכסות את הגבול של המכסה.
בעבר שתי צורות מעט שונות של מבחני זה היו בשימוש. אנחנו כאן שימוש assay "רבע הצלחת", שבו צלחת פטרי מחולקת לארבעה רבעים שווים 10. ב assay האלטרנטיבי "חצי הצלחת" צלחת פטרי מחולקת חצי (חצי נחשף לאור, בחשכה) 1,7,8. עד היום לא נמצא הבדלים משמעותיים בין שני מבחני כבר פורסם. - דבק גיליון רבע כגון זה המשמש לסימון את המכסים ממש מתחת למקור האור על השולחן. סמן היקף של צלחת פטרי התרכזה בצומת הרביעים. השתמש בסימנים כהתייחסות למקום את צלחת המבחן תמיד באותה התנוחה מתחת למקור האור.
- התקןמנורה, או הנורה פשוט אור לבן (פיליפס, Softtone 5W) או מנורת LED (מנורת LED, 80012 הלבנה, Osram) מעל צלחת פטרי עם העזרה של דוכן תמיכת ברזל (פישר סיינטיפיק, S47808). התאם את הגובה באופן שכל מבחן הצלחת מוארת homogenously. אנו ממליצים בחום על השימוש בנורות LED שכן הם פולטים אורכי גל מסוימים יותר מנורות רגילות. יתר על כן נוריות פולטות פחות חום.
- התאם את עוצמת אור בעזרת פוטומטר (סביבת מד PCE EM882). כדי להשיג את עוצמת האור הנדרשת של 350-760 לוקס, להזיז את המנורה כלפי מעלה או מטה בהתאם לצורך. חיבור המנורה לאספקת חשמל מתכווננת נותן יותר גמישות לשנות את העוצמות מבלי להזיז את המנורה (איור 1).
3. הכנת צלחות
- לעשות 200 מ"ל של 2.5% אגר (סיגמא אולדריץ, שוויץ A5093-500G) עם מים מזוקקים פעמיים (Millipore).
- הנח צלחות פטרי על שולחן (90 מ"מ קוטר;גריינר ביו אחד GmbH, 4550 Kremsmeinster, אוסטריה) בשורות כדי לאפשר לשפוך חם agarose.
- מרתיחים את agarose במיקרוגל עד שהפתרון הוא שקוף לחלוטין ונוזלים. ודא שתמיסה נוזלית אינו מכילה בועות. זהירות: תחבורה בזהירות לשולחן מאז הפתרון יכול להיות חם מאוד!
- יוצקים חם agarose לתוך צלחות פטרי עד שכל המשטח מכוסה homogenously עם שכבה דקה של הפתרון, על שתיים או שלושה מילימטרים הם מספיק. להיות מהיר כדי למנוע agarose חיזוק לפני הציפוי את כל הצלחות. בואו הצלחות להתקרר. אחסן את הצלחות בטמפרטורת חדר ולהשתמש בם רק באותו היום של הכנה.
4. מבחן זיקה לאור
- לעבוד בתנאי אור אדומים בחדר הניסוי כדי למנוע השפעת האור לפני המבחן מאז תסיסנית אינו מסוגל לחוש אורכי גל של אור אדום. השתמש בנורה אדומה (פיליפס, PFE712E * 8) עלתה במנורה כדי להאיר לאהוא מקום העבודה.
- לשמור על טמפרטורה בכל הניסויים של 25 ° C. טמפרטורת חדר בקרה באמצעות מכשיר חימום או קירור במידת צורך.
- קח קצת אוכל מהבקבוקונים שגדלו לשני מחזורי יום תחת חשכה מתמדת (מסעיף 1). מאז זחלים בדרך כלל חופרים על פני השטח של המזון, לקחת את השכבה העליונה (כ -5 מ"מ עמוק) עם עזרה של מרית (פישר סיינטיפיק, 14-373-25A). מורחים את האוכל בצד החיצוני של המכסה צלחת פטרי, להוסיף קצת מים ומערבבים בעדינות בעזרת המרית.
- לאסוף האכלת זחלי L3 ממזון. כהעדפת אור תיבחן, בחירה רק בתחילת / האכלת זחלי L3 הוא קריטי מאז Phototaxis השלילי מובטח. מאוחר / נדודי זחלי L3 או זחל גדול זוחלים על האוכל כנראה כבר עבר photobehavior שלהם. יכולים להיות מוכרים זחלי L3 האכלה (phototactic השלילי) כי spiracles הקדמי שלהם הם פתוח ובלט החוצה בצורה דמוית אצבע. Spiracle האחורייש שלושה פתחים של כל אחד, וארבע קבוצות של שערות מסועפות גדולות. בלוטות הרוק להאריך למגזר השני 11 הבטן. Staging זחל תחת מיקרוסקופ הוא נוח ואילו אמור לשמש לא אור לבן. מנורת אור אדומה היא הכרחית כדי להאיר את הזחלים אם זמני תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי לפני נדרשים ניסויים.
