Vi beskriver tilpasning av optiske projeksjon tomografi (OPT)<sup> 1</sup> Til bildebehandling i nær infrarøde spekteret, og gjennomføringen av en rekke dataverktøy. Disse protokollene gjør vurderinger av pankreas β-cellemasse (BCM) i større prøver, øke flerkanals kapasitet teknikk og øke kvaliteten på OPT data.
Ved å tilpasse OPT å inkludere evnen bildebehandling i nær infrarødt (NIR) spektrum, vi her illustrerer muligheten til bilde større legemer av pankreasvevet, for eksempel rotte bukspyttkjertel, og å øke antallet av kanaler (celletyper) som kan bli studert i en enkelt prøve. Vi videre beskrive gjennomføring av en rekke av dataverktøy som gir: 1 / nøyaktig posisjonering av en prøve er (i vårt tilfelle bukspyttkjertelen) tyngdepunkt (COM) ved dreieaksen (AR) 2; 2 / forbedrede algoritmer for post -justering tuning som hindrer geometriske forvrengninger under tomographic gjenoppbygging 2 og 3 / en protokoll for intensitet utjevning for å øke signal til støy-forhold i OPT-baserte BCM bestemmelser 3. I tillegg beskriver vi en prøveholderen som minimerer risikoen for utilsiktede bevegelser av prøven under bildet oppkjøpet. Sammen utgjør disse protokollene gjør vurderinger av BCM distribusjon og OTHeh funksjoner, som skal utføres i hele volumet av intakt pancreata eller andre organer (f.eks i studier av holme transplantasjon), med en oppløsning ned til nivået av individuelle Langerhans øyer.
De insulinproduserende β-celler er nøkkelen til kroppens evne til å kontrollere blodsukkeret homeostase. Derfor vurderinger av bukspyttkjertelen BCM distribusjon er viktig for mange områder av pre-klinisk diabetes forskning. I evalueringer av terapeutiske regimer for eksempel effekten av målrettet genet ablasjon på endokrin celledifferensiering eller studier av diabetes etiologien i gnagermodeller for sykdommen ofte avhenge av slike analyser. Tradisjonelt har denne type vurderinger lettelse på tidkrevende stereological tilnærminger som er vanskelige å utføre på grunn av størrelsen og komplekse anatomisk konstitusjon av bukspyttkjertelen. Mest høy oppløsning tilnærminger i dag (vanligvis optisk), ikke gir tilstrekkelig inntrengningsdybde å tillate hele bukspyttkjertelen bildebehandling i gnagere. Omvendt, bildebehandling tilnærminger som ikke er begrenset av deres inntrengningsdybde (vanligvis kjernefysisk) gir til dårlig oppløsning for å løse hele BCM distribusjon og er hemmetav mangel på tilstrekkelige kontrastmidler 4,5.
Optisk projeksjon tomografi er en 3D imaging modalitet som gir høy oppløsning vurderinger av biomedisinske prøver på mm til cm skala 6. Herved, kan informasjon om den romlige posisjon og volum av det enkelte insulin uttrykke Langerhanske øyer ekstraheres hele volumet av bukspyttkjertelen i normale og diabetiske mus 3,7-10. Målet med studien er å ytterligere øke kapasiteten av denne teknikken for vurdering av bukspyttkjertelen β-celler, deres endogene distribusjon, når podet inn andre vev, de utnyttes til andre pancreatic bestanddeler (for eksempel infiltrere celletyper) og i større bukspyttkjertelen forberedelser enn tidligere mulig.
Den nær infrarød optisk projeksjon tomografi (NIR-OPT) setup
I under protokoller, en OPT skanner basert på den opprinnelige oppsettet beskrevet av Sharpe <em> et 1 al, tilpasset bildebehandling i nær infrarøde området er beskrevet og brukt. For enkelt kanal vurderinger av musen bukspyttkjertelen (f.eks av BCM), kan SkyScan 3001 (Bioptonics) scanner brukes.
En metallhalogen lampe som gir høyere eksitasjon energi enn en kvikksølv buelampen på bølgelengder over 650 nm, leverer eksitasjon lys. Lyset overføres gjennom en væske lysføring. En nyttig kombinasjon av fluorokromer og band pass filtre for NIR fluorescens bildebehandling og kanalseparasjon er vist i figur 3. Det avgitte lys detekteres med en tilbake opplyst CCD kamera, med høy Quantum effektiviteten i NIR spekteret. Den OPT skanning er automatisert ved hjelp av en LabView plattform som styrer kameraet og stepper motor. Å støtte prøvene i størrelsen av intakt rotte pancreata, en beskyttet sølv belagt speil og en stor kyvette brukes. Endelig en prøveholderen som eliminerer uønskede loddrette movements av prøven under skanningen ble utformet.
De beskrevne teknikker for OPT avbildning muliggjør utvinning av romlige og kvantitative parametere hele volumet av den murine bukspyttkjertelen. På grunn av begrensninger i oppnåelig oppløsning for denne type mesoskopisk avbildning det bør bemerkes at, som for de fleste imaging modaliteter, jo større prøven jo lavere oppløsning (Selv om bruken av en høyere oppløsning CCD bør øke oppløsningen til OPT skanning) . Derfor, for vurdering av intakte bukspyttkjertelen mus lobes, gjør teknikken i dag ikke gi enkelt celle oppløsning selv om nær (ca. 15-20 mikrometer) 7. Likevel, for utvinning av BCM distribusjon i musen bukspyttkjertelen protokollene har gitt data som mer enn godt matche de oppnådd ved f.eks punkt telle morfometri 3,13 Det bør bemerkes at selv om gjennomføringen av CLAHE protokollen åpner for påvisning av signifikant flere holmer , disse holmer er generelt mindre og ikke bidragte vesentlig til den totale β-celle volum.
De immunhistokjemiske protokoller som er involvert er relativt lang (opptil to uker), men de faktiske hendene på tid for prøven forberedelse er kort og derfor teknikken er godt egnet for studiet av store årskull av dyr 9. Dersom potensialet for heterogent fordelingsmønstre er et fokus for etterforskningen, bør det understrekes at forsiktighet bør utvises i trinnene om fiksering og montering for å unngå at bukspyttkjertelen vev blir løst i en ugunstig måte, og en flat ("spredt ut" ) mount av vevet bør tilstrebes å legge til rette slike vurderinger.
En viktig sak når du utfører OPT er at prøven er COM er satt til rotasjonsaksen og at det ikke beveger seg, enten vertikalt eller horisontalt, under skanning prosedyren. Derfor er det viktig å ha en stabil mekanisk oppsett og et velfungerende system for attaching prøven. Vi løste dette problemet ved å bygge en ny mount (figur 7).
Parallell geometri var ikke sant for vår NIR-OPT eller Bioptonics 3001 skanner, som ble oppdaget som en vertikal forskyvning mellom foran og bak posisjoner perifere objekter i projeksjonsknappene bilder som er tatt. Ved å justere objektet til kilden avstand i loggfilen for den aktuelle skanneren (se 2.3.1) kan vi forbedre kvaliteten på våre data og korrigere for geometriske forvrengninger På langt kanter av projeksjon bilder, som er av spesiell betydning når vurdere større prøver.
I den gjeldende protokollen, gir vi et forslag av filter sett som tillater visualisering av tre ulike spesifikke kanaler og en "anatomi" kanal i vurderinger av intakte bukspyttkjertelen forberedelser. Tydeligvis disse innstillingene kan være modulert å tilpasses fluorokromer benyttes for en gitt studie men som med alle former for fluorescerendeprosent mikroskopi, bør den potensielle faren for signal blø-through vurderes nøye. Studiet av insulin merket holmer med fluorokromer som er glade over 750 nm har ennå ikke vært mulig av oss med metallhalogen lampe som vår satt opp benytter. Det er mulig at et kamera med enda høyere Quantum effektiviteten i de relevante bølgelengder i kombinasjon med alternative lyskilder (f.eks diode lasere) kan øke potensialet for NIR-OPT videre og gi rom for bildebehandling på enda høyere bølgelengder.
OPT imaging er en svært allsidig teknikk for romlige og kvantitative vurderinger av biomedisinsk prøven på mm-cm skala. Selv om protokoller som presenteres her er utviklet for hovedformålet med bukspyttkjertelen / diabetes forskning de bør være mulig å oversette til forskning på andre arter, prøvetypene og markører. Av potensialet til å visualisere flere forskjellige kanaler i intakte pancreatic preparater, NIR-OPT avbildning further har potensial som et verktøy for å evaluere opptaket spesifisitet av kontrastmidler beregnet for ikke-invasive vurderinger av andre bildediagnostikk, så lenge disse kontrastmidler kan være utformet for å bære også en fluorofor påvises ved OPT.
The authors have nothing to disclose.
Dr. P. Lindström er anerkjent for å gi ob / ob mus. J. Lehtonen er anerkjent for å få hjelp med videoproduksjon og J. Gilbert for hjelp med redigering. Denne studien ble støttet med tilskudd fra Diabetes Research Institute Foundation (AP), Juvenile Diabetes Research Foundation (AP og UA), EU-kommisjonen (FP-7, Grant avtale nr:. CP-IP 228933-2) (JS og UA), de Kempe Foundations, Umeå universitet og det svenske Vetenskapsrådet til UA
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
Liquid Light Guide | 11504116 | ||
Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |