Summary
全身ナノ粒子エアロゾル吸入暴露施設は、ナノサイズの二酸化チタン（酸化チタンのために構築した
Abstract
吸入すると、設計エアロゾル化ナノ材料（ENM）を扱う個人のための最も可能性の高い暴露経路である。適切にナノ粒子の吸入毒性試験を実行するには、チャンバハウジングにおけるエアロゾルは、実験動物が持っている必要があります：1）安定した濃度は全体の暴露期間のために必要なレベルに維持、2）均質な汚染物質の構成、3）安定した<200 nmおよび幾何標準偏差はG <2.5 5σ幾何平均径のサイズ分布。簡単に凝集粒子ので、ナノ粒子を含有するエアロゾルの発生が非常に困難である。これは非常に強力な粒子間力と数十または分割することが困難なサイズ6ミクロン、数百人の中で大規模なフラクタル構造の形成によるところが大きい。ネブライザー、流動床、ベンチュリアスピレーターとライトダストフィードを含むいくつかの一般的なエアロゾル発生器は、我々再テストしたが、いずれも、すべての基準5を満たしているナノ粒子エアロゾルを生成することができませんでした。
全身ナノ粒子エアロゾル吸入暴露システムは、製造され検証され、ナノTiO 2の吸入毒性試験に利用されました。重要なコンポーネント：1）小説ナノTiO 2のエアロゾル発生、2）0.5メートル3全身吸入暴露室、3）監視および制御システム。バルク乾燥ナノTiO 2の粉末（21nmで3.8グラム/ cm 3の嵩密度の一次径）から生成されたナノTiO 2のエアロゾルは90 LPM（10.8換気/時間）の流量で露光チャンバ内に配信された。粒度分布と質量濃度プロファイルを走査型モビリティ粒サイザー（SMPS）、電気低圧インパクタ（ELPI）を用いて連続的に測定した。エアロゾル質量濃度（C）は （ ミリグラム/ m 3）で重量測定法で確認した。質量（M）集めた粒子はM 前とM ポストサンプリング（mg）を前後のフィルタの質量であるM =（M ポスト M 前 ）として決定した。質量濃度は次のように計算されたC = M Qは流量（3メートル/分 ） をサンプリングしている/（Q * t）は、tはサンプリング時間（ 分 ）である。チャンバ圧力、温度、相対湿度（RH）、O 2及びCO 2濃度を連続的に監視し、制御した。 Nucleporeフィルター上に集め、ナノTiO 2のエアロゾルは、走査型電子顕微鏡（SEM）およびエネルギー分散型X線（EDX）分析で分析した。
1）安定した質量濃度を、汚染物質のフリー2）均一な組成物、3）カウント中位空力安定した粒度分布を要約すると、我々は我々の曝露チャンバーに生成され、配信ナノ粒子エアロゾルが持っていることを報告エアロゾル生成時に157ナノメートルの直径namic。このシステムは、確実に、繰り返し、労働環境や国内ENMエアロゾル曝露を模擬試験雰囲気を作成します。
Protocol
全身ナノ粒子吸入暴露ステップごとの操作手順は、次のように記載されている。
注 ：1）手順1と3はドラフト内で行うべきである、2）演算子は（呼吸器、ゴーグル、ゴム手袋）適切な個人保護具を着用しなければならない。
1。エアコンの TiO 2ナノ粒子乾燥粉末
- 不透明な容器にナノTiO 2の粉末を置きます。
- 容器の蓋を開いたままにします。
- コンディショニングのために少なくとも24時間乾燥し、デシケーター中で容器を置きます。
2。データ収集と制御システム、SMPSとELPIとすべてトランスデューサウォーミングアップ
- 空気の監視やデータ収集システムとエアロゾルのモニタリングSMPS（TSI社、ショアビュー、ミネソタ州）とELPI（Dekati、タンペレ、フィンランド）のための電源スイッチをオンにして、少なくとも1時間のシステムをウォームアップ。
- 電源を入れるすべてのトランスデューサ内のスイッチは、少なくとも1時間のためにそれらをウォームアップする。
3。エアロゾル発生器への TiO 2ナノ粒子の乾燥粉末のロード
- エアロゾル発生器のシリンダーキャップを開き、エアゾール発生器のフィルタを交換してください。注：Oneエーロゾル発生器が一つの気筒を有する。使用するエアロゾル発生器の数は、露光チャンバ内の粒子の所望の質量濃度に依存する。
