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Immunology and Infection

Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

Published: May 30, 2013 doi: 10.3791/50244
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Ragon Institute of MGH, MIT, and Harvard, 2Division of Infectious Diseases, Massachusetts General Hospital

Abstract

CD4 + células T reguladoras (Tregs) são moduladores imunes potentes e têm uma função importante na homeostase imune humano. Esgotamento das Tregs levou a aumentos mensuráveis ​​nas respostas de células T antígeno-específicas em ambientes de vacina para o câncer e agentes infecciosos. Contudo, o seu papel no VIH-1 imuno-patogénese permanece controverso, visto que pode servir tanto para suprimir a activação imunitária ao HIV-1 e, portanto, associada deletério retardar a progressão da doença VIH-1, ou, alternativamente, suprimir a imunidade específica do HIV-1 e, assim, promover a vírus se espalhar. Compreender e função moduladora Treg no contexto do HIV-1 pode conduzir a novas estratégias potenciais para a imunoterapia ou vacinas contra o HIV. Contudo, questões importantes permanecem abertas sobre a sua função no contexto da infecção pelo HIV-1, que tem de ser cuidadosamente estudada.

Representando aproximadamente 5% das células T no sangue periférico CD4 + humanas, estudar a população Treg provou ser difícil, EScipalmente no VIH-1, em que os indivíduos infectados com HIV-1 de células T CD4 associada e com que a depleção de Treg ocorre. A caracterização de células T reguladoras, em indivíduos com doença avançada da doença do HIV-1 ou amostras de tecido, para o qual apenas pequenas amostras biológicas podem ser obtidos, é, portanto, extremamente desafiador. Propomos uma solução técnica para ultrapassar estas limitações, com isolamento e expansão de Tregs de indivíduos infectados pelo HIV-1 positivas.

Aqui, nós descrevemos um método fácil e robusto para desenvolver com sucesso Tregs isolado a partir de indivíduos infectados pelo HIV-1-infected in vitro. Fluxo-ordenadas CD3 + CD4 + CD25 + CD127 acessível Tregs foram estimuladas com anti-CD3/anti-CD28 grânulos revestidos e cultivadas na presença de IL-2. O expandida Tregs expressa níveis elevados de FOXP3, CTLA4 e Helios em comparação com as células T convencionais e mostraram ser altamente supressiva. Acesso mais fácil a um grande número de Tregs permitirá aos investigadores para lidar com important perguntas sobre o seu papel no HIV-1 imunopatogênese. Acreditamos responder a estas perguntas podem fornecer informações úteis para o desenvolvimento de uma vacina contra o HIV-1 eficaz.

Introduction

Com mais de 34 milhões de pessoas que vivem com HIV / AIDS em todo o mundo e um número estimado de 2,5 milhões de pessoas infectadas em 2011, a necessidade de uma vacina anti-HIV eficaz para conter a epidemia de HIV em todo o mundo continua a ser fundamental. No entanto, apesar de três décadas de esforços de pesquisa intensa, a HIV-1 vacina ensaios de eficácia até à data resultaram em apenas uma proteção modesta 1-3 e os correlatos de imunidade protetora continuam a ser mal compreendido. Elucidar a natureza da resposta imunitária necessária para a protecção é essencial para a criação de uma estratégica eficaz contra o HIV-1, vacina e outras estratégias imunoterapêuticas objectivo infecção HIV-1.

Naturais CD4 + células T reguladoras (Tregs) são essenciais para a manutenção da homeostase imune celular, controlando a activação imunitária excessiva, limitando, assim, danos no tecido imune-mediada. No entanto, eles também podem suprimir as respostas imunes contra os agentes patogénicos e evitar a sua recarga. Câncer e Hepaestudos de vacinas Callicebus B têm demonstrado que a diminuição da actividade de Tregs pode melhorar a resposta à vacina e antigénio específico da imunidade contra vírus 4-7. No entanto, no contexto da infecção pelo HIV-1, o impacto exato de células T reguladoras permanece incompletamente compreendida. Tregs foram mostrados para diminuir a replicação do vírus em células T ativadas 8 e possivelmente impactar ativação imune 9. Eles também foram mostrados para suprimir respostas imunes-1 HIV-específicas, que poderão ter resultados negativos para a progressão da doença 10,11. Assim, antes de ser capaz de modular a actividade Treg para aumentar a eficácia de uma vacina contra o HIV-1, que é ainda mais importante para ganhar conhecimento sobre a sua função no contexto da doença.

As células T reguladoras CD4 + humanas são uma população de células relativamente raras, o que representa cerca de 5% de células T CD4 + no sangue periférico, e os seus números absolutos decréscimo adicional de CD4 com o HIV-associados + depleção de células T 12 </ Sup>. Ensaios atuais para avaliar a função Treg, tais como ensaios de proliferação de células T com Treg co-cultura, use o número de células relativamente grandes 12. Portanto, a função e a especificidade das células T reguladoras caracterizar em indivíduos com doença avançada da doença do HIV-1 tem sido um desafio, apesar da sua importância para a patogénese do VIH.

O isolamento e a expansão ex vivo de Tregs de pacientes de HIV-1 pode representar uma solução para ultrapassar algumas destas limitações. Aqui nós descrevemos um protocolo fácil e robusta para expandir Tregs funcional derivado de HIV-1 indivíduos infectados in vitro, nós ainda explicar como fenótipo-los e testar sua função de supressão utilizando ensaios de citometria de fluxo. Acreditamos que este protocolo vai facilitar o acesso a Tregs e ajudar a compreender o seu papel no HIV-1 a progressão da doença.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail Stemcells technologies 15062
PBS Sigma D8537
FBS Sigma F4135
Histopaque Sigma H8889
Anti-CD3-PECy7 BD Pharmingen 557851
Anti-CD4-FITC eBioscience 11-0049-42
Anti-CD25-APC eBioscience 17-0259-42
Anti-CD127-PE BD Pharmingen 557938
Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh BD Falcon 352235
X-VIVO 15 Lonza 04-418Q
Penicillin/Streptomycin Mediatech 30-001-Cl
Human Serum Gemini Bio-Products 100-512
Human T-activator CD3/CD28 Life Technologies 111.31D
IL-2 NIH Aids Research Reference Reagent Program 136
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit Life technologies L34955
Anti-CD4-qdot-655 Life Technologies Q10007
Anti-CD25-PECy5 eBiosciences 15-0259-42
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set eBiosciences 00-5523-00
Anti-FOXP3-PE eBiosciences 12-4776-42
Anti-HELIOS-FITC Biolegend 137204
Anti-CTLA4-APC BD Pharmingen 555855
CellTrace Violet Cell Proliferation Kit Life Technologies C34557
Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Life Technologies V12883
HEPES Mediatech 25-060-Cl
Treg Suppression inspector Miltenyi Biotec 130-092-909
Anti-CD4-APC BD Pharmingen 340443
Anti-CD8-AF700 BD Pharmingen 557945
RPMI 1640 Sigma R0883
Glutamine Mediatech 25-002-Cl
Materials
BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) Becton, Dickinson and Company (BD) 364606
FACSAria IIu Cell Sorter BD Biosciences -
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences -
FlowJo Tree Star v887

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References

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