ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
We beschrijven de aanpassing van optische projectie tomografie (OPT)
Abstract
Door aanpassing OPT de capaciteit van imaging in het nabije infrarood (NIR) spectrum bevatten we hier illustreren de mogelijkheid om opname groter organen van pancreasweefsel, zoals de rat pancreas en het aantal kanalen (celtypen) dat afhankelijk worden bestudeerd in een monster. We beschrijven verder de uitvoering van een aantal computerhulpmiddelen die voorzien: 1 / nauwkeurige positionering van (in ons geval de pancreas) een exemplaar massamiddelpunt van (COM) op de rotatieas (AR) 2, 2 / verbeterde algoritmen voor post -alignment tuning die geometrische vervormingen voorkomt tijdens de tomografische reconstructie 2 en 3 / a protocol voor egalisatie intensiteit te verhogen signaal-ruisverhoudingen in OPT gebaseerde bepalingen BCM 3. Daarnaast beschrijven we een monsterhouder dat het risico voor onbedoelde bewegingen van het model minimaliseert tijdens beeldacquisitie. Samen vormen deze protocollen kunnen evaluaties van BCM distributie en anderener functies worden uitgevoerd binnen de omvang van intact pancreata of andere organen (bijv. in studies van eilandjestransplantatie), met een resolutie tot op het niveau van individuele eilandjes van Langerhans.
Introduction
De insuline producerende β-cellen toets vermogen van het lichaam om bloed glucose homeostase controleren. Daarom evaluaties van de alvleesklier BCM distributie zijn noodzakelijk om veel gebieden van pre-klinische onderzoek naar diabetes. In evaluaties van therapeutische regimes bijvoorbeeld het effect van gerichte gen ablatie op endocriene celdifferentiatie of studies van diabetes etiologie in diermodellen voor de ziekte vaak afhangen van analyses. Traditioneel zijn deze soorten beoordelingen aangevoerde tijdrovend Stereologische benaderingen moeilijk vanwege de grootte en complexe anatomische samenstelling van de pancreas voeren. De meeste hoge resolutie imaging methoden op dit moment (meestal optisch), niet voldoende indringdiepte op hele alvleesklier beeldvorming mogelijk bij knaagdieren. Omgekeerd imaging benaderingen die niet zijn beperkt door hun penetratiediepte (typisch kern) aan arme oplossing van het volledige BCM distributie lossen en worden belemmerddoor het gebrek aan adequate contrastmiddelen 4,5.
Optische projectie tomografie is een 3D-beeldvormende modaliteit die een hoge resolutie evaluaties van biomedische maakt op de mm tot cm schaal 6. Hierdoor kan informatie over de ruimtelijke positie en volume van de afzonderlijke insuline expressie eilandjes van Langerhans worden geëxtraheerd door het volume van de pancreas in normale en diabetische muizen 3,7-10. Het doel van deze studie is verder de capaciteit van deze techniek voor de beoordeling van pancreatische β-cellen, hun endogene verdeling bij geënt in andere weefsels, hun verhouding tot andere bestanddelen pancreas (zoals infiltreren celtypes) en in grotere pancreas voorbereidingen dan voorheen mogelijk was.
De nabij-infrarood optische projectie tomografie (NIR-OPT) setup
In de onderstaande protocollen, een scanner OPT gebaseerd op de oorspronkelijke opstelling beschreven door Sharpe
Een metaalhalogenidelamp die hogere excitatie energie dan een kwik-booglamp biedt bij golflengten boven 650 nm, levert het excitatielicht. Het licht wordt overgebracht door middel van een vloeistof lichtgeleider. Een bruikbare combinatie van fluorochromen en banddoorlaatfilter voor NIR fluorescentie beeldvorming en kanaalscheiding worden getoond in Figuur 3. Het uitgezonden licht wordt gedetecteerd met een achterzijde verlichte CCD camera met hoog kwantumrendement in het NIR spectrum. Het OPT scannen wordt geautomatiseerd met behulp van een LabView platform dat de camera regelt en stappenmotor. Monsters in de grootte van intacte rat pancreata, een beschermde verzilverde spiegel en een grote cuvette ondersteund wordt. Tot slot, een monsterhouder die ongewenste verticale movemen elimineertts van het monster tijdens de scan is ontworpen.
Protocol
1. Monstervoorbereiding en scannen
1,1 Monstervoorbereiding
De volgende procedure is in hoofdzaak uitgevoerd zoals eerder beschreven 7.
- Oogst de alvleesklier. Gebruik ijskoude PBS om proteolytische afbraak te voorkomen.
- Bevestig het weefsel in 4% PFA in PBS op ijs gedurende 2-3 uur. Zorg ervoor dat de lobben zijn "uitgespreid" tijdens fixatie. Dit vergemakkelijkt de identificatie van anatomische oriëntatiepunten na reconstructie.
- Wassen in overmaat PBS gedurende 30 minuten.
- Drogen de pancreas stapsgewijs in methanol (33, 66%, 100%), 15 min / stap. Dit minimaliseert de vorming van luchtbellen tijdens het bleken (zie stap 5) en voorkomt celvernietiging in vriesdooien (zie stap 7).
- Incubeer het weefsel in vers bereide MeOH: H 2 O 2: DMSO bleken buffer in een verhouding 02:01:03 bij kamertemperatuur gedurende 24 uur aan endogene weefsel fluorescentie doven. Voor grotere monsters, uitwisseling van nieuwe bleaching buffer en incubeer gedurende nog eens 24 uur.
- Was dan MeOH, ON.
- Vries-dooi tenminste 5 cycli in -80 ° C - RT van antilichaam penetratie te vergemakkelijken.
- Terug naar rehydrateren stapsgewijze TBST (33, 66%, 100%), 15 min / stap.
- Block in TBST met 10% serum (bij voorkeur van dezelfde soort waarin het secundaire antilichaam is opgewekt), 5% DMSO en 0,01% Naaz gedurende 12-24 uur bij RT
- Incuberen met primaire antilichamen in blokkeerbuffer gedurende 48 uur, bij kamertemperatuur, zelfs 72 uur voor grotere monsters (antilichamen hier gebruikt zijn in de tabel van reagentia).
- Was dan TBST, ON.
- Incubeer met fluorescent geconjugeerde secundaire antilichamen gedurende 48 uur, bij kamertemperatuur, zelfs 72 uur voor grotere monsters.
- Was dan TBST, ON.
1,2
De volgende procedure beschrijft hoe u het monster te monteren in agarose en bevestig deze aan de op maat gemaakte monsterhouder (zie figuur 7) Voorafgaand aan het scannen OPT.
- Scheid de milt, twaalfvingerige darm en maag lobben volgens 3A in Hörnblad et al. figuur 3. De relatie tussen de lobben wordt nader verduidelijkt in Hörnblad et al. 11.
- Bereid 1,5% (w / v) agarose met lage smelttemperatuur in dH 2 O, filter, laat afkoelen tot 37 ° C en spoel het weefsel in dH 2 O wegwassen het wasmiddel en bellen te verwijderen voordat agarose-inbedden op ijs.
- Knip een agarose blok omsluit uw monster en laat een ~ 1 cm spacer tussen het monster en de basis van de agarose. Trim scherpe randen (≤ 90 °) van de agarose blok lichtverstrooiing te verminderen.
- Dehydrateren het monster stapsgewijs in MeOH (33, 66%, 100%), waardoor de tijd om evenwicht tussen elke stap. Wanneer het monster zakt wordt geacht geëquilibreerd.
- Schakel het monster in een 1:2 oplossing van Benzyl Alcohol: Benzyl Benzoaat (BABB) totdat het transparant. Exchange BABB oplossing en incubeer gedurende een extra 12 uur.
- Plaats de gewist monster in de monsterhouder en zet hem vast door het invoegen van twee naalden door de agarose spacer via de gaten in de flenzen van de houder.
- Het monster in de scanner en dompel het in een cuvet gevuld met BABB clearing oplossing. Bij vergelijking van een reeks pancreata dezelfde vergroting worden gebruikt voor alle scans. De vergroting moet worden geoptimaliseerd voor de grootste bemonstering in de reeks.
1,3 Positionering van het monster op de AR
Het volgende protocol beschrijft de procedure om nauwkeurig te positioneren een voorbeeld met de COM-AR algoritme. Deze procedure is alleen van toepassing wanneer het ROI omvat het volledige specimen. Voor gedetailleerde beschrijvingen van de algoritmen, zie Cheddad et al. 2.
- Acquire beelden van het monster in twee posities voor both de anatomie en signaalkanalen. Positie 1 op 0 ° (zoals de X-as), tonen de grootste projectiegebied en positie 2 op 90 ° (behorende bij de Z-as). We gebruiken de GFP kanaal naar de anatomie te visualiseren.
- Breng de verwachting-maximalisatie (EM) algoritme op de anatomie beelden drempel van de ROI.
- Bereken de COM punten (x-coördinaten) van het binaire beelden verkregen in stap 2 voor zowel de 0 ° en 90 ° projecties.
- Superponeren een verticale lijn die door het geïdentificeerde COM punt berekend in stap 3 op de 0 ° en 90 ° beelden van het signaal kanaal.
- De beelden verkregen in stap 4 als verwijzingen naar het monster, zodat de hartlijn van het gezichtsveld passeert de gevonden COM van het proefmodel bewegen.
1,4 scannen
- Pas belichtingstijden om de hoogste signaal te bereiken ruisverhouding mogelijk zonder verzadigingling alle gebieden van de projectie beelden. Herhaal dit voor alle kanalen te scannen.
- Selecteer de filter set voor de eerste fluorescentiekanaal te scannen. Emissie van kortere λ fluoroforen kunnen prikkelen fluoroforen met langere λ en veroorzaken daardoor foto bleken. Om dit te voorkomen, eerst scannen de fluorofoor met langste excitatie λ.
- Opent de sluiter aan het monster te verlichten en het fluorescentiesignaal over 360 ° verzamelen roteren het monster langs de verticale as voor elk kanaal. De stap hoek gebruikt voor de NIR-OPT setup is 0,9 ° en voor de Bioptonics 3001 scanner 0,45 °.
- Selecteer de juiste filter voor het volgende kanaal en ga verder zoals hierboven.
2. Computational Verwerking en Wederopbouw
2,1 Post-acquisitie uitlijning detectie en correctie (A-waarde tuning)
In projectie tomografie is het in het algemeen noodzakelijkeen post-uitlijningswaarde de projecties te verfijnen de beelden positie langs de draaias voor reconstructie wijzen. Toch kan een kleine afwijking in de hoek van de camera naar de optische as veroorzaken niet-uniforme A-waarden over de lengte van het monster, zodat induceren geometrische vervormingen. Om dergelijke verstoringen te voorkomen, kan een computationele methode om de juiste en uniforme post-uitlijning waarde (A-waarde) vinden in het gehele monster worden toegepast 2.
- Gebruik een discrete Fourier transformatie een projectie van het specifieke signaal bij 0 ° en 180 ° in 8 pixels hoog blokken verdelen en de verschuiving langs de x-as (de A-waarde) tussen elk blok berekenen.
- Breng een lineaire kleinste kwadraten regressie om berekenen hoek θ ', waarbij de helling van de x-as-verschuiving langs de lengte van het monster beschreven, en een rotatie middelpunt vinden.
- Corrigeren voor verplaatsingen tijdens het scannen door het draaien van alle ProjeCTIES θ '/ 2 rond de rotatie-middelpunt.
2,2 Contrast beperkte adaptieve histogram egalisatie (CLAHE)
Om detectie en segmentatie van objecten (eilandjes) vertoont zeer zwakke signalen, die het risico lopen te "thresholded out" tijdens het verbouwen en / of segmentatie voor kwantitatieve evaluaties te vergemakkelijken, kan een CLAHE algoritme toegepast op de projectiebeelden. De CLAHE bewerking wordt uitgevoerd met twee grote intensiteit transformaties:
- De lokale contrast wordt geschat en gelijk in niet-overlappende blokken in het geprojecteerde beeld.
- De intensiteiten worden vervolgens genormaliseerd op de grensgebieden tussen de blokken door middel van bilineaire interpolatie.
De naam contrast-beperkte verwijst naar de clip limiet, die is ingesteld om het verzadigen pixels voorkomen in het beeld. In dit protocol, de MATLAB ingebouwde functie "adapthisteq" werd gebruikt en toegepast met de standaard c lip limiet van 0,01 en een tegel grootte van 256. Merk de optimale tegelgrootte moet empirisch worden getest en kan variëren afhankelijk van de geanalyseerde monster. Meer details over het algoritme en voorbeelden zijn te vinden in Hörnblad et al. 3.
Let op! De hierboven genoemde computationele processtappen (inclusief COM-AR, A-waarde tuning en CLAHE, zie 1,3 tot 2,2) zijn gebouwd op standaard algoritmen en worden uitgevoerd in MATLAB (Mathworks).
2,3 Tomografische wederopbouw en iso-oppervlak rendering
- Met behulp van een gefilterde terugprojectie-algoritme, kunnen de gecorrigeerde en de genormaliseerde beelden nu worden gereconstrueerd met unified verkeerde uitlijning compensatie en minimale vereiste voor optimalisatie van dynamisch bereik. In dit protocol worden alle reconstructies uitgevoerd met het gefilterde terugprojectie werkwijze in de NRecon software (Skyscan), versie 1.6.8 (= "_blank"> Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Let op, de vergroting van een afgebeeld object hangt af van de afstand van het brandpunt van de lens, tenzij parallelle bundel geometrie is geïmplementeerd in de beeldvorming setup. Derhalve het importeren van een uitsteeksel om de dataset NRecon software is het belangrijk om de juiste object source afstand (mm) en de draairichting van de scanner (voor linksom input "cc" en voor rechtse ingang "cw") in de begeleidende log-bestand, om cone beam geïnduceerde artefacten te vermijden tijdens de wederopbouw.
- Te visualiseren en kwantificeren van de stapel verkregen virtuele secties, het genereren van 3D iso-oppervlakken met behulp van geschikte software voor beeldverwerking, zoals Imaris of Volocity.
Murine eilandje isolatie en transplantatie procedures werden uitgevoerd op Gegevens uit het preklinisch Cell Processing het Diabetes Research Institute en translationeel Model Core onder protocollen beoordeeld en goedgekeurd door de Universiteit van Miami Institutionele Animal Care en gebruik Comite. De ethische commissie voor dierproeven, het noorden van Zweden, keurden alle andere experimenten met dieren.
Representative Results
In het huidige rapport beschrijven we een protocol voor de extractie en computationele verwerking van BCM gegevens in knaagdier pancreata (en andere weefsels) met behulp van NIR-OPT (figuur 1). Zoals geïllustreerd in figuur 2, wordt weefsel van de pancreas autofluorescense specimen verwachting aanzienlijk afgenomen het NIR spectrum. Dit leidt tot een aanzienlijke toename van de gemiddelde signaal-ruisverhouding (S: N) voor de beoordeling van insuline gemerkte eilandjes van Langerhans. De aanpassingen van OPT tot beeldvorming in het NIR deel van het spectrum, zoals hierin beschreven, kan ten minste drie specifieke kanalen zichtbaar worden gemaakt met voldoende S: R-verhouding beoordeling van antilichaam gelabeld celtypen mogelijk maken binnen de omvang van de muizen met verschillende pancreas kanaalscheiding (zie figuur 3 en 4). Toegepast op beeldvorming van diabetogene processen en / of BCM assessments in het algemeen de techniek maakt derhalve voor de visualisatie en kwantificering vaninsuline positieve gebieden met betrekking tot omgeving en / of interactie celtypes (zie figuur 4). Deze beoordelingen zijn door de verhoogde penetratie diepte verkregen in het NIR bereik mogelijk om in veel grotere specimens dan voorheen, zoals de rat pancreas, die 3-5 keer groter dan de muis tegenhanger (zie figuur 5). Ongeacht of zichtbare of NIR golflengten worden gebruikt, kan de implementatie van CLAHE aanzienlijk vergemakkelijken OPT assessments van BCM gedurende verschillende genetische en fysiologische omstandigheden door verhoging van de detectiegevoeligheid van de techniek (zie figuur 6). Een blauwdruk voor de ontwikkelde monsterhouder wordt getoond in figuur 7.
Figuur 1. Flowchart beeltenis van de kritische stappen voor OPT gebaseerde analyses van BCM in de murine alvleesklier. De tijd die nodig is om een typische muis pancreas te beoordelen is 13-14 dagen. Het merendeel van de tijd wordt verbruikt tijdens weefselverwerking en immunohistochemische kleuring (10 dagen), weefsel clearing heeft ongeveer 2 dagen, terwijl de lengte van de scanning is afhankelijk van de vereiste belichtingstijd (gewoonlijk ongeveer 1 uur). De volgende rekenkundige bewerking algemeen uitgevoerd binnen een dag. Mee dat het relatief lang kleuringsprotocol ideaal voor batchverwerking van grotere hoeveelheden specimens.
Figuur 2. Signaal-ruis verhoudingen voor BCM evaluaties bij verschillende golflengten. Een muis twaalfvingerige darm alvleesklier kwab, gekleurd voor insuline en met een cocktail van fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen (Alexa 488, 594, 680 en750), werd gebruikt om te bepalen S: N-verhoudingen bij verschillende golflengten. Een, Beelden tonen de eerste projectie frame voor elk signaal kanaal. B, grafiek die de gemiddelde S: N voor elk signaalkanaal. De verhoudingen werden bepaald als de gemiddelde intensiteit eilandje (gebaseerd op 215 eilandjes) gedeeld door de achtergrond intensiteit (de endogene weefsel fluorescentie van de exocriene weefsel). C, Grafiek met S: N ratio's voor de individuele eilandjes in elk kanaal genormaliseerd naar de S: N verkregen voor de Alexa 594-kanaal. Een way ANOVA werd gebruikt voor statistische analyse. Significantieniveaus aangegeven overeen met ** p <0,01. Scale bar in (A) komt overeen met 1 mm. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur3. Kanaalscheiding. A werden secundaire antilichamen geconjugeerd met Alexafluor kleurstoffen in de tabel afzonderlijk geïmmobiliseerd op proteinG-sepharose korrels. B, werden de fluorescerende korrels vervolgens ingebed op verschillende niveaus in een agarose fantoom en afgebeeld met behulp van de aangegeven filters.
Figuur 4. OPT multichannel beeldvorming in diabetesonderzoek. A, OPT gebaseerd iso-oppervlak reconstructie van een pancreas (12 weken, duodenale kwab) van de niet-obese diabetische (NOD) model voor type 1 diabetes. Het monster wordt gekleurd voor insuline (islet β-cellen, pseudo blauw); gladde spier α-actine (bloedvaten, rood) en CD3 (infiltrerende T-lymfocyten, groen). De overeenkomstige gebruikte secundaire antilichamen waren; Cy3, IRDye-680 en DyeLight-750 respectievelijk. Deinzetstukken (A'-A'' ') laten de individuele signaalkanalen. B, OPT beeld (blow up) van een muis leverkwab (lobus sinister lateralis) geënt met syngene eilandjes en afgebeeld met NIR-OPT twee weken na transplantatie. De insuline uitdrukken eilandjes zijn pseuodocolored in blauw en de gladde spieren α-actine positieve schepen zijn in het rood. De aanpak maakt de beoordeling van eilandje graft verdeling binnen de vasculaire netwerk. Scale corresponderen met 1 mm.
Figuur 5. NIR-OPT vergemakkelijkt de beeldvorming van grotere exemplaren. A, Iso-oppervlak weergave van de BCM verdeling in een rat alvleesklier van de Zucker Fatty model voor type 2 diabetes (milt lob na 9 maanden), hetgeen tekenend is de mogelijkheid om de afbeelding monster op de rat pancreas schaal door NIR-OPT. Bepaalddoor deze techniek de weergegeven kwab is ~ 6 keer groter (v / v) dan zijn tegenhanger muizen en herbergt 10139 insuline expressie eilandjes van Langerhans waarvan β-cell volume maakt 1,32% van het totale volume lobulaire. B, Tomografische gedeelte overeenkomt met de onderbroken lijn in (A) illustreert dat eilandjes van elke diepte van het weefsel wordt gedetecteerd. C, Iso-oppervlak weergave van de BCM distributie in een muis pancreas (milt kwab bij 8 weken) weergegeven als een grootte referentie. De weergegeven kwab herbergt 2490 insuline expressie eilandjes waarvan β-cell volume maakt 0,89% van het totale volume lobulaire. De pancreata worden gekleurd met GP anti-insuline gevolgd door Alexa594 geconjugeerd geit anti-GP (muis) en IRDye 680 geconjugeerd ezel anti-GP (rat) antilichamen respectievelijk. De specimens in (AC) worden weergegeven op schaal en de schaal bar in (C) komt overeen met 2 mm.
Figuur 6. CLAHE vergemakkelijkt de detectie van eilandjes in het muizen alvleesklier door OPT beeldvorming. AC, vertegenwoordiger iso-oppervlak gemaakt OPT beelden van een C57Bl / 6 muis pancreas (milt kwab bij 8 weken) gelabeld voor insuline. Iso-oppervlak reconstructies van OPT beelden werden uitgevoerd vóór (A, pseudo groen) en na de CLAHE protocol werd toegepast (B, pseudo rood). C, Overlay van de niet-genormaliseerde data in (A) en de CLAHE verwerkte gegevens (B). C'-C ", Representative hoge vergroting overlay van het niet-genormaliseerde (A) en CLAHE verwerkte (B) beelden. Zoals blijkt uit de aanwezigheid van" red-only "eilandjes, de CLAHE script vergemakkelijkt de detectie van kleine en laag signaal intensiteit eilandjes. In het huidige voorbeeld de afgebeelde model (na CLAHE verwerking) 2419 eilandjes herbergde met een volume van 1,74 mm 3 (nummers gebaseerd op de overeenkomstige onbewerkte projectiedata was 1057 eilandjes with een volume van 1,77 mm 3). D en E, Voorbeeld data van controle (D) en de ob / ob muis model voor type 2 diabetes 12 (E) na 6 maanden de uitvoering CLAHE protocol. Let op de enorme algemene toename eilandje grootte in de ob / ob pancreas (E). In (D) en (E) de pancreas omtrek (grijs) is gebaseerd op het signaal van weefsel autofluorescentie. Schaalbalk in C is 500 urn in AC. Schaalbalk in C "overeen 200 pm in C 'en C''. Schaalbalk in E overeen met 1 mm in (D) en (E). Images in (AC) zijn afgeleid Hörnblad et al. 3 en werden gegenereerd met behulp van de Bioptonics 3001 scanner.
Figuur 7. Voorbeeld houder voor de bevestiging van OPT exemplaren. Het monster is beveiligd door het plaatsen van naalden door de agarose spacer via de voorgeboorde gaten in de flenzen. De houder is scharnierend bevestigd aan de stappenmotor via eensterke magneet in de basis. Deze opzet weggelaten het gebruik van onstabiele lijmen en voorkomt ongewenste bewegingen van het monster tijdens het scannen.
Discussion
De beschreven technieken voor OPT imaging maakt winning van ruimtelijke en kwantitatieve parameters gehele volume van de muizen pancreas. Vanwege beperkingen in haalbare resolutie voor dit type mesoscopische beeldvorming moet worden opgemerkt dat, zoals voor de meeste beeldvormende technieken, hoe groter het monster lager de resolutie (Hoewel het gebruik van een hogere resolutie CCD de resolutie van de scan OPT verhogen) . Derhalve voor de beoordeling van intacte alvleesklier muis lobben, is de techniek thans geen enkele cel resolutie maar dicht (ca. 15-20 pm) 7. Toch voor de extractie van BCM verdeling in de muis pancreas protocollen hebben data die meer dan ook die verkregen door bijvoorbeeld puntentelling morfometrie 3,13 passende Er zij opgemerkt dat, hoewel de uitvoering van het protocol CLAHE maakt detectie van aanzienlijk eilandjes Deze eilandjes zijn over het algemeen kleiner en niet bijdragente hoofdzaak de algemene β-cel volumes.
De betrokken immunohistochemische protocollen relatief lang (tot twee weken), maar de werkelijke handen op tijd prepareren is kort en dus de techniek is geschikt voor de studie van grote cohorten dieren 9. Wanneer het potentieel van heterogene distributie patronen is een focus voor het onderzoek, moet worden benadrukt dat de zorg moet worden genomen in de stappen met betrekking tot fixatie en montage te voorkomen dat de pancreas weefsel wordt gefixeerd in een ongunstige manier en een platte ("uitgespreid" ) berg van het weefsel moet worden nagestreefd om dergelijke beoordelingen te vergemakkelijken.
Een belangrijk probleem bij het uitvoeren van OPT is dat de steekproef de COM is vastgesteld op de rotatie-as en dat het niet beweegt, verticaal of horizontaal, tijdens de scanprocedure. Daarom is het essentieel te beschikken over een stabiele mechanische setup en een goed functionerend systeem voor attaching van het monster. We opgelost door de bouw van een nieuwe mount (Figuur 7).
Parallel geometrie gold niet voor onze NIR-OPT of Bioptonics 3001 scanner, die werd gedetecteerd als een verticale verschuiving tussen de achter-en voorkant posities van de perifere objecten in de opgenomen projectie beelden. Door de object source afstand in het logbestand van de betreffende scanner (zie 2.3.1) we aanzienlijke verbetering van de kwaliteit van de data en corrigeert geometrische vervormingen aan de andere randen van de projectiebeelden, hetgeen van bijzonder belang wanneer beoordelen grotere specimens.
In het huidige protocol, bieden we een suggestie van filtersets dat visualisatie van drie verschillende specifieke kanalen en een "anatomie" kanaal in de beoordelingen van de intacte alvleesklier voorbereidingen mogelijk te maken. Uiteraard deze instellingen kunnen worden gemoduleerd om beter passen bij de fluorochromen gebruikt voor een bepaalde studie, hoewel, net als bij alle vormen van fluorescentiecent microscopie, moet het potentiële gevaar van het signaal doorbloeding zorgvuldig worden geëvalueerd. De studie van insuline gelabeld eilandjes met fluorochromen die zijn verheugd boven 750 nm is nog niet mogelijk geweest door ons met behulp van de metalen halide lamp dat onze set-up gebruikt. Het is mogelijk dat een camera met nog hogere kwantumrendement in de relevante golflengten in combinatie met alternatieve lichtbronnen (bv. diode lasers) zou de mogelijkheden van NIR-OPT verder vergroten en voor het afbeelden van nog hogere golflengten.
OPT beeldvorming is een zeer veelzijdige techniek voor ruimtelijke en kwantitatieve beoordelingen van biomedisch specimen op de mm-cm schaal. Hoewel de protocollen die hier zijn ontwikkeld voor het hoofddoel van pancreas / diabetes research moeten zij worden vertaald naar andere soorten onderzoek, specimen en types markers. Door de mogelijkheid om een aantal verschillende kanalen te visualiseren in intacte alvleesklier preparaten, NIR-OPT beeldvorming fERDERE heeft de potentie als middel om de opname specificiteit van contrastmiddelen voor niet-invasieve evaluatie van andere beeldvormingsmodaliteiten zolang deze contrastmiddelen kunnen worden ontworpen om een fluorofoor dragen ook detecteerbaar met OPT evalueren.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dr P. Lindström wordt erkend voor het verschaffen van ob / ob muizen. J. Lehtonen is erkend voor hulp bij videoproductie en J. Gilbert voor hulp bij het bewerken. Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Diabetes Research Institute Foundation (AP), de Juvenile Diabetes Research Foundation (AP en UA), de Europese Commissie (FP-7, Subsidieovereenkomst nr.:. CP-IP +228,933-2) (JS en UA), de Kempe Stichtingen, Umeå Universiteit en de Zweedse Research Council om UA
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Scharlau | ME03162500 | |
| 30% H2O2 | Scharlau | HI01362500 | |
| Benzyl Alcohol | Scharlau | AL01611000 | |
| Benzyl Benzoate | Scharlau | BE01851000 | |
| Low-meltingpoint agarose | LONZA | 50100 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Mouse anti-aSMA-Cy3 | Sigma-Aldrich | C6198 | Primary antibody |
| Rabbit anti-CD3 | Sigma-Aldrich | C7930 | Primary antibody |
| Guinea Pig anti-Ins | DAKO | A0564 | Primary antibody |
| Donkey anti GP-IRDye680 | LI-COR Biosciences | 926-32421 | Secondary antibody |
| Goat anti Rb-DyeLight750 | Thermo Scientific | 35570 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa488 | Molecular Probes | A-11008 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa594 | Molecular Probes | A-11012 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa680 | Molecular Probes | A-21076 | Secondary antibody |
| Goat anti GP-Alexa750 | Molecular Probes | A-21039 | Secondary antibody |
| OPT Skyscan 3001 | Bioptonics | OPT-Scanner | |
| Leica MZ FLIII | Leica Microsystems | Stereomicroscope | |
| Leica Objective 0.5x | Leica Microsystems | 10446157 | |
| Leica Camera adapter 1.0x | Leica Microsystems | 10445930 | |
| EL6000 Metal Halide | 11504115 | Lightsource | |
| Liquid Light Guide | 11504116 | ||
| Cuvette | Hellma Analytics | 6030-OG | 55 x 55 x 52.5 mm |
| Mirror | Edmund Optics | F68-334 | 50 x 50 mm |
| Andor Ikon-M | Andor Technology | DU934N-BV | Back-illuminated CCD |
| Filterset | Chroma Technology | 41021-MZFLIII | TXR, Alexa-594, Cy3 |
| Filterset | Chroma Technology | 41022-MZFLIII | IRDye680, Alexa-680 |
| Filterset | Chroma Technology | 49037-MZFLIII | Dylight750, Alexa-750 |
| ProteinG-Sepharose beads | GE Healthcare | 17-0618-01 | Protein G Sepharose 4 Fast Flow |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | 08591 | Sodium azide 0.1 M solution |
References
- Sharpe, J., et al. Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies. Science. 296, 541-545 (2002).
- Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography. IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).
- Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution. Islets. 3, 204-208 (2011).
- Holmberg, D., Ahlgren, U. Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology. Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).
- Ahlgren, U., Gotthardt, M. Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).
- Sharpe, J. Optical projection tomography. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).
- Alanentalo, T., et al. Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs. Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).
- Alanentalo, T., et al. High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas. J. Biomed. Opt. 13, 054070 (2008).
- Alanentalo, T., et al. Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes. Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).
- Sun, G., et al. Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo. Diabetologia. 53, 924-936 (2010).
- Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas. PLoS One. 6, e21753 (2011).
- Lindström, P. The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice). The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54, 133-137 (2005).
Tags
Geneeskunde Biomedische Technologie Cellular Biology Moleculaire Biologie Biofysica Alvleesklier eilandjes van Langerhans Diabetes Mellitus Imaging Three-Dimensional optische projectie Tomografie Beta-celmassa Near Infrared Computational ProcessingErratum
Formal Correction: Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research
Posted by JoVE Editors on 11/05/2018.
Citeable Link.
A correction was made to Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of β-cell Mass Distribution in Diabetes Research. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