- 〜4グラムのナノTiO 2の粉末を秤量し、各気筒でそれらをロードします。
- シリンダーキャップを交換してください。
- すべてのエリアでは、TiO 2の汚染の疑いが拭い濡らさなければならない。
4。吸入暴露チャンバーにエアロゾル発生器を接続する
- 吸入暴露室（TSEシステムズ社、バートホンブルク、ドイツ）の入口であるサイクロンセパレータマニホールドを経由してエアロゾル発生器のすべてのコンセントに接続してください。
- 圧縮空気配管に接続しエアロゾル発生器におけるベンチュリ分散機。
5。吸入暴露室に大気モニタリングやエアロゾルサンプリングインレットを接続
- 温度と相対湿度（RH）、圧力、吸入暴露室で大気モニタリングポートをテストし東証システムから供給されるO 2＆CO 2センサーを接続します。
- 吸入暴露チャンバーでエアロゾルのサンプリングポートの1つにエアロゾル希釈器の入口を接続し、ELPIの入口にその出口を接続します。
- 吸入暴露チャンバーでエアロゾルのサンプリングポートのいずれかにSMPSを接続します。
- 曝露チャンバーにエアロゾルのサンプリングポートのいずれかに粒子濃度モニタ（東証システム）の入口に接続します。
- PTFEメンブレンフィルター（P / N 66149、ポール·コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）を計量し、ステンレス製フィルターホルダー（インToxの製品、モリアーティNM）にフィルタをロードします。
- の入口を接続吸入暴露チャンバーでエアロゾルのサンプリングポートのいずれかにフィルタ予め秤量、サンプリングポンプにその出口を接続してください。ステンレス製フィルターホルダー
6。データ収集システムをアクティブに
- アクティブELPIデータ収集ソフト、ELPIVIは 、設定パラメータをチェックして、約5分間水洗ポンプをオンにしてから、ELPIをゼロ。録音前暴露濃度。
- SMPSデータ集録ソフトウェアをアクティブにします。録音前暴露濃度。
- O 2、CO 2、空気流量、温度およびRHチャンバ圧力、温度およびRHの監視および制御するためのソフトウェア、DACO（TSEシステム）を活性化する。
7。吸入暴露チャンバー内に実験動物のロード
- 実験動物を計量。
- 動物が暴露した後、同じケージ内に戻すことができるように、実験動物とケージをマークする旧姓なded。
- 吸入暴露室の扉を開き、有線ケージに実験動物をロードします。
- 水は、動物のために提供されてもよい。
- 吸入暴露室のドアを閉じ、固定します。
- 頻繁に苦痛の兆候曝露室観察窓から動物を観察する。動物は、リラックスして正常に動作しなければならない。急速に/呼吸こじつけ場合露出を停止、外観異常、姿勢異常や不動が観察される。動物を外し、元のケージに戻し、出席獣医師に連絡し、/または適切な動物実験を開始し、委員会の手順を使用します。
注：ステップ8.7、8.8と8.17を実行する際にオペレータは個人用保護具を着用しなければならない。
8。ナノ粒子エアロゾルに小動物を公開する
- 吸入暴露室の排気真空ポンプの電源をオンにします。
- にデータ収集ソフトウェア、DACOを実行して、a）b）は、露光チャンバ内の圧力を制御し、及びc）は圧力、温度、RH、O、露光環境のデータを収集し、露光室に濾過乾燥空気を供給する2、CO 2。
- チャンバ圧力でわずかに負圧を（セットポイント= -0.2ミリバール）を確立。
- エアロゾル発生器の電源をオンにします。
- 連続的に吸入暴露チャンバ内の粒子サイズおよび相対質量濃度を監視するためにELPIとSMPSデータ収集ソフトウェアを実行する。
- エアロゾル濃度が安定しているとき、ELPIモニタ上の濃度プロファイルは、（通常：エアゾール発生器が動作中になった後、これは20分かかります）プラトーに達した、つまり （例えば、1時間）サンプリング時間を設定し、エアロゾルのサンプリングをオンにするフィルタを使用してナノ粒子の代表的なサンプルを収集するためにポンプ。
- サンプリング時間に達すると、フィルタを削除し、saのを差し込む暴露室から逃げるの試験材料を防ぐためにゴム製のプラグでポートをmpling。
- フィルタを秤量し、上記のように露光チャンバ内の平均質量濃度を算出する。
- 平均濃度が目標濃度オフになっている場合は、手動でターゲット濃度が達成されていることを確認するために発電機で空気の流れを調整します。
- 時刻t =露光時間D = C×垂直メートル XTX F rは 、試験材料のD =用量、C =平均質量濃度、V mは分時拍出量、などの動物の肺における粒子堆積を計算し、F はr =画分の材料それは、堆積又は吸収される。
- クリーン、プレ加重フィルタをフィルターホルダーにフィルターを交換し、ステップ8.6と8.8を繰り返します。
- 動物の肺の曝露室と標的粒子沈着の本当の質量濃度に基づき、残りのEXPを見積もる、tは残るとしてosure時間=（D ターゲット -D）/（C X V M X F R）tは残る 、=暴露期間まま、D ターゲット =ターゲット用量、C =試験材料の質量濃度、V Mを意味する =分容積、F R材料=分数堆積または吸収される。
- 残るトンに達したときにエアロゾル発生器の電源をオフにします。
- モニターに示されている粒子濃度がチャンバー内の暴露前粒子濃度に近くなるまで、曝露室から動物を削除する前に、濾過された空気を吸入暴露室をフラッシュします。
- チャンバー排気真空ポンプの電源をオフにします。
- データ収集ソフト、DACOを停止します。
- 暴露後、正常な呼吸と動作を確認するために動物を観察し、文書のない他の研究合併症EXそのイスト。鼻汁、呼吸困難または他の動物愛護合併症が認められた場合には、主治医の獣医師および/に連絡するか、適切な動物実験を開始し、委員会の手順を使用します。
- ELPIとSMPSデータ収集ソフトウェアを停止します。
9。テストレポートの作成
9.1試験条件は、
- このテストで使用エーロゾル発生システム及びその動作パラメータの説明。
- 露光中に使用される設計、種類、寸法およびその動作パラメータを含む露光装置の説明。
- 測定温度、湿度、粒子サイズ、および実際の濃度ための機器。
- 排気と使用した場合の試験室に動物を収容する方法の治療。
9.2露出の雰囲気のデータが含まれる
- 吸入装置のエアフロー率。
- の温度と湿度空気。
- 動物ケージの近くにあるエアロゾルのサンプリングゾーンの実際（分析または重量）の濃度。
- 粒度分布、および計算されたカウントメディアン空気力学的直径および幾何標準偏差。
- なぜ希望チャンバー濃度および/または粒子サイズなどの説明は（該当する場合）を達成し、そして努力がガイドラインのこれらの側面に準拠するために取ることができませんでした。
その他9.3
- 吸入設備を含む部屋の中でわずかに負圧が吸入暴露室から逃げるの試験材料を防ぐために維持されるべきである。
- 動物性廃棄物の影響を排除するために、毎日暴露室を清掃してください。
- ELPI、SMPSや他の楽器を洗浄し、ユーザマニュアルに基づいて校正する必要があります。
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Representative Results
吸入暴露試験では、通常、試験材料8,9の定義された濃度に実験動物を露出させ、既知および一定テスト環境で実験動物を維持することが含まれます。全身吸入ナノ粒子露光装置は、 図1に示されている。チャンバを通る空気の連続流90 LPMがあった場合に全身チャンバは、動的フローに基づいて運転した。この空気の流れは、急性吸入暴露7のために米国環境保護庁が必要とする空気交換の最小数（10.0）を超える10.8空気の変化/時間を提供した。合体フィルタ、高効率合体フィルターと活性炭フィルター（アトラスコプコ、スウェーデン）を含む3段エアフィルターシステムは、水、ほこりや油蒸気の除去と（炭化水素）悪臭のために入口空気で使用されていた。プレペーパーフィルター、チャコールフィルターとHEPA Fiなどの3段エアフィルターシステムLTERは、排気ガス流量コントローラを保護するために使用された。