Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

بالقرب من الأشعة تحت الحمراء التصوير المقطعي الإسقاط الضوئي لتقييم التوزيع الشامل β خلايا في أبحاث السكري

Published: January 12, 2013 doi: 10.3791/50238
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 4, 1, 1
1Umeå Centre for Molecular Medicine, Umeå University, 2Cell Transplant Center, Diabetes Research Institute, University of Miami,, 3EMBL-CRG Systems Biology Program, Centre for Genomic Regulation, Catalan Institute of Research and Advanced Studies, 4Dept. of Computing Science, Umeå University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

وصفنا تكييف التصوير المقطعي الإسقاط الضوئي (الأراضي الفلسطينية المحتلة)

Abstract

الأراضي الفلسطينية المحتلة من خلال تكييف لتشمل القدرة على التصوير في الطيف القريب (NIR) الأشعة تحت الحمراء، ونحن هنا توضيح إمكانية الهيئات بشكل اكبر من الأنسجة البنكرياس، مثل الفئران البنكرياس، وزيادة عدد القنوات (أنواع الخلايا) التي قد دراسة في عينة واحدة. وصفنا كذلك تنفيذ عدد من الأدوات الحاسوبية التي تقدم: المواقع 1 / دقيقة من المركز (في حالتنا البنكرياس) عينة من كتلة (COM) في محور الدوران (AR) 2، 2 خوارزميات / محسنة لآخر الانحياز الذي يمنع التشوهات ضبط هندسية خلال اعادة تصوير الشعاعي الطبقي 2 و 3 / بروتوكول لمعادلة لزيادة كثافة إشارة إلى نسب الضوضاء في قرارات BCM الأراضي الفلسطينية المحتلة على أساس 3. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف حامل العينة أن يقلل من خطر الإصابة الحركات غير المقصودة للعينة خلال الحصول على الصور. معا، هذه البروتوكولات يتسنى إجراء عمليات التقييم والتوزيع الغير BCMميزات إيه، التي يتعين القيام بها في جميع أنحاء حجم بنكرياسات سليمة أو الأجهزة الأخرى (على سبيل المثال في دراسات زرع جزيرة)، مع دقة وصولا الى مستوى الجزر الفردية لانجرهانز.

Introduction

إنتاج الأنسولين β-الخلايا هي المفتاح لقدرة الجسم على السيطرة على توازن الجلوكوز في الدم. ولذلك، وتقييمات التوزيع BCM البنكرياس أمر لا بد منه إلى مناطق عديدة من البحث السكري ما قبل السريرية. في تقييم الأنظمة العلاجية على سبيل المثال، فإن تأثير الجينات الاجتثاث التي تستهدف تمايز الخلايا أو الغدد الصماء دراسات المسببات المرضية السكري في نماذج القوارض لهذا المرض غالبا ما تعتمد على مثل هذه التحليلات. تقليديا، اعتمدت هذه الأنواع من التقييمات بشأن النهج stereological الوقت طويلا يصعب على أداء نظرا لحجم والدستور التشريحية المعقدة في البنكرياس. العلي النهج التصوير في الوقت الحاضر القرار (البصرية عادة)، لا توفر ما يكفي من عمق الاختراق للسماح كله التصوير البنكرياس في القوارض. وعلى العكس، والنهج التصوير التي لا تقتصر على عمق الاختراق من قبل (عادة النووية) تقدم إلى الفقراء القرار لحل الكامل وتوزيع BCM إعاقة وبسبب عدم وجود عوامل التباين كافية 4،5.

التصوير المقطعي البصري الإسقاط هو طريقة من طرق التصوير 3D التي تمكن تقييمات عالية الدقة العينات الطبية الحيوية على نطاق ومم إلى 6 سم. هنا، يمكن استخراج المعلومات المكانية عن موقف وحجم الانسولين الفردية معربا عن جزر لانجرهانز في جميع أنحاء حجم البنكرياس في الفئران العادية والسكري 3،7-10. الهدف من الدراسة الحالية هو مواصلة تعزيز قدرة هذه التقنية لتقييم البنكرياس β خلايا؛ على توزيع الذاتية، عندما المطعمة في الأنسجة الأخرى، علاقتها المكونة البنكرياس الأخرى (مثل التسلل أنواع الخلايا) وأكبر الاستعدادات البنكرياس من ممكنا في السابق.

والتصوير المقطعي بالأشعة تحت الحمراء قرب الإسقاط الضوئي (NIR-OPT) الإعداد

في أدناه البروتوكولات، ماسح الأراضي الفلسطينية المحتلة استنادا إلى مجموعة الأصلي صفت من قبل شارب 1، تتكيف مع التصوير في نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة وتستخدم. لتقييم قناة واحدة في البنكرياس الماوس (على سبيل المثال من BCM)، قد يتم استخدام 3001 SkyScan (Bioptonics) الماسح الضوئي.