- שטוף זחלים בקצרה במים ברז ולאסוף זחלים שלישי instar-האכלה המוקדמת (עדיין באור אדום). לפני העברת הזחלים לצלחת הבדיקה, לקחת את הזחלים עם מכחול רטוב ולספוג עודפי מים בזהירות במגבת נייר או נייר סינון. לא לייבש יתר על המידה זחלים מדי שכן הוא עלול לפגוע בבעלי החיים ולהשפיע על התנהגותו.
- באמצעות המכחול הרטוב להעביר את הזחלים בזהירות לצלחות. הנח קבוצה של כ 30 זחלים במרכז הצלחת. מכסה את הצלחת עם המכסה כבר מוכן עם הרבעים והניח את הצלחת מתחת למקור האור מוכן לניסוי (ראה שניותtion 2).
- הדלק את מנורת האור הלבנה ולהתחיל את הטיימר. תן את הזחל לנוע בחופשיות על הצלחת למשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר במהירות את המכסה ולספור את מספר הזחלים בחושך ובאור הרביעים. סימון המיקום של כל זחל עם סמן יכול להקל על הספירה. לחלופין לקחת תמונה של הצלחת ולספור בדיעבד. זחלים מראים העדפה ברורה אור, כמו זחלים זוחלים על הקירות או מתחפרים לתוך אגר צריכים להיחשב כהעדפה ניטראלית ופשוט להיכלל במספר הכולל של זחלים כאשר מדד העדפת האור מחושב.
- לאחר הספירה, לבטל את הצלחת עם זחלים ולהחליף עם צלחת בדיקה חדשה לניסוי הבא. לאסוף צלחות בשימוש בשקית פלסטיק חיטוי לטיפול וסילוק מאוחר יותר.
- לאחר שבצעת מספר מספיק של ניסויים ניתן נבדקו גנוטיפ חדש. 10-15 ניסויים לגנוטיפ מספיקים לניתוח.
5. ניתוח נתוניםשל
- לנוחיותך להעביר את הנתונים לגיליון נתונים כמו אקסל (Microsoft) או מקור (מעבדה מקור) במחשב לניתוח סטטיסטי נוסף. סדר בעמודה אחת את מספר בעלי החיים בחשכה, בעמודה שנייה את מספר בעלי החיים ברביעי אור ובשלישי הכולל של בעלי חיים בצלחת (כולל זחלים "ניטראלי").
- לחשב את מדד ההעדפה (PREF) לחושך עבור כל ניסוי תוך שימוש בנוסחה הבאה:
PREF (חושך) = (כמות זחלים בחושך - מספר הזחלים באור) / מספר כולל של זחלים - להשוות סטטיסטי קבוצה של נתונים עם ניתוח מתאים לקבוצות. כאן, אנו משתמשים במבחן Wilcoxon להשוות סטטיסטי בין שתי קבוצות. מבחן ANOVA מרובה עם ההשוואה של טיוקי בדיעבד ניתן לעשות בדיקה, אם הנחת התפלגות נורמלית מתקיימת בהשוואת קבוצת סעפת.
- הפוך את הגרפים שמראים באופן ברור השוואות בין קווים ונקודות זמן לאורך מחזור היום. Wתוכנת מקור שימוש בדואר (מעבדת מקור) כדי לבדוק את המובהקות סטטיסטיות וליצור גרפים מתאימים, אבל בכל תוכנה סטטיסטית אחרת יכולה להיות מועילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, בדקנו העדפת אור בחושך באצטדיון הזחל שלישי המוקדם של סוג בר קנטון-S טסה בשתי פעמים Ct0 וCT12 שונות היממה. מבוגרים גודלו 12 שעות אור 12 שעות חושך והשאירו להטיל ביצים עבור 12 שעות. זחלים לגדול ביומיים הראשונים תחת אותו משטר אור בחושך. מכיוון שאנו רוצים לבדוק אפנון היממה בתנאים קבועים (ריצה ללא שעון הביולוגי), זחלים שלאחר מכן הועברו לחשכה מתמדת במשך שלושת הימים הבאים עד לביצוע בדיקה (איור 3 א).
כאן, אנו משמשים 350 לוקס שכן הוכח כי מדובר בעוצמת האור האופטימלית כדי לזהות הבדלים של תגובת אור זחל תסיסנית לאורך מחזור היממה בהשוואה לעוצמות אחרות (70 ו 600 לוקס) 7. הבדלים ברגישות לאור, ולכן בתגובה הוא ציין אור כאשר משווים CT0 עם CT12. בדרוזופילה, CT0 יעלה בקנה אחדים עם עלות השחר, במחצית המחזור בין CT0-CT12 נחשב היום סובייקטיבית ומCT12 לCT24 סובייקטיבית הלילה 12. רגישות לאור גבוהה יותר לזמן קצר לאחר מעבר מחושך לאור, כאשר כמעט 77% מהזחלים מעדיפים את החושך בהשוואה לכמעט 69% מהעדפה חשוכה בלילה סובייקטיבית המוקדם (איור 3). זה בא לידי ביטוי גם במדד ההעדפה הכהה (PREF (חושך)) מחושב עם נוסחה שהוצגה לעיל עבור כל ניסוי. ממוצע של כל החזרות שהשגנו מדד העדפה של 0.52 לCT0 ושל 0.36 לCT12. באמצעות בדיקת Wilcoxon (מקור) הבדל משמעותי סטטיסטי בין שתי נקודות זמן מוצג (p = 0.0229).
איור 1. () סימון רביעים בעפעפי צלחת פטרי. יכולים להיות מסומנים ברביעים את המכסה צלחת פטרי עם עזרה מרבע מודפס משמש בד. בדיעבד את השכבה הראשונה של נייר אלומיניום יכול להיות מודבק על פני השטח החיצוני של הצלחת ולהיות מכוסה בסרט שחור בשני הרביעים המנוגדים לחשכה. (ב ') סכמטי להגדיר עבור מבחן העדפת האור הכהה. (ג) פטרי צלחת מכוסות ברביעים כהים ומלאה ב2.5% אגר, מוכן לשמש לניסויים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2 מבחן העדפת אור כהה., דוגמה של צלחת מייד אחרי הגדרת זחל על צלחת הבדיקה (התחלה) ואחרי 5 דק '(סוף). בדרך כלל, אנחנו משתמשים בקבוצה של 30 בעלי חיים עבור כל ניסוי.
tp_upload/50237/50237fig3.jpg "alt =" איור 3 "עבור: = תוכן ברוחב" 5.5in "FO-src =" / files/ftp_upload/50237/50237fig3highres.jpg "/>
איור 3. (א) ואחריו משטר אור כדי לבדוק את העדפת אור בהאכלת זחל L3. (ב) אחוז ההעדפה הכהה עבור שניהם נקודות הזמן שנבדק (CT0 וCT12). אחוז מהזחל שהחושך והאור המועדף נספרים לכל חזרה וחזרתי שוב ושוב את כל ממוצע. זחלים בגבולות הצלחת או החפירה באגר נחשבים כניטראליים. (ג) מדד העדפה אפל מחושב לאותן נקודות הזמן. הבדל סטטיסטי מובהק בין קבוצות מוצג על ידי בדיקת סכום הדרגה Wilcoxon (p <0.05). (N = 18 (540 זחלים) לכל נקודת זמן). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדיקת העדפת האור תאר מנצלת photobehavior מולדת הזחל. Assay קל להקים, מאפשר חזרות רבות בעלות נמוכה ומספק מידע רב ערך על חישת אור ועיבוד. פרדיגמה הניסויית מאפשרת כימות מהירה יחסית של כמה אנשים מעדיפים אור או חושך. העדפה כזו יכולה להיות מוצגת כאחוזים גולמיים או לחלופין כמדד העדפות (PREF). PREF מתבטא בהבדל של בעלי חיים שאור מועדף ובעלי החיים שחושך מועדף מחולק בסכום הכולל של בעלי חיים.
נקודה מכרעת למבחן העדפת האור היא משך הזמן של הניסויים. הנה, בדקנו חמש דקות, אולם זה אפשרי כי גנוטיפים אחרים או תחת הבדלי איכויות אור אחרים הם לא כל כך ברורים באמצעות משך ניסוי זה. לגירויים מסוימים (התעורר אצלם) יש לנו הבנו שניסויים ארוכים יותר, עם 20 דקות של משך זמן, לספק preferen נקיCES עם שונות קטנות יותר. בדיקת המשכים ניסיוניים שונים יכולה להיות הוגנת במיוחד בעת שימוש בו גנוטיפים תנועה או רגישות השפעה והזחלים דורשים זמן רב יותר כדי לחקור את צלחת הבדיקה. במקרה זה, הזמן צריך להיות מותאם באופן שווה לבקרות וגנוטיפים ניסיוניים.
Assay גם מאפשר גילוי הבדלים בין נקודות זמן מאותו יום מחזור היממה כפי שמוצג כאן ובדוחות קודמים 7,13. תגובות אור לגירויי photic מוסדרים בחום על ידי השעון הביולוגי, ככל הנראה על ידי ויסות הרגישות של קולטני אור. תגובות זחל לאור ירידה בשתי שעות הראשונות של היום, ולהיות יציב בעשר שעות הנותרות של שלב האור. כדי להשוות בין קבוצות שונות במהלך היום, זה הוא חיוני כדי להפוך את הניסויים בנקודות זמן מקבילים או זהות של מחזור היממה לכל קבוצה. בנוסף, חשוב גם להימנע משינויים שיכול להשפיע על התנהגות הזחל, כתנודות תרמיות או תשומות אור קודמות לניסויים, אם עובדים בחושך. לשם כך, חשוב לגדל את הזחלים באותה הטמפרטורה והלחות מאשר אלה המשמשים לניסויים ולהיות זהיר על ידי שמירה על בעלי חיים בחושך בעת צורך.
לפחות שלושה מסלולים שתוארו לאחרונה לתרום להדליק חישה בדרוזופילה זחל 5,14: 1) מערכת rhodopsin תלויה בתיווכו של העין הזחל, 2) את הנוירונים multidendritic הכיתה הרביעית, התפשט לאורך גוף הזחל ו3) חיישני אור כחולים שעון פנימי להביע לבכות. תרומה של מסלולי חישת אור שונים להתנהגות חזותית יכולה להיות מטופל על ידי בדיקת ההעדפה שתוארה כאן. מקורות שונים של תאורה עם עוצמות ואורכי גל מסוימים יכולים לשמש כדי לבדוק את איכויות אור שונות. אפשרות זו יכולה להיות תלויה בפרטים על הרגישות של אלמנטים בודדים של מערכת חישת האורד איך תשומות אור כזה מעובדות. לניסויים מפורט יותר בנוגע לגירוי אור, ניתן לשנות בקלות את assay כדי לבדוק את איכויות אור שונות. גדלה או קטן של עוצמות אור, כמו גם בדיקת אורכי גל אור שונה אפשרי על ידי שימוש במנורות LED תוצרת עצמית עם אורכי גל מסוימים (אפשרויות רבות זמינות בשוק). שליטה של מנורות כאלה עם ספקי כוח מציעה מגוון טוב של עוצמות. אפשרויות אלה עבור מניפולציה איכויות אור מספקות מגוון רחב של המשתנים שנבדקו במבחן העדפת האור.
יתר על כן, זחלים תסיסנית מסוגלים לשייך את העונש או תגמולים גם עם אור או חושך, שינוי photobehavior 15 ילידים. לשם כך, עיבוד של הפרוטוקול המתואר הועסק מראה את הרבגוניות של assay. לסיכום, במבחן העדפת אור בחושך הוא כלי בעל ערך רב תורם להבנה טובה יותר של מהירוהתנהגויות היממה נגזרות מגירויים קלים ובו אלמנטים של המערכת רגישה לאור והשעון הביולוגי של זחל תסיסנית מעורבות בתהליך זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לעמיתינו בחוג לביולוגיה, אוניברסיטת פריבורג לדיונים פוריים. אנו מודים למרכז מאגר בלומינגטון למתן מניות לעוף. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הקרן הלאומית למדע שוויצרי (PP00P3_123339) וקרן Velux לSGS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A5093-500G | 2.5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Switzerland |
| Petri dishes | Greiner Bio-One GmbH | 633180 | 90-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria |
| LEDs Lamp | OSARAM | 80012 White | LED lamp, 80012 White |
| Environment Meter | PCE | PCE EM882 | Lux, Temp, RH% |
| Thermostatic cabinet | Aqua Lytic (Liebherr) | ET636-6 | |
| Light timer | Timer T | 6185.104 | 230V/50HZ (check specifications for your country) |
| Universal thermostat | Conrad | UT200 | |
| Humidifier | Boneco | ||
| Balck tape | Tesa | 5 cm | |
| Glue | Uhu | ||
| lncubator lamp | Phillips | Softtone | 5W |
| Timer clock | Ziliss | Ziliss, Switzerland | |
| Excel Software | Microsoft | Excel | |
| Origin Software 8.5 | OriginLab | ||
| Backer Yeast | Migros Switzerland | ||
| Iron support stand 17X28CM | Fisher Scientific | S47808 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | A6283-100ML | 20% acetic acid dilluted in H2O |
| Red light lamp | Phillips | PFE712E*8C | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14-373-25A | |
| Power supply | EA | EA PS 2042-06B | Optional |
| Aluminium foil | Prix Coop | ||
| Heater | GOON | NSB200C | |
| Microwave Oven | Intertronic | ||
| Standard corn meal fly food | |||
| Destilled water |
References
- Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
- Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
- Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
- Diaz, N. N., Sprecher, S. G.
- Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
- Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
- Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
- Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. Genetics. 124, 293-302 (1990).
- Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).
- Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).
- Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
- Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
- von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).