ウェストバージニア大学の要求ごとに、東証システムによって設計4段エアフィルターシステムは、排気真空ポンプの出口で使用されていました。露光チャンバは、ステンレス鋼線から成り、TSEシステムによって供給されたハウジング8動物の檻の容量を有する。露光チャンバ内の雰囲気中に浸漬実験動物の最大数は16匹のラット、またはマウス64である。実験動物の総量は急性吸入暴露7、米国環境保護庁によって必要とされる試験雰囲気の安定性を確保するために、チャンバの体積の5％を超えない。
ナノ粒子のエアロゾル発生器を設計し、3,10を試験した。 図2に示すように、それは、バッフル（4）、振動ベンチュリ分散機（6）と、サイクロン分離器を有する振動流動床シリンダ（5）から構成される。 cylindに取り付ける振動（10）ER（5）機械的振動を生成します。フィルタ（2）は、シリンダー内のステンレス鋼の空気分配器（1）の上に座っている。フィルター上のエアロゾル載っなるようにナノ粒子乾燥粉末（3）。ベンチュリ分散機（6）は、シリンダの上部に出口ポートに接続されている。ベンチュリ分散機は、配管内のくびれを持っています。ベンチュリ分散にくびれを横切って発泡高速の空気ジェットは、活性炭とHEPAを介して両方の近位端および遠位端部には、空気供給ポートからシリンダに清潔で乾燥した空気を吸引シリンダ内に真空を作成することができフィルタ（9）。ベンチュリ分散出口は、サイクロン分離器の入口（7）に接続されている。サイクロン分離器の出口は、露光チャンバの入口に接続されている。このエーロゾル発生システムにおいては、振動せん断流れ、複数埋伏を最小化するために使用されるより大きな凝集体、大きな凝集体を除去するために使用される複数の粒子分離器、および複数の希釈液を分散させるために利用される粒子の再凝集。粒子サイズおよび質量濃度は、手動バルブ（8）、（11）を介して、乾燥粉体層を介して振動や空気の流量を調整することによって制御することができる。
ナノTiO 2のバルク乾燥粉末（AEROXIDE TiO 2の P25、エボニック、ドイツ）から生成されたTiO 2のエアロゾルは90 LPMでの吸入暴露室に希釈し、配信されていました。試験雰囲気はELPIで監視し、各実験動物のグループのための一貫した既知の露出を確保するために手動で調整した。また、実験動物の数が同じで構成される偽群は、常に研究に含まれるべきである。対照実験動物ではなく、エアロゾル粒子の清浄な濾過された空気に露出され、この偽群からの結果は、実験動物での試験ナノ粒子エアロゾルの生物学的効果を評価するために使用される。
1。チャンバ圧力
図3に示すように、チャンバー内の若干の負圧（-0.2±0.01ミリバール）は、周囲の実験室への被験物質の漏れを防ぐために、チャンバ入口および出口空気流量を制御を通して維持された。理想的には、吸入暴露室を含む客室には、わずかに負圧になっているはず。
2。空気流量、温度と相対湿度
入口及び排気流量はマスフローコントローラによって制御した。 図4に示すように、吸気流量は89.9±0.3 LPMであり、排気流量が111.9±0.9 LPMであった。温度と相対湿度は±0.4℃、6.9±0.6％の部屋の空気の温度を制御するスルーとhumidifで温度と湿度変換器を用いて監視し、22.6に制御した図5に示すように、IER。 3％〜80相対湿度下Pauluhn＆モーアの調査によると、ラットは、特定の効果4せずにどちら湿度雰囲気を容認。
3。チャンバーO 2とCO 2濃度
O 2及びCO 2濃度は、O 2及びCO 2ガス分析計で連続的にモニターした。 図6に示すように、O 2が 20.79±0.03％で安定しており、CO 2濃度が580±25ppmであった。
4。エアロゾルの特性評価
吸入試験に使用されるエアロゾルは、一般的に粒度分布関数と濃度パラメータを記述する2つのパラメータをリアルタイムに特徴がある。試験雰囲気の連続的な流れは、単なるサンプルを通してチャンバー内の動物のケージ上のゾーンから引っ張られた分析装置へのライン。