مصباح الهاليد المعدنية التي توفر أعلى طاقة الإثارة من مصباح قوس الزئبق في موجات فوق 650nm، لوازم ضوء الإثارة. يتم نقل الضوء من خلال دليل ضوء السائل. وتظهر مزيج من المفيد fluorochromes والمرشحات لتمرير الفرقة NIR مضان التصوير وفصل القناة في الشكل 3. يتم الكشف عن الضوء المنبعث مع كاميرا CCD مضيئة الظهر، مع كفاءة عالية في الكم الطيف NIR. هو الآلي باستخدام المسح الأراضي الفلسطينية المحتلة منصة ابفيف الذي يتحكم في الكاميرا والمحركات السائر. لدعم العينات في حجم الفئران بنكرياسات سليمة، مرآة الفضة المطلية المحمية وكوفيت كبير يستخدم. وأخيرا، حامل العينة أن يلغي movemen العمودي غير المرغوب فيهاتم تصميم TS من العينة أثناء الفحص.

Protocol

1. تحضير العينة والمسح الضوئي

1.1 إعداد نموذج

يتم تنفيذ الإجراء التالي بشكل أساسي كما هو موضح سابقا 7.

  1. حصاد البنكرياس. استخدام الثلج الباردة PBS لتجنب تدهور بروتين.
  2. إصلاح الأنسجة في PFA 4٪ في برنامج تلفزيوني على الجليد لمدة 2-3 ساعة. تأكد من "انتشرت" الفص خلال التثبيت. وسوف يسهل هذا تحديد معالم التشريحية بعد إعادة الإعمار.
  3. يغسل في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة الزائدة.
  4. يذوى البنكرياس التدريجي في الميثانول (33، 66٪، 100٪)، 15 دقيقة / الخطوة. هذا يقلل من تكوين فقاعات خلال التبييض (انظر الخطوة 5) ويمنع تدمير خلايا خلال ذوبان للتجمد (راجع الخطوة 7).
  5. احتضان الأنسجة في MeOH الطازجة: H 2 O 2: DMSO تبيض عازلة في نسبة 02:01:03 RT في 24 ساعة لإخماد الذاتية مضان الأنسجة. للحصول على أكبر الصرف، وعينات لbleachi جديدةنانوغرام العازلة واحتضان لمدة ساعة أخرى 24.
  6. يغسل في MeOH الزائدة، ON.
  7. تجميد ذوبان الجليد على الأقل 5 دورات في -80 ° C - RT لتسهيل اختراق الأجسام المضادة.
  8. ترطيب تدريجي إلى TBST (33، 66٪، 100٪)، 15 دقيقة / الخطوة.
  9. كتلة TBST في المصل مع 10٪ (يفضل أن يكون من نفس النوع الذي تم إنشاء الأجسام المضادة الثانوية)، DMSO 5٪ ونعاز 0.01٪ لمدة 12-24 ساعة في RT
  10. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في منع العازلة لمدة 48 ساعة، في RT، تمتد إلى 72 ساعة لعينات أكبر (يتم سرد الأجسام المضادة المستخدمة هنا في جدول الكواشف).
  11. يغسل في TBST الزائدة، ON.
  12. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية fluorescently مترافق لمدة 48 ساعة، في RT، تمتد إلى 72 ساعة للحصول على أكبر العينات.
  13. يغسل في TBST الزائدة، ON.

1.2

يصف الإجراء التالي كيفية تحميل العينة في الاغاروز ونعلق عليه لصاحب العينة المخصصة أدلى (انظر الشكل 7) قبل الأرض الفلسطينية المحتلة المسح.

  1. فصل فصوص الطحال، الإثنى عشر والمعدة حسب الشكل 3A في Hörnblad وآخرون 3. وزاد من توضيح العلاقة بين الفصوص في Hörnblad وآخرون 11.
  2. إعداد 1.5٪ (W / V) منخفضة ذوبان الاغاروز درجة الحرارة في DH 2 O، فلتر، والسماح لتبرد إلى 37 ° C وشطف الأنسجة في DH 2 O للتخلص من المنظفات وإزالة الفقاعات قبل الاغاروز-تضمين على الجليد.
  3. قطع كتلة تضم الاغاروز عينتك وترك 1 سم ~ التبادل بين العينة وقاعدة الاغاروز. تقليم الحواف الحادة (≤ 90 درجة) من كتلة الاغاروز للحد من تشتت الضوء.
  4. يذوى العينة التدريجي في MeOH (33، 66٪، 100٪)، مما يتيح الوقت ليوازن بين كل خطوة. عندما يغرق العينة يعتبر أن تكون معايرتها.
  5. مسح عينة في حل من 01:02 كحول البنزيل: البنزيل بنزoate (BABB) حتى يصبح شفافا. تبادل BABB الحل واحتضان لمدة 12 شهرا اضافيا على الموارد البشرية.
  6. وضع عينة مسح في حامل العينة وضمان الحصول عليها عن طريق إدراج 2 الإبر من خلال التبادل الاغاروز عبر الثقوب المحفورة في الشفاه لصاحب.
  7. وضع العينة في الماسح الضوئي وتغمره في كوفيت مليئة حل المقاصة BABB. وينبغي عند مقارنة سلسلة من بنكرياسات أن تستخدم نفس التكبير لجميع عمليات الفحص. وينبغي أن يكون الأمثل التكبير لأكبر عينة في هذه السلسلة.

1.3 تحديد المواقع من العينة في AR

بروتوكول يصف الإجراء التالي لوضع عينة بدقة باستخدام خوارزمية COM-AR. هذا الإجراء لا ينطبق إلا عندما ROI تشمل العينة بأكملها. للحصول على وصف مفصل للخوارزميات، الرجاء راجع Cheddad وآخرون 2.

  1. الحصول على صور للعينة في موقعين للبوتح التشريح والقنوات الإشارة. الموضع 1 في 0 درجة (المرتبطة X-المحور)، وعرض أكبر مساحة الإسقاط، والموضع 2 عند 90 درجة (المرتبطة Z-المحور). نحن نستخدم القناة GFP لتصور التشريح.
  2. تطبيق توقع-تعظيم (EM) خوارزمية على الصور التشريح إلى عتبة العائد على الاستثمار.
  3. احتساب النقاط COM (X-إحداثيات) من الحصول على صور ثنائية في الخطوة 2 لكل من ° 0 إلى 90 درجة والتوقعات.
  4. ركب خط عمودي يمر عبر نقطة COM تحديد المحسوبة في الخطوة 3 على الصور و° 0 ° 90 من إشارة القناة.
  5. استخدام الصور المكتسبة في الخطوة 4 كمراجع لنقل العينة بحيث خط وسط الميدان من مشاهدة يمر عبر نقطة COM وجد من العينة.

1،4 المسح الضوئي

  1. ضبط أوقات التعرض لتحقيق أعلى إشارة إلى نسبة الضوضاء ممكنا من دون saturaتينغ أي مجال من المجالات من الصور الإسقاط. تكرار لجميع القنوات التي يتم مسحها ضوئيا.
  2. حدد مجموعة فلتر لقناة مضان أول من يتم مسحها ضوئيا. قد الانبعاثات من fluorophores أقصر λ تثير fluorophores مع λ أطول وتسبب بذلك تبيض الصورة. لتقليل هذا الاحتمال، مسح fluorophore مع λ أطول الإثارة الأولى.
  3. فتح مصراع لإلقاء الضوء على العينة وجمع إشارة مضان أكثر من 360 درجة، وتناوب العينة على طول المحور الرأسي لكل قناة. زاوية الخطوة المستخدمة في إعداد قوائم الجرد الوطنية، الأراضي الفلسطينية المحتلة هو 0.9 درجة ولل3001 Bioptonics ° 0،45 الماسح الضوئي.
  4. حدد عامل التصفية المناسب للقناة المقبل والمضي قدما على النحو الوارد أعلاه.

2. الحسابية معالجة وإعادة الإعمار

2.1 الكشف عن اختلال بعد الحيازة وتصحيح (A القيمة ضبط)

في التصوير المقطعي الإسقاط، فمن الضروري بشكل عاملتعيين قيمة الانحياز إلى آخر التوقعات لضبط الموقف والصور على طول محور الدوران قبل إعادة الإعمار. ومع ذلك، يمكن للانحراف صغير في زاوية الكاميرا نحو المحور البصري يسبب غير موحدة A القيم على طول العينة وبالتالي إحداث تشوهات هندسية. لتجنب مثل هذه التشوهات، يمكن تطبيق طريقة حسابية دقيقة للعثور على وموحد بعد المحاذاة القيمة (قيمة) في جميع أنحاء كامل العينة 2.

  1. استخدام فورييه تحويل منفصلة لتقسيم الإسقاط للإشارة محددة في 0 ° و 180 ° إلى 8 كتل ارتفاع بكسل وحساب تحول على طول محور س (من A-القيمة) بين كل كتلة.
  2. تطبيق الانحدار الخطي المربعات الصغرى للمساعدة في حساب الزاوية θ '، الذي يصف المنحدر من X-SHIFT المحور على طول العينة، وإيجاد نقطة الوسط التناوب.
  3. تصحيح اختلالات خلال المسح الضوئي لعن طريق تناوب كل projections θ '/ 2 حول نقطة مركز الدوران.

