Summary
Точные, короткие, сложные и дешевый способ описан, который оценивает длину теломер во многих тканях и видам использования Qrt-PCR. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.
Abstract
Теломеры повторяющихся последовательностей ДНК на конце концов хромосом, которые разнообразны по длине и в организме человека может достигать в длину 15 000 пар оснований. Теломер служит биозащитные механизм хромосомы истощение в каждом делении клетки. В определенной длины, теломеры становятся слишком короткими, чтобы репликация, процесс, который может привести к хромосомной нестабильности или гибель клеток. Длина теломер регулируется двумя противоположными механизмами: истощение и удлинения. Истощение происходит в каждом делении клетки. В противоположность этому, удлинение частично модулированный с помощью фермента теломеразы, который добавляет повторяющихся последовательностей на концах хромосом. Таким образом, теломераза, возможно обратное механизма старения и омолаживает жизнеспособности клеток. Они играют ключевую роль в поддержании жизни клетки и используются для оценки клеточного старения. В этой рукописи мы опишем точные, короткие, сложные и дешевый метод оценки длины теломеров в различных тканяхс и видов. Этот метод использует два основных элемента, тандемных повторов теломер последовательности и чувствительность QRT-PCR для обнаружения дифференциального числа копий испытуемых образцов. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.
Introduction
Теломеры повторяющиеся ДНК гексамер (TTAGGG) последовательности, найденные на концах хромосом. В каждой клетке репликации, эти концы хромосом укорачиваются. Если они становятся слишком короткими, хромосомы могут подвергаться теломер слияний конца, аберрантными рекомбинации и деградации. Таким образом достаточную длину теломер обслуживания играет важную роль в обеспечении стабильности хромосом и клеточной защиты 38. Длина теломер также имеет решающее значение для генов, найденных вблизи концов хромосом, так как репликация ДНК не может продолжаться до самого конца хромосом 1-2. Следовательно, предотвращение укорочения теломер клетка может улучшить стабильность.
Многочисленные исследования показали, что длина теломер коррелирует с долговечность организма и болезненное состояние, например, в 3-4 рак, диабет 5, а также сердечно-сосудистые заболевания 6,7. Кроме того, укороченные теломеры были связаны с чрезмерным напряжением илинездоровый образ жизни 8, возможно, путем поощрения преждевременного старения и гибели клеток 9. С другой стороны, некоторые исследования показали, что нет никакой существенной разницы между длиной теломер и долголетием и возрастных заболеваний связаны 39, 40, 41.
Один из врожденные механизмы клетки защиты от укорочение теломер является путем активации фермента своя теломеразы обратной транскриптазы (трет). Этот фермент и его субъединицы теломеразы РНК (TERC), некодирующих РНК, используйте теломер в качестве шаблона для добавления теломер повторений, чтобы концы хромосом 10. Хотя активность теломеразы отсутствует из нескольких типов клеток и других механизмов, которые участвуют в поддержании теломер длину, увеличение теломеразной активности коррелирует с увеличением длины теломеры. Активация теломеразы было установлено как один из механизмов, посредством которых клетки реагируют на повреждения и стресс и предотвратить преждевременное старение и смерть. Например, те большеlomeres были продемонстрированы в популяции евреев-ашкенази с исключительной продолжительностью жизни 11, мутации в TERC или трет было показано, что вклад в смертельной болезни 12 и эпигенетической регуляции теломеразы как было показано, влияют на возрастных заболеваний 13. С момента своего открытия, длина теломер была предложена в качестве биомаркеров для состояния здоровья в различных животных моделях, а также у людей, но эти ранние исследования были широко трудно повторить, потому что был использован способ утомительно, долго и дорого. В 2002 году и в дальнейшем настроены в 2009 году, Cawthon предложены и продемонстрировали новый, точный, быстрый и простой протокол на основе ПЦР для оценки длины теломеров и дальнейшего изучения его роли в различных аспектах клеточной биологии, старение и болезни 19.
