Abstract
CD4 + Regulatoriske T-celler (tregs) er potente immunmodulatorer og tjene en vigtig funktion i human immun homøostase. Udtømning af tregs har ført til målelige stigninger i antigen-specifikke T-celle responser i vaccine indstillinger for cancer og infektiøse patogener. Men deres rolle i HIV-1 immuno-patogenese er stadig kontroversielt, da de enten kunne tjene til at undertrykke skadelige HIV-1-associerede immun aktivering og dermed bremse HIV-1 sygdomsprogression eller alternativt undertrykke HIV-1-specifik immunitet og dermed fremme virus spredes. Forståelse og modulerende Treg funktion i forbindelse med HIV-1 kan føre til potentielle nye strategier for immunterapi eller HIV-vacciner. Men vigtige åbne spørgsmål forblive på deres rolle i forbindelse med HIV-1 infektion, som skal undersøges nøje.
Udgør omtrent 5% af humane CD4 + T-celler i det perifere blod, studere Treg befolkning har vist sig at være vanskeligt, especially i HIV-1-inficerede personer, hvor HIV-1-associerede CD4 T-celle og med det Treg udtynding opstår. Karakteriseringen af regulatoriske T-celler i individer med fremskreden HIV-1 sygdom eller vævsprøver, som kun meget små biologiske prøver kan opnås, er derfor yderst udfordrende. Vi foreslår en teknisk løsning til at overvinde disse begrænsninger ved hjælp isolation og udvidelse af tregs fra HIV-1-positive individer.
Her beskriver vi en let og robust metode til med succes at udvide tregs isoleret fra HIV-1-inficerede individer in vitro. Flow-sorteret CD3 + CD4 + CD25 + CD127 low tregs blev stimuleret med anti-CD3/anti-CD28 overtrukne perler og dyrket i nærværelse af IL-2. Det ekspanderede tregs udtrykte høje niveauer af foxp3, CTLA4 og HELIOS forhold til konventionelle T-celler og blev vist at være yderst undertrykkende. Lettere adgang til et stort antal tregs vil give forskere til at løse important spørgsmål vedrørende deres rolle i HIV-1 immunopatogenese. Vi tror at besvare disse spørgsmål kan give nyttig indsigt til udviklingen af en effektiv HIV-1-vaccine.
Introduction
Med mere end 34 millioner mennesker lever med hiv / aids på verdensplan, og en anslået 2,5 millioner mennesker smittet i 2011, er behovet for en effektiv HIV-vaccine for at bremse den globale hiv-epidemi er altoverskyggende. Men på trods af tre årtiers intense forskningsindsats, har HIV-1-vaccine effektundersøgelser til dato resulteret i kun en beskeden beskyttelse 1-3 og korrelater for beskyttende immunitet forbliver dårligt forstået. Belyse naturen af immunresponset nødvendig for beskyttelse er afgørende for strategisk udformning af en effektiv HIV-1-vaccine og andre immunterapeutiske strategier rettet mod HIV-1 infektion.
Naturlige CD4 + regulatoriske T-celler (tregs) er afgørende for opretholdelsen af immun cellehomeostase ved at kontrollere overdreven immun aktivering, hvilket begrænser immunmedieret vævsskade. Men de kan også undertrykke immunresponser mod patogener og forhindre deres clearance. Kræft og HEPAtitis B vaccine studier har vist, at reducere aktiviteten af tregs kan forbedre vaccine respons og antigenspecifik immunitet mod virus 4-7. Men i forbindelse med HIV-1 infektion forbliver nøjagtige virkning af regulatoriske T-celler ufuldstændigt forstået. Tregs blev vist at falde virusreplikation i aktiverede T-celler 8 og muligvis påvirke immun aktivering 9. De blev også vist sig at undertrykke HIV-1-specifikke immunreaktioner, hvilket kan få negative resultater for sygdomsprogression 10,11. Således, før at være i stand til at modulere Treg aktivitet at forbedre effektiviteten af en HIV-1-vaccine, er det vigtigt at opnå yderligere indsigt i deres funktion i denne sygdom sammenhæng.
Humane CD4 +-regulatoriske T-celler er en relativt begrænset cellepopulation, hvilket svarer til omkring 5% af CD4 + T-celler i det perifere blod, og deres absolutte tal yderligere fald med HIV-associerede CD4 + T-celle depletion 12 </ Sup>. Aktuelle analyser at vurdere Treg funktion, såsom T-celleproliferationsassays med Treg co-kultur, brug relativt store celle tal 12.. Derfor karakteriserer funktion og specificitet af regulatoriske T-celler hos personer med fremskreden HIV-1 sygdommen har været en udfordring, på trods af deres betydning for HIV patogenese.
Ex vivo isolation og udvidelse af tregs fra HIV-1 patienter kunne udgøre en løsning til at overvinde nogle af disse begrænsninger. Her beskriver vi en let og robust protokol for at udvide funktionel tregs afledt fra HIV-1-inficerede individer in vitro, vi yderligere forklare, hvordan man fænotype dem og teste deres undertrykkende funktion ved hjælp flowcytometriske assays. Vi tror, at dette protokol vil lette adgangen til tregs og hjælp til at forstå deres rolle i HIV-1 sygdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | - | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | - | |
| FlowJo | Tree Star | v887 | |
References
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
