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Immunology and Infection

De nouveaux outils pour multiplier des cellules T régulatrices de personnes VIH-1-infected

Published: May 30, 2013 doi: 10.3791/50244
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Ragon Institute of MGH, MIT, and Harvard, 2Division of Infectious Diseases, Massachusetts General Hospital

Abstract

CD4 + lymphocytes T régulateurs (Tregs) sont des modulateurs immunitaires efficaces et jouent un rôle important dans l'homéostasie immunitaire humain. L'épuisement des Tregs a conduit à une augmentation mesurable de réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène dans les milieux de vaccin contre le cancer et les agents pathogènes infectieux. Cependant, leur rôle en matière de VIH-1 immuno-pathogénie reste controversée, car ils pourraient servir soit à supprimer l'activation immunitaire au VIH-1 associé délétère et ainsi ralentir la progression de la maladie du VIH-1 ou encore de supprimer l'immunité-1-spécifique du VIH et ainsi favoriser virus se propager. La compréhension et la fonction Treg modulation dans le contexte du VIH-1 pourraient mener à de nouvelles stratégies potentielles pour l'immunothérapie ou vaccins contre le VIH. Toutefois, des questions importantes restent ouvertes sur leur rôle dans le contexte de l'infection par le VIH-1, qui doit être soigneusement étudié.

Ce qui représente environ 5% des CD4 + humains des cellules T dans le sang périphérique, l'étude de la population Treg s'est avérée difficile, especially dans le VIH-1, où les individus infectés de cellules T CD4 de HIV-1 et associée à celle Treg appauvrissement se produit. La caractérisation des cellules T régulatrices chez les personnes à un stade avancé du VIH-1 des échantillons de tissus ou de maladie, pour laquelle seuls de très petits échantillons biologiques peuvent être obtenus, est donc extrêmement difficile. Nous proposons une solution technique pour surmonter ces limitations en utilisant l'isolement et l'expansion des Tregs de personnes VIH-1 positifs.

Nous décrivons ici une méthode simple et robuste pour développer avec succès Tregs isolés de personnes atteintes du VIH-1-infected in vitro. Flow-triés CD3 + CD4 +, CD25 + CD127 bas Treg ont été stimulées avec anti-CD3/anti-CD28 billes revêtues et cultivés en présence d'IL-2. Le élargi Tregs exprimé des niveaux élevés de FOXP3, CTLA4 et HELIOS rapport aux cellules T conventionnelles et ont été montré pour être très suppressive. Un accès plus facile à un grand nombre de Tregs permettra aux chercheurs d'adresse important des questions concernant leur rôle dans le VIH-1 immunopathogenèse. Nous pensons répondre à ces questions peut fournir des indications utiles pour le développement d'un vaccin efficace contre le VIH-1.

Introduction

Avec plus de 34 millions de personnes vivant avec le VIH / sida dans le monde et on estime que 2,5 millions de personnes nouvellement infectées en 2011, la nécessité d'un vaccin efficace contre le VIH pour enrayer l'épidémie mondiale du VIH reste primordiale. Cependant, en dépit de trois décennies d'intenses efforts de recherche, les vaccins contre le VIH-1 des essais d'efficacité à ce jour ont donné lieu à seulement une protection modeste 1-3 et les corrélats de l'immunité protectrice restent mal compris. L'élucidation de la nature de la réponse immunitaire nécessaire pour la protection est essentielle pour la conception stratégique d'un vaccin contre le VIH-1 et d'autres stratégies d'immunothérapie ciblant le VIH-1 infection efficace.

CD4 naturelle des cellules T régulatrices (Treg) sont essentielles pour le maintien de l'homéostasie des cellules immunitaires par le contrôle de l'activation immunitaire excessive, limitant ainsi les dommages aux tissus auto-immune. Toutefois, ils peuvent également supprimer les réponses immunitaires contre les agents pathogènes et d'empêcher leur dégagement. Cancer et Hepaétudes sur les vaccins titis B ont démontré que la diminution de l'activité des Tregs peut améliorer la réponse vaccinale et l'immunité de l'antigène spécifique contre les virus 4-7. Cependant, dans le contexte de l'infection par le VIH-1, l'impact exact de cellules T régulatrices demeure incomplètement compris. Tregs ont été montrés pour réduire la réplication du virus dans les cellules T activées 8 et éventuellement avoir un impact activation immunitaire 9. Ils ont également été présentés pour supprimer les réponses immunitaires-1-spécifiques du VIH, ce qui pourrait avoir des effets négatifs pour la progression de la maladie 10,11. Ainsi, avant de pouvoir moduler l'activité Treg afin d'améliorer l'efficacité d'un vaccin contre le VIH-1, il est important d'avoir une meilleure idée de leur fonction dans ce contexte de la maladie.

CD4 + humains cellules T régulatrices sont une population de cellules relativement rare, représentant environ 5% des cellules T CD4 + dans le sang périphérique, et leur nombre absolu de nouvelles de baisse avec CD4 associées au VIH + T déplétion des cellules 12 </ Sup>. Essais en cours pour évaluer la fonction Treg, tels que les tests de prolifération de lymphocytes T avec Treg co-culture, utilisent un nombre relativement élevé de cellules 12. Par conséquent, la fonction et la spécificité des cellules T régulatrices caractériser chez les personnes à un stade avancé du VIH-1 de la maladie a été difficile, en dépit de leur importance pour la pathogenèse du VIH.

L'isolement ex vivo et l'expansion des Tregs de VIH-1 des patients pourraient représenter une solution pour surmonter certaines de ces limitations. Nous décrivons ici un protocole robuste et facile à étendre Tregs fonctionnel dérivé d'individus infectés par le VIH-1 in vitro, nous expliquons comment phénotype et de les tester leur fonction suppressive en utilisant des analyses de cytométrie en flux. Nous croyons que ce protocole facilitera l'accès aux Tregs et les aider à comprendre leur rôle dans le VIH-1 progression de la maladie.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail Stemcells technologies 15062
PBS Sigma D8537
FBS Sigma F4135
Histopaque Sigma H8889
Anti-CD3-PECy7 BD Pharmingen 557851
Anti-CD4-FITC eBioscience 11-0049-42
Anti-CD25-APC eBioscience 17-0259-42
Anti-CD127-PE BD Pharmingen 557938
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh BD Falcon 352235
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30-001-Cl
Human Serum Gemini Bio-Products 100-512
Human T-activator CD3/CD28 Life Technologies 111.31D
IL-2 NIH Aids Research Reference Reagent Program 136
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Life technologies L34955
Anti-CD4-qdot-655 Life Technologies Q10007
Anti-CD25-PECy5 eBiosciences 15-0259-42
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set eBiosciences 00-5523-00
Anti-FOXP3-PE eBiosciences 12-4776-42
Anti-HELIOS-FITC Biolegend 137204
Anti-CTLA4-APC BD Pharmingen 555855
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Life Technologies C34557
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Life Technologies V12883
HEPES Mediatech 25-060-Cl
Treg Suppression inspector Miltenyi Biotec 130-092-909
Anti-CD4-APC BD Pharmingen 340443
Anti-CD8-AF700 BD Pharmingen 557945
RPMI 1640 Sigma R0883
Glutamine Mediatech 25-002-Cl
Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) Becton, Dickinson and Company (BD) 364606
FACSAria IIu Cell Sorter BD Biosciences -
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences -
FlowJo Tree Star v887

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References

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