Выбор правильного метод измерения теломер для исследования имеет важное значение. В настоящее время существуют различные методы, используемые для измерения длины теломеров, каждый со своим собственнымпреимущества и недостатки. Традиционно, длина теломер измеряется с помощью блот-анализе фрагментов терминал ограничения (ПВР), которая включает в себя:. переваривание ДНК ферментами рестрикции, что не режут теломер повторяется для получения TRFs, б. Саузерн-блот этих TRFs делается путем определения средней длины TRF помощью теломер зонд 14, 37. Хотя этот метод очень точно с малым коэффициентом вариации, является непосредственной мерой, и может быть выгодным для измерения длины распределения, TRF анализ является дорогостоящим, трудоемким и требует, по крайней мере, 3 мкг ДНК. Этот метод также нечувствительно к короткие теломеры и определения длины можно смешивать по субтеломерных ДНК, которые могут быть обнаружены с помощью зонда связи (TTAGGG) н подобные последовательности они содержат 15, 42.
Другой очень точный метод измерения длины теломер Одноместный теломер длина анализа удлинение (STELA), синглэлектронной молекулы на основе ПЦР методом, который требует лишь небольшого количества ДНК. В этом методе праймеры, чтобы признать G-богатые выступ в конце хромосом и связывается с уникальным субтеломерных последовательности на одной хромосомы, который усиливает теломер конкретной хромосоме. В результате усиления затем визуализируется Саузерн-блоттинга. Этот метод имеет то преимущество, что высокой точностью и способен обнаруживать короткие теломеры выброса 16. К сожалению, поскольку не все хромосомы имеют G-богатые концах и полезной субтеломерных последовательность, длина теломер можно измерить только на конкретных хромосом и эти измерения не могут представлять длина всех теломеры в клетке 15.
Другой метод, который практикуется является использование пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) зондов для обнаружения длины теломеры. Количественные Florescence в гибридизация (Q-FISH) позволяет визуализировать теломер во время метафазы, где йAining теломер с зондом PNA пропорционально их размер позволяет сравнение между конкретными теломеры хромосом. Хотя этот метод также может быть использован для клеток в интерфазе, вот длину теломер хромосом для разных не могут быть обнаружены, которая вводит ограничения при измерении длины теломеров в стареющих или редко делящиеся клетки 17. Поток рыбу вместо проточной цитометрии используется и в настоящее время является наиболее чувствительным методом для измерения длины теломеры клеток крови в клинических условиях, но требует высокой квалификации техников 18.
В настоящее время стандартного метода измерения средней длины теломер в нашей лаборатории использует точность, чувствительность и простота количественной ПЦР в реальном времени. Этот способ стал возможным для измерения длины теломер по разработке новых праймеров, которые избежать синтез димера праймера полученных продуктов, которые иначе были произведены в качествеtandard анализа из-за повторяющегося характера теломер. Для этого теста измерения длины теломер представлена T / S коэффициент, теломер числа копий повтора к одной копии гена числом. Так как существует прямая пропорциональная зависимость между длиной теломер и количество меченых праймеров теломер связывания с ДНК во время начальной стадии ПЦР, T / S соотношение прямо пропорционально длине теломеров. T / S коэффициент измеряется путем сравнения разности Ct, дробное число циклов, при которой образец накопленных цветение пересекает порог, который несколько стандартных отклонений выше базового цветения, между образцами с теломер праймеры и праймеры SCG 19. Этот метод был подвергнут критике за ее косвенного измерения длины теломер, которые могут привести к неточным измерениям, например, в случае хромосомных дублирования или вариации числа копий 15. Кроме того, сравнение исследований часто диfficult, но стандартные олигомеров и созданы для измерения абсолютного длину теломер 20. Этот метод способствовал повышена за счет Cawthon, используя монохромный анализа кПЦР мультиплекса. В этом анализе ПЦР проводили при более низких температурах в течение первых нескольких циклов, чтобы избежать праймер-димеров связывания и теломер и контрольного гена были проанализированы в той же пробирке ПЦР дальнейшей избежать ошибки. Полученный в результате измерения длины теломер коррелирует с длиной теломер измеряется Саузерн-блоттинга из ПВР и имели более высокую точность 15, 19, 36. На данный момент Qrt-PCR является единственным удобным способом для тестирования больших размеров образца и требует лишь небольшого количества ДНК осуществить. Важной частью этого метода заключается в комплексных мер по борьбе качества, так что, когда это сделано должным образом, этот метод может дать ценную информацию о сравнительных длину теломер. Кроме того, этот метод был адаптирован для использования вне лейкоцитов для измерениядлина теломер в различных тканях 42.
Кроме того, в целях более глубокого понимания биологии за длину теломер и взаимодействия между двумя противоположными эффектами (то есть укорочение теломер во время репликации и удлинения фермент теломераза), мы сопровождали длины теломер методом с дополнительным анализом, который измеряет активность теломеразы.
Для этой цели мы использовали протокол амплификации теломерных Повтор, Анализ in vitro. Вкратце, лизируют сохранена, ферментативно активной клетки синтезировали теломерных повторов на подложку с использованием олигонуклеотидных теломеразы, и продукты были амплифицированы с помощью ПЦР в присутствии SYBR Green. Затем результаты были проанализированы путем сравнения образцов и контрольных значений Ct порога. Так как теломераза теплочувствительную фермента, дополнительные термообработке управления запуске рядом друг с образцом 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Протокол теломер Длина 19
- Выделение ДНК
Большинство методов выделения ДНК может быть использован. Наша лаборатория предпочитает Qiagen DNeasy Kit (# 69506) для крови источников. В зависимости от источника ДНК, например, буккального или других источников, другой способ изоляции может быть использован.
- Грунтовка:
Все праймеры разбавляли до исходной концентрации 100pmoles/μl в ПЦР класса воде и хранили при -20 ° С до использования. Рабочие запасы праймеры приготовлены и хранят при 20 ° C в течение короткого периода времени (несколько месяцев). Стандартный праймеры использовали для теломеры и β-глобин, SCG, как описано в О'Каллаган соавт. 20 .
Последовательности праймеров:
Тело 1: 5'-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 '
Тело 2: 5'-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 '
SCG 1: 5'-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 '
SCG 2: 5'-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 '
Примечание: Праймеры разбавляют до рабочей концентрации 10pmoles/μl, перед добавлением в реакционную смесь.
- Серийные разведения геномной ДНК:
Серийные разведения геномной ДНК для Telo и односпальная копий гена (SCG) создаются для создания стандартного значения Ct кривой для анализа. Геномной ДНК использовали экстрагируют из лимфоцитов крови. Эти разведения создаются путем разбавления ДНК методом ПЦР класс H 2 0 до каждой концентрации на коэффициент 1,68, получая два набора серийных разведений с использованием тех же геномной ДНК. Исходным концентрации были оптимизированы на основе проб и ошибок и, возможно, должны быть скорректированы при использовании различных реактивы, инструменты, ДНК других видов, типов клеток, и SCG использовали.
Примечание: Серийный разбавления с использованием геномной ДНК делают, смешивая и терпеливо ждала по крайней мере 15 минут до одного часа Befoповторно принимает ДНК для следующего разведения. Каждое разведение требуется время для геномной ДНК для диссоциации. Для длительного хранения, аликвотой серийные разведения в ПЦР-полоски для хранения при температуре -80 ° C. Каждая полоска ПЦР размораживают и используют один раз, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания, которые могут повредить ДНК.
- Реакция установки для RT-PCR
Инструмент, используемый: Roche480 Свет Cycler
Реагент: Roche Свет циклере SYBR-зеленый
Развести тестовых образцов ДНК с конечной концентрацией 10 нг / мкл. Мы тестируем концентрации с использованием Nanodrop или кубита. Мы также разбавить ДНК из 10ng/μl до конечного 5ng/μl. Мы не испытываем концентрации снова.
Компоненты реакции:
| ООИ | 1x | SCG | 1x | |
| H 2 0 </ TD> | 6 мкл | H20 | 6 мкл | |
| Тело 1 | 0,2 мкл | SCG 1 | 0,6 мкл | |
| Тело 2 | 1,8 мкл | SCG 2 | 1,4 мкл | |
| Rxn смеси | 10 мкл | Rxn смеси | 10 мкл | |
| ДНК или серийного разведения | 2 мкл | ДНК или серийного разведения | 2 мкл |
Примечание: Master Mix производится без ДНК и с избытком 5% до 10%.
Оба Тэло и SCG совместно выполняемых на той же пластинке с помощью следующей программы. Для проверки на точность, по крайней мере, трех повторов каждого образца и контроля должны быть запущены. Вариации в праймеры могут повлиять на результаты. Наш протокол был оптимизирован для работы на следующий Roche480 Свет Cycler и наши праймеров.
Вitial денатурации
10 мин денатурации 95 ° C
Езда на велосипеде
95 ° C 10 сек удержание
60 ° C 5 секунд удержания
72 ° С 11 сек удержание и одно приобретение
Повторить 45 до 55 раз, сколько требуется
2. Количественное обнаружение теломеразы (QTD) Протокол (на основе QTD Kit союзными Biotech, Inc Кат. Номер MT3012)
Извлечение подготовка
- Гранул клетки или ткани.
- Мыть один раз с 1x PBS.
- Repellet и удалить 1x PBS. *
- Ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл 1 × буфера для лизиса на каждые 10 5 -10 6 клеток или 40-100 мг ткани.
- Инкубируют на льду в течение 30 мин.
- Спин вниз образца при 12000 х г в течение 30 мин при 4 ° С.
- Передача 160 мкл супернатанта в новую пробирку и определяют концентрацию белка.
- Алиготе и быстро заморозить оставшиеся экстракта на сухой лед / этанол, хранят при температуре -80 ° С.
* В т.его состояние, теломераза в замороженных клетках или тканях остается стабильным в течение по крайней мере года. Когда оттаивали в течение использования, ресуспендирования клеток непосредственно в один буфер для лизиса х.
2.1. Проверять контроли
Регулирование теплового инактивации: Для каждого образца термической обработки дополнительно экстракт контроль путем инкубации при 85 ° С в течение 10 мин до теломеразной активности анализа.
Стандартная кривая для шаблона управления TSR: выполнить количественный ПЦР в реальном времени использования разведения TSR, олигонуклеотида с аналогичной последовательности праймеров теломер входит в комплект для создания стандартной кривой.
- Подготовьте 1:05 серийных разведений концентрации TSR акций (0,5 amoles / мкл) с лизирующего буфера
- Выполните стандартное обнаружение теломеразы анализе с использованием 1 мкл каждого разбавления TSR, в том числе фондового концентрации. Эти разведения можно хранить при температуре 4 ° С в течение не менее 2 недель.
2.2. Анализ активности теломеразыQTD использованием ПЦР в реальном времени
- Для каждого образца, добавьте следующие строки в ПЦР-пробирку или тонкостенных ПЦР планшет (общий объем 25,0 мкл):
- 12,5 мкл 2 х QTD Премикс
- 1,0 мкл клеток или тканей экстракт
- 11,5 мкл ПЦР Квалифицированные воды
- Тщательно перемешать
- Программа Real-Time PCR Detection Systems по следующей программе:
- 25 ° С в течение 20 мин (теломеразы реакции)
- 95 ° С в течение 10 мин (ПЦР начальный этап активации)
35-40 циклов:
- 95 ° С в течение 30 секунд (денатурация)
- 60 ° C в течение 30 сек (отжиг)
- 72 ° C в течение 30 сек (расширение) - Поместите пробирки для ПЦР в термоциклер и запустить программу Велоспорт.
- Сбор порогового цикла или С Т значение после финиша циклов. Пороговый цикл является циклом, при котором статистически значимое увеличение ΔRn первом обнаружении.
2.3. Анализ данных
- GeneratEA стандартную кривую с использованием C T чтений и сравнить активность теломеразы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример длину теломер QRT-PCR анализа показан на рисунке 1. В левой верхней части панели, образцы помечены красным и зеленым представлять расположение предметов протестированы на 96-луночный планшет. В правом верхнем углу панели, кривой усиления демонстрируется. Каждый предмет проходят проверку двух анализов (теломер и единой копии гена), которая делается в трех экземплярах. Из-за различных ДНК числа копий производится в двух анализах выбранных лиц, число циклов до цветения обнаружения достигает экспоненциальной кривой различается между анализов. В более высоких труб числом копий (то есть теломер анализа), количество флуоресценции достигает экспоненциальной кривой после 27 циклов. Второй ряд линий представляет собой единственную копий гена (SCG), который имеет только одну копию в геноме, и, следовательно, имеет гораздо меньше копий, чем теломеры образцов и достигает своей экспоненциальной кривой только после 31 циклов. Коричневые линии представляет собой стандартноекривую, основанную на серийное разведение известные концентрации образца. При этом нижняя планка право представляет логарифм концентрации стандартных точках кривой (прямой демонстрирует оптимальное серийного разведения). Это линейной кривой используется для расчета концентрации тестируемых труб (нижняя левая панель). QRT-PCR результаты, первоначально в руках Cawthon по 19, и повторяется нами и другими, как было показано, коррелирует с результатами, полученными фрагмент терминал анализа ограничение длины. Один T / S соотношение блок (QRT-PCR циклов теломер проход в течение QRT-PCR циклов SCG перспективе) эквивалентно средней длины теломер из 4270 пар оснований в лейкоцитах 42. Разделив QRT-PCR циклов для теломер анализа на SCG анализа в нашем примере привело в соотношении 0,87, что эквивалентно в среднем 3715 пар оснований. Это измерение состоит из длины теломеров в одиночку и не включает субтеломерную регионах.
Qrt-PCR продемонстрировали здесь участвует очень мало пробоподготовки. В данном примере (рис. 1), качественные, так и количественные различия (в лице последовательного разведения и согласованности между трижды) наблюдались между двумя анализов. Результаты расчета по этой испытаний показывают промежуточные длины теломеров для 65-летней теме.
Примером активности теломеразы результаты анализа и возможной связи между активностью теломеразы и длина теломер демонстрирует рисунок 2. Наши предварительные результаты показывают, что больше длина теломер может быть связано с повышенной активностью теломеразы.
Рисунке 1. Рисунок 1 представляет собой типичный выход из водного этанолаRT-PCR анализ для Длина теломер. В верхнем левом углу показывает образцы расположены в 96-луночный планшет в трех экземплярах. Нижнем левом углу приведены расчетные концентрации и КТ значений для каждого образца, которые используются для расчета T / S значений. В верхнем правом представляет собой график кривой амплификации (количество циклов по сравнению с флуоресценции обнаружена CYBR зеленый), используемый для визуализации результатов. В правом нижнем углу, стандартная кривая для Log концентрации против КТ значение последовательного управления разбавление в виде графика. Прямая линия подтверждает, что серийное разведение была точно измерена и загружены. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Используя предварительные результаты Qrt-ПЦР-анализа на активность теломеразы и теломеразы длина <сильный рисунок> 2 показан прямой, значительно отношение (р = 0,008) между длиной теломер, измеренный коэффициент T / S, и активность теломеразы, измеренная величина Ct.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Длина теломер предоставляет уникальный клеточный маркер для изучения напряженно и старения клеток и предлагает взглянуть на механизмы старения. Так как его роль в старении впервые было предложено, множество исследований было сделано, касающиеся длины теломеров с возрастом, долголетия, возрастных заболеваний, рака, и стресс. На протяжении десятилетий, золотой стандарт измерения теломер была длиной терминала анализа фрагментов ограничение использования Саузерн-гибридизации. Однако в последнее время доступным, быстрым и легким для выполнения методом Cawthon развивалась. С использованием количественных ПЦР в реальном времени, Cawthon предложили полезной альтернативой для измерения длины теломеров, что делает исследования в больших выборках возможно.
Использование Qrt-PCR, многие исследования были проведены для изучения взаимосвязи между длиной теломер и разнообразные результаты, особенно возрастных заболеваний. В частности, этот метод позволил исследователям выполнить большой эпидемиологической студентовумирает на популяции, которые демонстрируют или отрицать корреляцию между длиной теломер и различных заболеваний. Чтобы назвать несколько, ишемическая болезнь сердца 7, болезнь Альцгеймера 22, osteocarcoma у женщин 23, рака легких среди курильщиков 24, семейными формами рака щитовидной железы 25, диабет 5, АД 26, старение 27 и слабоумие 28 были соотнесены с более короткой длиной теломер , в то время как возрастная макулярная дегенерация 7, колоректальный рак 43, и смерти от инфекционных заболеваний, рака, сердечных или цереброваскулярных заболеваний 44, как было показано, не имеют никакого существенного отношения с длиной теломер. Кроме того, некоторые напряжений было показано, совпадают с короткой длиной теломер, например, увеличенное количество маркеров воспаления, TNF-α и IL-6, были сопоставлены с более короткой длины теломер в лейкоцитах 29. Кроме того, стрессовые LiFestyles из-за времени графики работы, сменная работа, или характер работы, в частности временное положение для хронически больного ребенка, были связаны с различиями в длину теломер. Это говорит о том, что стресс может привести к преждевременному старению путем укорочения теломер без достаточного восстановления 30, 31. В недавнем исследовании, уменьшение числа социальных отношений также связан с более короткие теломеры, 32. Предупреждение укорочение теломер длиной Также было показано, коррелирует с здорового образа жизни, например, ежедневный прием поливитаминов и не курили 24, 33. Кроме того, эти исследования показали возможное клиническое применение для измерения теломер, например, в качестве неинвазивного скрининг-тест для возможного развития цирроза печени 34. В других случаях, где подобные исследования не показали никакой существенной корреляции (или скромный корреляция) между заболеванием и длину теломер, исследователями было предложено улУды другие механизмы роман для сотовых спад и болезненное состояние 7.
Эти исследования имеют силы в цифрах и показал полезность измерения длины теломеров как один из первых шагов в расшифровке процесс старения. QRT-PCR метод Cawthon было полезно для этой цели, поскольку он может сравнить большое количество людей, требует минимального ДНК, и может дать надежных доказательств к взаимосвязи между длиной теломер и клеточных здоровья. Эти исследования помогают руководстве будущей старения исследования, направленные на определенные гены, тканей и клеточных процессов.
Безусловно, после того, как значительная разница в длину теломер Отмечается, объяснение запрашивается. Для ответов на эти вопросы, исследования теломеразы, фермента, участвующего в поддержании теломер и его регуляции, были созданы. ПЦР на основе протоколов активности теломеразы были предложены, что дает дополнительную информацию к: а. определении продолжениеributions деградации теломеры, и б. провала успешного поддержания теломер длину теломеразы, обеспечивая тем самым еще одну главу в историю по проблемам старения в целом, в частности старение клетки.
Хотя Qrt-PCR обнаруживает средняя длина теломер, а не на индивидуальной основе хромосомы, этот метод является мощным инструментом для доказательства на то, как клетки реагируют на старение и стресс и предоставляет преамбулу к рассказу о том, как мы стареем. Интересно, что эта информация уже привела к измерения длины теломер в клинике для оценки биологического возраста и в дальнейшем наше понимание процесса старения и неизбежно приведет к предотвращению или задержке и скрининга старения и возрастных заболеваний.
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу |
| Количественное определение теломеразы Союзные Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, готовой к использованию горячей смеси для начала реакции SYBR Green I на основе ПЦР в реальном времени использования LightCycler 480 инструментов | Roche Diagnostics | 4707516 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quantitative Telomerase Detection | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument | Roche Diagnostics | 4707516 |
References
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W., Luo, S., Hong, W. K., Spitz, M. R. Telomere Dysfunction: a Potential Cancer Predisposition Factor. J. Natl. Cancer Institute. 95, 1211-1218 (2003).
- Blackburn, E. H. Walking the Walk from Genes through Telomere Maintenance to Cancer Risk. Cancer Prevention. 4, 473 (2011).
- Monickaraj, F., Aravind, S., Gokulakrishnan, K., Sathishkumar, C., Prabu, P., Prabu, D., Mohan, V., Balasubramanyam, M. Accelerated Aging as Evidenced by Increased Telomere Shortening and Mitochondrial DNA Depletion in Patients with Type 2 Diabetes. Molecular and Cellular Biochemistry. 365 (1-2), 343-350 (2012).
- Bekaert, S., De Meyer, T., Rietzschel, E. R., De Buyzere, M. L., De Bacquer, D., Langlois, M., Van Oostveldt, P. Telomere Length and Cardiovascular Risk Factors in a Middle-Aged Population Free of Overt Cardiovascular Disease. Aging Cell. 6 (5), 639-647 (2007).
- Weischer, M., Bojesen, S. E., Cawthon, R. M., Freiberg, J. J., Tybjaerg-Hansen, A., Nordestgaard, B. G. Short Telomere Length, Myocardial Infarction, Ischemic Heart Disease, and Early Death. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 822-829 (2011).
- Sun, Q., Shi, L., Prescott, J., Chiuve, S. E., Hu, F. B., et al. Healthy Lifestyle and Leukocyte Telomere Length in U.S. Women. PLoS ONE. 7 (5), e38374 (2012).
- Pont, A. R., Sadri, N., Hsiao, S. J., Smith, S., Schneider, R. J. mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription. Molecular Cell. , In Press (2012).
- Cohen, S. B., Graham, M. E., Lovrecz, G. O., Bache, N., Robinson, P. J., Reddel, R. R. Protein Composition of Catalytically Active Human Telomerase from Immortal Cells. Science. 315 (5820), 1850-1853 (2007).
- Atzmon, G., Cho, M., Cawthon, R. M., Budagov, T., Katz, M., Yang, X., Suh, Y., et al. Colloquium Paper: Genetic variation in human telomerase is associated with telomere length in Ashkenazi centenarians. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 1710-1717 (2010).
- Njajou, O. T., Blackburn, E. H., Pawlikowska, L., Mangino, M., Damcott, C. M., et al. A Common Variant in the Telomerase RNA Component Is Associated with Short Telomere Length. PLoS ONE. 5 (9), e13048 (2010).
- Guan, W. P., Maeda, T., Makino, N. The Subtelomere of Short Telomeres is Hypermethylated in Alzheimer's Disease. Aging Disease. 3 (2), 164-170 (2012).
- Kimura, M., Stone, R. C., Hunt, S. C., Skurnick, J., Lu, X., Cao, X., Aviv, A., et al. Measurement of Telomere Length by the Southern Blot Analysis of Terminal Restriction Fragment Lengths. Nature Protocols. 5 (9), 1596-1607 (2010).
- Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. Telomere length measurement-Caveats and a critical assessment of the available technologies and tools. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 730 (1-2), 59-67 (2012).
- Baird, D. M., Rowson, J., Wynford-Thomas, D., Kipling, D. Extensive allelic variation and ultrashort telomeres in senescent human cells. Nature Genetics. 33 (2), 203-207 (2003).
- O'Sullivan, J. N., Finley, J. C., Risques, R. A., Shen, W. T., Gollahon, K. A., Rabinovitch, P. S. Quantitative Fluorescence in situ Hybridization (QFISH) of Telomere Lengths in Tissue and Cells. Current Protocols in Cytometry. Chapter 12, Unit 12.6 (2005).
- Baerlocher, G. M., Mak, J., Tien, T., Lansdorp, P. M. Telomere Length Measurement by Florescence in situ hybridization and Flow Cytometry: Tips and Pitfalls. Cytometry. 47 (2), 89-99 (2002).
- Cawthon, R. M. Telomere Measurement by Quantitative PCR. Nucleic Acids Research. 30 (10), e47 (2002).
- O'Callaghan, N. J., Fenech, M. A Quantitative PCR Method for Measuring Absolute Telomere Length. Biological Procedures Online. 13 (1), 3 (2011).
- Piatyszek, M. A., Kim, N. W., Weinrich, S. L., Hiyama, K., Hiyama, E., Wright, W. E., Shay, J. W. Detection of Telomerase Activity in Human Cells and Tumors by a Telomeric Repeat amplification protocol (TRAP). Methods in Cell Science. 17 (1), 1-15 (1995).
- Hochstrasser, T., Marksteiner, J., Humpel, C. Telomere Length is Age-Dependent and Reduced in Monocytes of Alzheimer Patients. Experimental Gerontology. 47 (2), 160-163 (2012).
- Mirabello, L., Richards, eg, Duong, L. M., Yu, K., Wang, Z., Cawthon, R., Berndt, S. I., Burdett, L., Chowdhury, S., Teshome, K., Douglass, C., Savage, S. A. Telomere Length and Variation in Telomere Biology Genes in Individuals with Osteosarcoma. International Journal of Molecular Epidemiology and Genetics. 2 (1), (2011).
- Shen, M., Cawthon, R., Rothman, N., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Hosgood, H. D. 3rd, Hu, W., Lim, U., Albanes, D., Lan, Q. A Prospective Study of Telomere Length Measured by Monochrome Multiplex Quantitative PCR and Risk of Lung Cancer. Lung Cancer. 73 (2), 133-137 (2011).
- Capezzone, M., Cantara, S., Marchisotta, S., Filetti, S., De Santi, M. M., Rossi, B., Pacini, F., et al. Short Telomeres, Telomerase Reverse Transcriptase Gene Amplification, and Increased Telomerase Activity in the Blood of Familial Papillary Thyroid Cancer Patients. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93 (10), 3950-3957 (2008).
- Insel, K. C., Merkle, C. J., Hsiao, C. P., Vidrine, A. N., Montgomery, D. W. Biomarkers for Cognitive Aging Part I: Telomere Length, Blood Pressure and Cognition Among Individuals with Hypertension. Biological Research for Nursing. 14 (2), 124-132 (2012).
- Aviv, A. Telomeres and Human Somatic Fitness. Journals of Gerontology Series A. 61 (8), 871-873 (2006).
- Yaffe, K., Lindquist, K., Kluse, M., Cawthon, R., Harris, T., Hsueh, W. C., Simonsick, E. M., Kuller, L., Li, R., Ayonayon, H. N., Rubin, S. M., Cummings, S. R. Telomere Length and Cognitive Function in Community-Dwelling Elders: Findings from the Health ABC Study. Neurobiological Aging. 32 (11), 1055-1060 (2011).
- O'Donovan, A., Pantell, M. S., Puterman, E., Dhabhar, F. S., Blackburn, E. H., et al. Cumulative Inflammatory Load Is Associated with Short Leukocyte Telomere Length in the Health, Aging and Body Composition Study. PLoS ONE. 6 (5), e19687 (2011).
- Parks, C. G., DeRoo, L. A., Miller, D. B., McCanlies, E. C., Cawthon, R. M., Sandler, D. P. Employment and Work Schedule are related to Telomere Length in Women. Occupational Environmental Medicine. 68 (8), 582-589 (2011).
- Epel, E. S., Blackburn, E. H., Lin, J., Dhabhar, F. S., Adler, N. E., Morrow, J. D., Cawthon, R. Accelerated Telomere Shortening in Response to Life Stress. PNAS. 101 (49), 17312-17315 (2004).
- Uchino, B. N., Cawthon, R. M., Smith, T. W., Light, K. C., McKenzie, J., Carlisle, M., Gunn, H., Birmingham, W., Bowen, K. Social Relationships and Health: Is Feeling Positive, Negative, or Both (Ambivalent) about your Social Ties Related to Telomeres? Health Psychology. , In Press (2012).
- Xu, Q., Parks, C. G., DeRoo, L. A., Cawthon, R. M., Sandler, D. P., Chen, H. Multivitamin Use and Telomere Length in Women. The American Journal of Clinical Nutrition. 89 (6), 1857-1863 (2009).
- Wan, S., Hann, H. W., Myers, R. E., Fu, X., Hann, R. S., Kim, S. H., Tang, H., Xing, J., Yang, H. Telomere Length in Circulating Serum DNA as a Novel Non-Invasive Biomarker for Cirrhosis: a Nested Case-Control Analysis. Liver International. , In Press (2012).
- Immonen, I., Seitsonen, S., Saionmaa, O., Fyhrquist, F. Leucocyte Telomere Length in Age-Related Macular Degeneration. Acta Ophthalmologica. , In Press (2012).
- Lan, Q., Cawthon, R., Shen, W., Weinstein, S. J., Virtamo, J., Lim, U., Hosgood, H. S. 3rd, Albanes, D., Rothman, N. A prospective study of telomere length measured by monochrome multiplex quantitative PCR risk of non-Hodgkin lymphoma. Clinical Cancer Research. 15, 7429-7433 (2009).
- Balasbramanyam, M., Adaikalakoteswari, A., Sameermahmood, Z., Mohan, V. Biomarkers of oxidative stress: methods and measures of oxidative DNA damage (COMET assay) and telomere shortening. Methods Molecular Biology. 610 (3), 245-261 (2010).
- Maser, R. S., DePinho, R. A. Telomeres and the DNA damage response: why the fox is guarding the henhouse. DNA Repair (Amsterdam). 3 (8-9), 979-998 (2004).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association between telomere length, specific causes of death, and years of healthy life in health, aging, and body composition, a population-based cohort study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A. 8 (8), 860-864 (2009).
- Mather, K. A., Jorm, A. F., Milburn, P. J., Tan, X., Easteal, S., Christensen, H. No Associations Between Telomere Length and Age-Sensitive Indicators of Physical Function in Mid and Later Life. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65A (8), 792-799 (2010).
- Riethman, H., Ambrosini, A., Castaneda, C., Finklestein, J., Hu, X. -L., Mununuri, U., Paul, S., Wei, J. Mapping and Initial Analysis of Human Subtelomeric Sequence Assemblies. Genome Research. 14, 18-28 (2003).
- Terry, D. F., Nolan, V. G., Anderson, S. L., Perls, T. T., Cawthon, R. Association of Longer Telomeres with Better Health in Centenarians. J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 63 (8), 809-812 (2008).
- Zee, R., Castonguay, A. J., Barton, N. S., Buring, J. E. Mean Telomere Length and Risk of Incident Colorectal Carcinoma. A Prospective, Nested Case-Control Approach. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention. 18 (8), 2280-2282 (2009).
- Njajou, O. T., Hsueh, W. -C., Blackburn, E. H., Newman, A. B., Wu, S. -H., Li, R., Simonsick, E. M., Harris, T. M., Cummings, S. R., Cawthon, R. M. Association Between Telomere Length, Specific Causes of Death, and Years of Healthy Life in Health, Aging, and Body Composition, a Population-Based Cohort Study. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 64A (8), 860-864 (2009).