2،2 التباين محدودة تسوية المخطط التكيف (CLAHE)

لتسهيل الكشف وتجزئة الأجسام (الجزر) واظهار اشارات ضعيفة جدا، والتي هي في خطر أن "thresholded من" خلال / والتعمير أو تجزئة لتقييم الكمي، يمكن تطبيق خوارزمية CLAHE إلى الصور الإسقاط. يتم تنفيذ العملية CLAHE مع اثنين من التحولات الكبرى كثافة:

  1. ويقدر التباين المحلية والتعادل داخل كتل غير متداخلة في الصورة الإسقاط.
  2. تم تطبيع ثم شدة في المناطق الحدودية بين الكتل من خلال التمثيل Bilinear.

اسم التباين المحدود يشير إلى الحد كليب، التي من المقرر أن تجنب تشبع بكسل في الصورة. في هذا البروتوكول، MATLAB دالة مضمنة "adapthisteq" كانت تستخدم وتطبق مع ج الافتراضي الحد من الشفاه 0.01 وحجم البلاط من 256. علما، وحجم البلاط الأمثل يحتاج إلى اختبار تجريبي، ويمكن أن يختلف وفقا لعينة تم تحليلها. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل حول خوارزمية والأمثلة في Hörnblad وآخرون 3.

ملاحظة! المذكورة أعلاه وخطوات المعالجة الحاسوبية (بما في ذلك COM-AR، ضبط قيمة وCLAHE، انظر 1،3-2،2) مبنية على خوارزميات القياسية ويتم تنفيذها في MATLAB (ماثووركس).

2،3 تصوير الشعاعي الطبقي إعادة الإعمار وتقديم ISO-السطح

  1. باستخدام خوارزمية الإسقاط الخلفي تصفيتها، قد تصحيح الصور الآن وتطبيع إعادة بنائها مع تعويض اختلال موحدة ومتطلبات الحد الأدنى لتعظيم الاستفادة من النطاق الديناميكي. في هذا البروتوكول، وتنفيذ جميع عمليات إعادة البناء خارج باستخدام الإسقاط الخلفي تصفيتها طريقة متوفرة في البرنامج NRecon (Skyscan)، الإصدار 1.6.8 (= "_blank"> http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). علما، والتكبير لكائن المصورة يعتمد على المسافة التي تفصله عن نقطة البؤري للعدسة ما لم يتم تنفيذ موازية الهندسة شعاع في الإعداد التصوير. لذلك، عند استيراد بيانات الإسقاط إلى برنامج NRecon من المهم أن تشمل الكائن الصحيح للمسافة المصدر (مم) واتجاه دوران الماسح الضوئي (لعكس اتجاه عقارب الساعة "سي سي" لإدخال المدخلات وعقارب الساعة "CW") في المرافق تسجيل الملف، لتجنب الآثار الناجمة مخروط الشعاع خلال إعادة الإعمار.
  2. لتصور وقياس كومة من المقاطع التي تم الحصول عليها الظاهري، وتوليد 3D ISO-الأسطح باستخدام برامج معالجة الصور مناسبة مثل Imaris أو Volocity.

أجريت الفئران العزلة جزيرة والإجراءات زرع في معالجة مرض السكري بحوث المعهد الخليوي قبل السريرية وبالحركة الأساسية النموذجية في إطار البروتوكولات مراجعتها والموافقة عليها من قبل جامعة ميامأنا المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. وافقت اللجنة الأخلاقية للبحوث الحيوانية في شمال السويد، وجميع التجارب الأخرى التي تنطوي على الحيوانات.

Representative Results

في التقرير الحالي وصفنا بروتوكول لاستخراج ومعالجة البيانات الحسابية من BCM في بنكرياسات القوارض (والأنسجة الأخرى) باستخدام نير الأراضي الفلسطينية المحتلة (الشكل 1). كما هو موضح في الشكل 2، وكما هو متوقع من عينة الأنسجة autofluorescense البنكرياس انخفضت بشكل ملحوظ في الطيف NIR. وهذا يؤدي إلى زيادة كبيرة في متوسط ​​إشارة إلى الضوضاء (S: N) نسبة لتقييم الجزر المسماة الأنسولين لانجرهانز. من التكيفات من الأراضي الفلسطينية المحتلة إلى التصوير في الجزء من الطيف NIR، كما هو موضح هنا، قد لا يقل عن ثلاث قنوات محددة يمكن تصور مع S كافية: N نسبة لتمكين التقييمات من أنواع الأجسام المضادة الخلايا المسمى في جميع أنحاء البنكرياس حجم الفئران مع متميزة قناة الفصل (انظر الشكل 3 و 4). تطبق على عمليات التصوير سكري و / أو التقييمات BCM بشكل عام، وبالتالي الأسلوب يسمح لتصور وتقدير حجمالمناطق الأنسولين إيجابية فيما يتعلق المحيطة و / أو التفاعل أنواع الخلايا (انظر الشكل 4). هذه التقييمات هي بفضل عمق الأنسجة التي تم الحصول عليها في اختراق زيادة نطاق ممكن لأداء NIR في عينات أكبر من ذلك بكثير من ذي قبل، بما في ذلك الفئران البنكرياس، والذي هو أكبر من 3-5 مرات نظيره في الماوس (انظر الشكل 5). بغض النظر عن ما إذا كان يتم استخدام موجات مرئية أو NIR، قد تنفيذ تيسير CLAHE بشكل ملحوظ الأرض الفلسطينية المحتلة التقييمات القائمة على BCM خلال مختلف الظروف وراثية وفسيولوجية عن طريق زيادة حساسية الكشف عن تقنية (انظر الشكل 6). يظهر مخطط لصاحب العينة وضعت في الشكل 7.

الشكل 1
الشكل 1. مخطط تصور الخطوات الحاسمة لتحاليل القائمة على الأراضي الفلسطينية المحتلة من BCM في MURالمعهد الوطني للإحصاء البنكرياس. الوقت اللازم لتقييم البنكرياس الماوس نموذجي هو 13-14 يوما. ويستهلك معظم الوقت أثناء معالجة الأنسجة وتلطيخ المناعى (10 يوما)، والمقاصة الأنسجة يتطلب ما يقرب من 2 أيام في حين أن مدة المسح يعتمد على وقت التعرض المطلوبة (عادة حوالي 1 ساعة). تجهيز اللاحقة الحسابية عادة يتم تنفيذ في غضون يوم. علما، ومناسبة بشكل مثالي لبروتوكول تلطيخ طويلة نسبيا لتجهيز دفعة من كميات كبيرة من العينات.

الشكل 2
الشكل 2. إشارة إلى نسب الضوضاء للتقييمات BCM عند أطوال موجية مختلفة. A الفص الماوس البنكرياس الإثنى عشر، ملطخة للأنسولين ومع كوكتيل من ملون تألقي، مترافق الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا 488، 594، 680 و750)، وكان يستخدم لتحديد S: N نسب عند أطوال موجية مختلفة. A صور، وتبين الإطار الإسقاط الأول للإشارة كل قناة. B، الرسم البياني يوضح S يعني: N إشارة لكل قناة. تم تحديد النسب وشدة جزيرة يعني (على أساس 215 الجزر) مقسوما على كثافة الخلفية (مضان الأنسجة الذاتية من النسيج خارجي الإفراز). C، S الرسم البياني يظهر: N نسب للفرد الجزر في كل قناة لتطبيع S: N حصل للقناة 594 اليكسا. تم استخدام واحد ANOVA الطريق لالتحليلات الإحصائية. وأشار مستويات تتوافق مع أهمية ** p <0.01. شريط النطاق في (A) يتوافق مع 1 مم. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الرقم3. فصل القناة. A، الأجسام المضادة الثانوية على الحركة مترافق مع الأصباغ Alexafluor المدرجة في الجدول بشكل منفصل على proteinG-sepharose و الخرز. B، وجزءا لا يتجزأ من الخرز الفلورسنت ثم على مستويات مختلفة في الاغاروز الوهمية وتصويرها باستخدام مرشحات المشار إليه.

الشكل 4
الشكل 4. الأرض الفلسطينية المحتلة على أساس التصوير متعددة في مجال البحوث السكري. A، الأراضي الفلسطينية المحتلة استنادا ISO-السطح إعادة بناء البنكرياس (12 أسبوعا، الفص الاثني عشر) من مرضى السكري البدناء وغير (NOD) نموذج لمرض السكري من النوع 1. اتسخت العينة للأنسولين (β-جزيرة الخلايا، اللون الازرق الزائفة)؛ العضلات الملساء α-الأكتين (الأوعية الدموية، أحمر) وCD3 (T-تسلل الخلايا الليمفاوية، والأخضر). كانت الأجسام المضادة الثانوية المقابلة المستخدمة؛ Cy3، IRDye-680-750 وDyeLight على التوالي. التدرجا (A'-A ''') تظهر إشارة القنوات الفردية. B، الصورة الأراضي الفلسطينية المحتلة (ضربة يصل عرض) على فأرة الحاسوب الفص الكبد (الفص الجانبي الشريرة) المطعمة مع الجزر وتصويرها مع syngenic أسبوعين NIR-OPT زرع آخر. وpseuodocolored الجزر الأنسولين في التعبير عن الأزرق والعضلات الملساء α-الأكتين السفن إيجابية باللون الأحمر. النهج يمكن تقييم توزيع الكسب غير المشروع جزيرة داخل الشبكة الأوعية الدموية. على نطاق والحانات تتوافق مع 1 مم.

الشكل 5
الشكل 5. NIR-OPT يسهل التصوير من أكبر العينات. A، ايزو جعل من سطح توزيع BCM في البنكرياس الفئران من طراز زوكر الدهنية لمرض السكري من النوع 2 (الفص الطحال في 9 أشهر)، لاثبات إمكانية عينة الصورة على الفئران مقياس البنكرياس من نير الأراضي الفلسطينية المحتلة. كما هو محددبواسطة هذه التقنية المعروضة هي الفص ~ 6 مرات أكبر (ت / ت) من نظيره في الماوس وتؤوي 10139 الأنسولين معربا عن جزر لانجرهانز التي β-حجم الخلايا تشكل 1.32٪ من إجمالي حجم مفصص. B، تصوير الشعاعي الطبقي الجزء المقابل من خط كسر في (A) التي يتم الكشف عنها تبين الجزر من جميع أعماق الأنسجة. C، ايزو جعل من سطح توزيع BCM في البنكرياس الماوس (الفص الطحال في 8 أسابيع) عرض كمرجع الحجم. الفص عرض تؤوي الجزر الأنسولين 2490 معربا عن خلايا β التي تشكل حجم 0.89٪ من حجم إجمالي مفصص. وملطخة بنكرياسات مع الأنسولين مكافحة GP تليها الماعز مترافق Alexa594 GP مكافحة (الماوس) وIRDye 680 حمار مترافق المضادة للGP (الجرذ) الأجسام المضادة على التوالي. العينات في (AC) وصفت على نطاق واسع في شريط (C) يتوافق مع 2 مم.

الشكل 6 الشكل 6. CLAHE يسهل الكشف عن الجزر في البنكرياس الفئران بواسطة التصوير الأراضي الفلسطينية المحتلة. AC، الممثل ISO سطح الأرض الفلسطينية المحتلة الصور المقدمة من C57BL / البنكرياس الماوس 6 (الفص الطحال في 8 أسابيع) مرقوم للأنسولين. أجريت ISO سطح اعادة البناء من الصور الأراضي الفلسطينية المحتلة قبل (A، الأخضر اللون الزائفة) وبعد بروتوكول CLAHE تم تطبيق (B، أحمر اللون الزائفة). C، تراكب للبيانات غير تسوية في (A) ومعالجتها في البيانات CLAHE (B). C'-C "، الممثل تراكب تضخم عالية من الصور (B) غير طبيعية (A) والمصنعة CLAHE. كما تبين من وجود" الجزر "الأحمر فقط، والنصي CLAHE يسهل الكشف عن إشارة صغيرة ومنخفضة الجزر كثافة. في المثال الحالي آوى العينة يصور (بعد تجهيز CLAHE) 2419 مع الجزر وبلغ حجم التداول 1.74 مم 3 (أرقام استنادا إلى البيانات الإسقاط غير المجهزة الموافق 1057 كان الجزر وايال وحدة تخزين بلغت 1.77 مم 3). D و E، والبيانات مثال من التحكم (D) ونموذج فأر ob / ob لمرض السكري من النوع 2 12 (E) في 6 أشهر تنفيذ بروتوكول CLAHE. لاحظ زيادة كبيرة في حجم جزيرة العامة في البنكرياس OB / OB (E). في (D) و (E) ويستند المخطط البنكرياس (الرمادي) على إشارة من تألق ذاتي الأنسجة. شريط النطاق في C هو 500 ميكرومتر في AC. شريط النطاق في C "يتوافق 200 ميكرومتر في 'C C'' وبار. مقياس E يناظر في 1 مم (D) و (E). الصور في (AC) والمقتبس من Hörnblad وآخرون (3) وتم إنشاؤها باستخدام Bioptonics 3001 الماسح الضوئي.

الشكل 7
الشكل 7. حامل العينة لمرفق العينات الأراضي الفلسطينية المحتلة. يتم تأمين العينة عن طريق إدخال إبر من خلال التبادل الاغاروز عبر ثقوب قبل حفر في الشفاه. هو صاحب يتوقف إلى السائر المحركات خلالمغناطيس قوي وتقع في قاعدته. هذا الإعداد يغفل استخدام المواد اللاصقة غير مستقرة وغير المرغوب فيها حركات يمنع من العينة خلال المسح الضوئي.

Discussion

التقنيات الموضحة للتصوير الأراضي الفلسطينية المحتلة تمكن من استخراج المعلمات المكانية والكمية في جميع أنحاء البنكرياس حجم الفئران. وتجدر الإشارة إلى واجب إلى تحديد في القرار تحقيقها لهذا النوع من التصوير جرحشاعثزرحشرتاد أنه، كما لمعظم طرائق التصوير، أكبر عينة انخفاض القرار (على الرغم من أن استخدام CCD دقة أعلى ينبغي زيادة دقة الفحص الأراضي الفلسطينية المحتلة) . وبالتالي، لتقييم سليمة فصوص الماوس البنكرياس، والتقنية في الوقت الحاضر لا يوفر واحدة على الرغم من أن قرار إغلاق الخلية (حوالي 15-20 ميكرومتر) 7. ومع ذلك، لاستخراج توزيع BCM في البنكرياس الماوس قدمت البروتوكولات البيانات أن أكثر من مباراة جيدة تلك التي حصلت عليها نقطة مثل العد الشكلي 3،13 وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من تنفيذ البروتوكول CLAHE يسمح للكشف عن الجزر أكثر بكثير ، وهذه عادة ما تكون أصغر الجزر ولا إسهاماتالشركة المصرية للاتصالات إلى حد كبير في حجم خلايا β بشكل عام.

البروتوكولات المعنية هي المناعى طويلة نسبيا (تصل إلى أسبوعين)، ولكن يد الفعلية في الوقت المحدد لإعداد عينة قصيرة، وبالتالي هي مناسبة تماما للتقنية لدراسة الأفواج الكبيرة من الحيوانات 9. إذا كان من المحتمل أنماط التوزيع غيروي المنشأ هو التركيز لتحقيق ذلك، ينبغي التأكيد على أنه ينبغي توخي الحذر في الخطوات المتعلقة تثبيت وتركيب لتجنب أن يصبح البنكرياس والأنسجة إصلاح بطريقة غير المواتية وشقة ("انتشرت" وينبغي أن تسعى) جبل من الأنسجة للتسهيل مثل هذه التقييمات.

قضية هامة عند تنفيذ الأراضي الفلسطينية المحتلة هو أن يتم إصلاح COM العينة لفي محور الدوران، وأنه لا يتحرك، إما رأسيا أو أفقيا، أثناء إجراء المسح. ولذلك فمن الضروري أن يكون هناك إعداد مستقرة الميكانيكية ونظام يعمل بشكل جيد لattachiنانوغرام العينة. حللنا هذه المشكلة عن طريق بناء جبل جديدة (الشكل 7).

كان الهندسة موازية لا ينطبق على الأراضي الفلسطينية المحتلة، NIR لدينا أو الماسح الضوئي Bioptonics 3001، والتي تم الكشف على أنه تحول الرأسي بين الظهر والمواقع الامامية من الكائنات المحيطية في صور الإسقاط المسجلة. عن طريق ضبط المسافة إلى كائن مصدر في ملف السجل من الماسح الضوئي منها (انظر 2.3.1) يمكن أن تحسن إلى حد كبير نوعية البيانات المتوفرة لدينا وتصحيح التشوهات الهندسية للفي حواف بكثير من الصور الإسقاط، والتي لها أهمية خاصة عند تقييم العينات أكبر.

في البروتوكول الحالي، ونحن نقدم اقتراحا من مجموعات التصفية التي تسمح التصور من ثلاث قنوات مختلفة ومحددة "التشريح" قناة في تقييم الاستعدادات البنكرياس سليمة. من الواضح أن هذه الإعدادات تكون التضمين لتناسب بشكل أفضل fluorochromes تستخدم لدراسة معينة على الرغم، كما كل أشكال fluoresالمجهر المائة، ينبغي الأخطار المحتملة للإشارة تنزف من خلال تقييم دقيق. دراسة الجزر الأنسولين المسمى مع fluorochromes التي نحن متحمسون فوق 750 نانومتر لم يتسن بعد من قبلنا باستخدام مصباح هاليد المعدنية التي تستخدم لدينا مجموعة لأعلى. فمن الممكن أن كاميرا مع كفاءة أعلى من ذلك الكم في الأطوال الموجية ذات الصلة بالاشتراك مع مصادر الضوء البديل (الصمام الثنائي ليزر مثلا) يمكن أن يزيد من احتمال مزيد من الأراضي الفلسطينية المحتلة نير والسماح للتصوير عند أطوال موجية أعلى من ذلك.

الأراضي الفلسطينية المحتلة هو أسلوب التصوير تنوعا للغاية لتقييم المكاني والكمي لعينة الطبية الحيوية على مقياس الطول ملم. على الرغم من أن وضعت البروتوكولات المعروضة هنا لغرض الرئيسي من البنكرياس / السكري البحوث ينبغي أن تكون ممكنة لترجمة البحوث إلى على الأنواع الأخرى، وأنواع العينات وعلامات. من القدرة على تصور قنوات متميزة في العديد من الأعمال التحضيرية البنكرياس سليمة، نير الأراضي الفلسطينية المحتلة و التصويرurther تحمل في طياتها احتمال كأداة لتقييم نوعية امتصاص المعدة للعوامل التباين غير الغازية التقييمات من طرائق التصوير الأخرى، ما دام يمكن تصميم هذه العوامل على النقيض من تحمل أيضا fluorophore كشفها بواسطة الأراضي الفلسطينية المحتلة.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ومن المسلم به الدكتور يندستروم P. ​​لتوفير OB / OB الفئران. ومن المسلم به J. Lehtonen للحصول على المساعدة مع إنتاج الفيديو وجيلبرت J. للمساعدة في التحرير. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من مؤسسة معهد بحوث السكري (AP)، ومؤسسة أبحاث السكري الأحداث (AP وUA)، والمفوضية الأوروبية (FP-7، اتفاقية المنحة رقم: CP-IP 228933-2) (JS و UA)، وأسس كيمبي، جامعة أوميا ومجلس البحوث السويدية لUA

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methanol Scharlau ME03162500
30% H2O2 Scharlau HI01362500
Benzyl Alcohol Scharlau AL01611000
Benzyl Benzoate Scharlau BE01851000
Low-meltingpoint agarose LONZA 50100
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 158127
DMSO Sigma-Aldrich D5879
Triton-X100 Sigma-Aldrich T8787
Mouse anti-aSMA-Cy3 Sigma-Aldrich C6198 Primary antibody
Rabbit anti-CD3 Sigma-Aldrich C7930 Primary antibody
Guinea Pig anti-Ins DAKO A0564 Primary antibody
Donkey anti GP-IRDye680 LI-COR Biosciences 926-32421 Secondary antibody
Goat anti Rb-DyeLight750 Thermo Scientific 35570 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11076 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa488 Molecular Probes A-11008 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa594 Molecular Probes A-11012 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa680 Molecular Probes A-21076 Secondary antibody
Goat anti GP-Alexa750 Molecular Probes A-21039 Secondary antibody
OPT Skyscan 3001 Bioptonics OPT-Scanner
Leica MZ FLIII Leica Microsystems Stereomicroscope
Leica Objective 0.5x Leica Microsystems 10446157
Leica Camera adapter 1.0x Leica Microsystems 10445930
EL6000 Metal Halide 11504115 Lightsource
Liquid Light Guide 11504116
Cuvette Hellma Analytics 6030-OG 55 x 55 x 52.5 mm
Mirror Edmund Optics F68-334 50 x 50 mm
Andor Ikon-M Andor Technology DU934N-BV Back-illuminated CCD
Filterset Chroma Technology 41021-MZFLIII TXR, Alexa-594, Cy3
Filterset Chroma Technology 41022-MZFLIII IRDye680, Alexa-680
Filterset Chroma Technology 49037-MZFLIII Dylight750, Alexa-750
ProteinG-Sepharose beads GE Healthcare 17-0618-01 Protein G Sepharose 4 Fast Flow
Sodium Azide Sigma-Aldrich 08591 Sodium azide 0.1 M solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
  2. Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
  3. Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
  4. Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
  5. Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
  6. Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
  7. Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
  8. Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070 (2008).
  9. Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
  10. Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
  11. Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753 (2011).
  12. Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
  13. Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).

Tags

الطب، العدد 71، الهندسة الطبية الحيوية، علم الأحياء الخلوي، علم الأحياء الجزيئية، الفيزياء الحيوية والبنكرياس وجزر لانجرهانز، داء السكري، التصوير، ثلاثي الأبعاد، التصوير المقطعي الإسقاط الضوئي، قداس بيتا خلايا، بالقرب من الأشعة تحت الحمراء، معالجة الحاسوبية

Erratum

Formal Correction: Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research
Posted by JoVE Editors on 11/05/2018. Citeable Link.

A correction was made to Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Protocol section 1.1 was changed from:

Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

to:

Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

بالقرب من الأشعة تحت الحمراء التصوير المقطعي الإسقاط الضوئي لتقييم التوزيع الشامل β خلايا في أبحاث السكري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eriksson, A. U., Svensson, C.,… More

Eriksson, A. U., Svensson, C., Hörnblad, A., Cheddad, A., Kostromina, E., Eriksson, M., Norlin, N., Pileggi, A., Sharpe, J., Georgsson, F., Alanentalo, T., Ahlgren, U. Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. J. Vis. Exp. (71), e50238, doi:10.3791/50238 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter