Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

أدوات جديدة لتوسيع الخلايا التائية التنظيمية من الأفراد HIV-1-المصابة

Published: May 30, 2013 doi: 10.3791/50244
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Ragon Institute of MGH, MIT, and Harvard, 2Division of Infectious Diseases, Massachusetts General Hospital

Abstract

CD4 + الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) هي جهري المناعي قوية وتؤدي وظيفة هامة في التوازن المناعي البشري. وقد أدى استنزاف Tregs إلى زيادات ملموسة في استجابة خلايا T مستضد محددة في إعدادات لقاح لسرطان ومسببات الأمراض المعدية. ومع ذلك، ودورها في HIV-1 المناعية المرضية لا تزال مثيرة للجدل، لأنها إما أن تكون لقمع تنشيط جهاز المناعة HIV-1-الضارة المرتبطة بها، وبالتالي إبطاء HIV-1 تطور المرض أو بدلا من قمع الحصانة HIV-1-محددة، وبالتالي تعزيز فيروس تنتشر. فهم وظيفة Treg تحوير في سياق HIV-1 يمكن أن يؤدي إلى استراتيجيات جديدة محتملة لعلاج مناعي أو لقاحات فيروس نقص المناعة البشرية. ومع ذلك، لا تزال هناك أسئلة مفتوحة على دورهم المهم في سياق فيروس نقص المناعة البشرية 1 العدوى، والتي تحتاج إلى أن تدرس بعناية.

وقد ثبت يمثلون ما يقرب من 5٪ من CD4 + الخلايا التائية البشرية في الدم المحيطي، ودراسة السكان Treg أن يكون صعبا، ESpecially وفي HIV-1 الأفراد المصابين حيث CD4 HIV-1-T الخلية المرتبطة بها ومع يحدث أن استنفاد Treg. توصيف الخلايا التائية التنظيمية في الأشخاص الذين يعانون المتقدمة HIV-1 مرض أو عينات الأنسجة، والتي يمكن الحصول عليها إلا عينات بيولوجية صغيرة جدا، وبالتالي صعبة للغاية. نقترح حلا تقنيا للتغلب على هذه القيود باستخدام العزل والتوسع في Tregs من الأفراد HIV-1-الإيجابية.

نحن هنا وصف طريقة سهلة وقوية لتوسيع بنجاح Tregs معزولة من الأفراد HIV-1-المصابة في المختبر. تدفق فرزها CD3 + CD4 + CD25 + وحفز CD127 منخفض Tregs مع anti-CD3/anti-CD28 حبات مغلفة والمثقف في حضور IL-2. وأعرب الموسع Tregs مستويات عالية من FOXP3، CTLA4 وهيليوس مقارنة مع الخلايا T التقليدية، وعرضت أن تكون قمعية للغاية. وتسهيل الوصول إلى أعداد كبيرة من Tregs تسمح للباحثين لمعالجة طأسئلة MPORTANT بشأن دورها في HIV-1 إمراض مناعي. ونحن نعتقد الإجابة على هذه الأسئلة يمكن أن توفر نظرة متعمقة مفيدة لتطوير AN-1 فيروس نقص المناعة البشرية قاح فعال.

Introduction

مع أكثر من 34 مليون شخص يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية / الإيدز في جميع أنحاء العالم ويقدر بنحو 2.5 مليون شخص أصيبوا حديثا في عام 2011، والحاجة إلى لقاح مضاد لفيروس نقص المناعة البشرية فعالة لكبح جماح وباء فيروس نقص المناعة البشرية في جميع أنحاء العالم لا تزال بالغة. ومع ذلك، على الرغم من ثلاثة عقود من الجهود البحثية المكثفة، أسفرت HIV-1 لقاح التجارب فعالية حتى الآن في حماية متواضعة فقط 1-3 ويرتبط الحصانة الواقية تظل غير مفهومة. توضيح طبيعة الاستجابة المناعية اللازمة لحماية أمر ضروري لتصميم استراتيجية لHIV-1 قاح فعال واستراتيجيات immunotherapeutic أخرى تستهدف HIV-1 العدوى.

CD4 + الخلايا التائية الطبيعية التنظيمية (Tregs) هي الحاسمة في الحفاظ على توازن الخلايا المناعية من خلال التحكم في تنشيط جهاز المناعة المفرطة، مما يحد من تلف الأنسجة مناعية. ومع ذلك، فإنها يمكن أيضا قمع الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض ومنع إزالتها. السرطان وهيباوقد أثبتت الدراسات titis قاح B أن خفض النشاط من Tregs يمكن أن تعزز استجابة لقاح والمستضد محددة حصانة ضد الفيروسات 4-7. ومع ذلك، في سياق HIV-1 العدوى، ويبقى التأثير الدقيق لخلايا T التنظيمية غير مفهومة تماما. عرضت Tregs لتقليل تكاثر الفيروس في الخلايا المنشطة T 8 و ربما تؤثر تنشيط جهاز المناعة 9. وقد تبين أيضا أنها لقمع الاستجابات المناعية HIV-1-محددة، والتي يمكن أن تكون لها نتائج سلبية على تطور المرض 10،11. وهكذا، قبل أن يتمكن لتعديل النشاط Treg لتعزيز فعالية لقاح فيروس نقص المناعة البشرية-1، فمن المهم للحصول على مزيد من التبصر في وظيفتها في هذا السياق المرض.

CD4 + الخلايا التائية البشرية التنظيمية هي مجموعة من السكان الخلية نادرة نسبيا، وهو ما يمثل حوالي 5٪ من خلايا CD4 + T في الدم المحيطي، وأعدادهم المطلقة مزيد من الانخفاض مع فيروس نقص المناعة البشرية CD4 + T المرتبطة نضوب الخلية 12 </ سوب>. المقايسات الحالية لتقييم وظيفة Treg، مثل T الخلية المقايسات الانتشار مع Treg الثقافة المشتركة، واستخدام أرقام خلية كبيرة نسبيا 12. ولذلك، واصفا وظيفة ونوعية الخلايا التائية التنظيمية في الأشخاص الذين يعانون المتقدمة HIV-1 مرض تم تحدي، على الرغم من أهميتها بالنسبة لإمراض فيروس نقص المناعة البشرية.

عزلة فيفو السابقين وتوسيع Tregs من HIV-1 المرضى يمكن أن تمثل حلا للتغلب على بعض هذه القيود. نحن هنا وصف بروتوكول سهلة وقوية لتوسيع Tregs الفنية المستمدة من HIV-1 الأفراد المصابين في المختبر، ونحن شرح كيفية زيادة النمط الظاهري لهم واختبار وظيفتها القمعية باستخدام التدفق المقايسات cytometric. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول تسهيل الوصول إلى Tregs وللمساعدة في فهم دورهم في HIV-1 تطور المرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail Stemcells technologies 15062
PBS Sigma D8537
FBS Sigma F4135
Histopaque Sigma H8889
Anti-CD3-PECy7 BD Pharmingen 557851
Anti-CD4-FITC eBioscience 11-0049-42
Anti-CD25-APC eBioscience 17-0259-42
Anti-CD127-PE BD Pharmingen 557938
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh BD Falcon 352235
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30-001-Cl
Human Serum Gemini Bio-Products 100-512
Human T-activator CD3/CD28 Life Technologies 111.31D
IL-2 NIH Aids Research Reference Reagent Program 136
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Life technologies L34955
Anti-CD4-qdot-655 Life Technologies Q10007
Anti-CD25-PECy5 eBiosciences 15-0259-42
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set eBiosciences 00-5523-00
Anti-FOXP3-PE eBiosciences 12-4776-42
Anti-HELIOS-FITC Biolegend 137204
Anti-CTLA4-APC BD Pharmingen 555855
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Life Technologies C34557
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Life Technologies V12883
HEPES Mediatech 25-060-Cl
Treg Suppression inspector Miltenyi Biotec 130-092-909
Anti-CD4-APC BD Pharmingen 340443
Anti-CD8-AF700 BD Pharmingen 557945
RPMI 1640 Sigma R0883
Glutamine Mediatech 25-002-Cl
Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) Becton, Dickinson and Company (BD) 364606
FACSAria IIu Cell Sorter BD Biosciences -
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences -
FlowJo Tree Star v887

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
  2. Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
  3. Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
  4. Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
  5. Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
  6. Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
  7. Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
  8. Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
  9. Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
  10. Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
  11. Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
  12. Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
  13. Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
  14. De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
  15. Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
  16. Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
  17. Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
  18. Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
  19. Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
  20. Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
  21. Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
  22. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
  23. Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
  24. Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
  25. Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
  26. Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
  27. Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
  28. Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
  29. Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
  30. Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
أدوات جديدة لتوسيع الخلايا التائية التنظيمية من الأفراد HIV-1-المصابة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Angin, M., King, M., Addo, M. M. New … More

Angin, M., King, M., Addo, M. M. New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals. J. Vis. Exp. (75), e50244, doi:10.3791/50244 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter