Abstract
CD4 + regulatoriska T-celler (Tregs) är potenta immunmodulatorer och fyller en viktig funktion i människans immunsystem homeostas. Utarmning av tregs har lett till mätbara ökningar av antigenspecifika T-cellsvar i vaccin-inställningar för cancer och infektiösa patogener. Dock är deras roll i HIV-1 immuno-patogenes kontroversiell, eftersom de kan antingen användas för att undertrycka skadliga HIV-1-associerade immun aktivering och därmed bromsa HIV-1 sjukdomsprogression eller alternativt undertrycka HIV-1-specifik immunitet och därmed främja virus spridas. Förståelse och modulerande Treg funktion i samband med HIV-1 skulle kunna leda till potentiella nya strategier för immunterapi eller HIV-vacciner. Men viktiga öppna frågor kvar på deras roll i samband med HIV-1-infektion, som måste studeras noggrant.
Utgjorde ungefär 5% av humana CD4 + T-celler i perifert blod, studera Treg befolkningen har visat sig vara svårt, especially i HIV-1 infekterade individer där HIV-1-associerade CD4 T-cell och med att Treg utarmning inträffar. Karakteriseringen av reglerande T-celler hos individer med framskriden HIV-en sjukdom eller vävnadsprover, för vilka endast mycket små biologiska prover kan erhållas, är därför ytterst utmanande. Vi föreslår en teknisk lösning för att övervinna dessa begränsningar med hjälp av isolering och expansion av Tregs från HIV-1-positiva individer.
Här beskriver vi en enkel och robust metod för att framgångsrikt expandera Tregs isolerade från HIV-1-infekterade individer in vitro. Flow-sorterade CD3 + CD4 + CD25 + CD127 låg tregs stimulerades med anti-CD3/anti-CD28 belagda pärlor och odlades i närvaro av IL-2. Den expanderade tregs uttryckte höga nivåer av foxp3, CTLA4 och HELIOS jämfört med konventionella T-celler och visade sig vara mycket suppressiv. Enklare tillgång till ett stort antal Tregs låter forskare adress som jagmportant frågor om sin roll i HIV-1 immunpatogenes. Vi tror att svara på dessa frågor kan ge användbara insikter för utveckling av ett effektivt HIV-1-vaccin.
Introduction
Med mer än 34 miljoner människor lever med hiv / aids i världen, och uppskattningsvis 2,5 miljoner människor som nyligen smittats under 2011, behovet av ett effektivt HIV-vaccin för att bromsa den globala HIV-epidemin är fortfarande av största vikt. Men trots tre decennier av intensiva forskningsinsatser, har HIV-1-vaccin effektivitetsstudierna hittills resulterat i endast blygsamma skydd 1-3 och korrelat av skyddande immunitet Oklara. Belysa karaktären av immunsvaret som behövs för skydd är nödvändigt för den strategiska utformningen av ett effektivt HIV-1-vaccin och andra immunterapeutiska strategier för hiv-1-infektion.
Naturliga CD4 + regulatoriska T-celler (Tregs) är kritiska för upprätthållande av immunceller homeostas genom att kontrollera överdriven immunaktivering och därmed begränsa immunmedierad vävnadsskada. Men de kan undertrycka även immunsvar mot patogener och förhindra deras avslut. Cancer och Hepatitis B-vaccin studier har visat att minska aktiviteten hos Tregs kan förbättra vaccin respons och antigen-specifik immunitet mot virus 4-7. Men i samband med HIV-1-infektion, är den exakta effekten av reglerande T-celler ofullständigt förstådd. Tregs visades minska virusreplikation i aktiverade T-celler 8 och eventuellt påverka immun aktivering 9. De har också visat sig hämma HIV-1-specifika immunsvar, vilket kan få negativa utfall för sjukdomsprogression 10,11. Således, innan de kan modulera Treg aktiviteten för att öka effekten av en HIV-1-vaccin, är det viktigt att få ökad insikt i deras funktion i denna sjukdom sammanhang.
Human CD4 + regulatoriska T-celler är en relativt begränsad cellpopulation, vilket motsvarar omkring 5% av CD4 +-T-celler i perifert blod, och deras absoluta tal ytterligare minskning med HIV-associerade CD4 + T-cell depletion 12 </ Sup>. Nuvarande analyser för att bedöma Treg funktion, såsom T-cellproliferationsanalyser med Treg samodling, använder relativt stora cellantal 12. Därför kännetecknande funktion och specificitet av reglerande T-celler hos personer med avancerad HIV-1 sjukdom har varit en utmaning, trots deras betydelse för HIV patogenes.
Den ex vivo isolering och expansion av Tregs från HIV-1-patienter skulle kunna utgöra en lösning för att övervinna några av dessa begränsningar. Här beskriver vi en enkel och robust protokoll för att expandera funktionell Tregs härlett från HIV-1 infekterade individer in vitro; vi ytterligare förklara hur fenotyp dem och testa deras undertryckande funktion med flödescytometriska analyser. Vi tror att detta protokoll kommer att underlätta tillgången till Tregs och hjälp att förstå sin roll i HIV-1 sjukdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | - | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | - | |
| FlowJo | Tree Star | v887 | |
References
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