4.1粒度分布
図7Aは、標準の10 LPMのELPIで測定した粒度分布である。粒子のカウント力学的平均直径は157nmであり、図7Bは、TSI 3936L75のSMPSで測定した粒度分布である。粒子のカウント中央値モビリティ径が2.3の幾何標準偏差は145 nmである。 図図7Cは、吸入暴露試験中の粒度変化。粒径は、全体の露光期間中に比較的安定である。
4.2エアロゾル濃度
ナノたTiO 2粒子のリアルタイムの質量濃度プロファイルがちょうどELPIとケージ上記ゾーンでモニターした。 図8Aは、4時間/日吸入暴露時の粒子濃度である。間に吸入暴露は、実際の濃度は、重量法を用いて測定した3〜4の測定は、吸入量を算出するため、採取した。粒子は、47ミリメートルPTFEメンブレンフィルターで回収した。 XP2Uの天秤（メトラートレド、スイス）は、充填材の重量を量るために使用された。
吸入暴露チャンバー内のナノTiO 2の濃度の日内および日間変動が29個々の4時間/日吸入暴露（ターゲット濃度= 6.0ミリグラム/ m 3）での重量濃度に基づいて決定した。 図8Bに示すように、各イントラデイ濃度を意味し、その相対標準偏差（RSD）は、その4時間吸入暴露の間に3または4重量測定に基づいて計算した。イントラデイ濃度は0.02と0.17の間にRSDと5.3から6.6ミリグラム/ m 3での平均値を持っています。平均間日濃度とそのRSDは29個々の平均intrオプションに基づいて算出した日間の重量濃度。間の日平均濃度は0.06のRSDで6.0ミリグラム/ m 3である。それは私たちのシステムは、急性吸入暴露に対して安定した再現性のナノTiO 2の試験雰囲気を提供することができることを示した。
4.3エアロゾルの形態と元素組成
粒子の構造及び化学的組成物は、毒性試験において重要である。 TiO 2のサンプルは、47 mmのNucleporeポリカーボネートフィルター（ワットマン、クリントン、PA）に採取した。フィルターは4等分にカットされた、2つのセクションは、銀ペースト（銀コロイド液、電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルバニア州）のアルミニウムスタブに取り付けた。で、TiO 2の粒子を走査型電子顕微鏡日立4800電界放出（FESEM、日立、日本）を使用して表示し、また、エネルギー分散型X線分析（プリンストンガンマテック、ロッキーヒル、NJ SEM-EDX）を用いて分析した堆積20 keVの。
5。分布の均一性
試験化合物の濃度は場所から場所3に変化した場合チャンバ内に適切な環境パラメータを維持することは不十分である。ナノ粒子の濃度は、単に、露光チャンバ内のケージ上記のゾーンの4つの異なる位置で測定した。
位置での粒子の質量、M iが 、フィルタのサンプリングおよびマイクロ天秤で重量測定法で測定した。サンプリングされた粒子の平均質量である
平均濃度から位置iにおける質量濃度の相対的なずれがある
平均濃度は異なる測定位置での濃度の最大値の相対的な偏差は<6％である。これは、グループの計算の許容範囲内にある。
6。動物の肺で計算された微粒子堆積動物が露光期間中に試験雰囲気の既知濃度との取り込みを吸入または画分が知られて堆積される場合、堆積被験物質の量を算出することができる。
ここで、D =線量、C試験材料の=濃度、V M =分体積、T =暴露期間、及びF R堆積または吸収され、材料の=分数。
微小体積V mに対する平均値は経験的な相対成長スケーリング式1,2を用いて体重から推定することができる。例えば、ラットと仮定すると分時換気量V mは = 200 ml /分、露光濃度はC = 6.2ミリグラム/ m 3で、露光時間T =4時間、材料堆積F Rの割合 = 0.1、その後、計算された肺沈着D = 30μgの。
図1。吸入暴露施設 1 =露出室、2 =電気低圧インパクタ; 3 =エアロゾル発生器と、4 =スキャンモビリティパーティクルサイザー。
図2。ナノTiO2のエアロゾル発生の模式図 1 =空気分配; 2 =フィルタ; 3 = TiO 2の乾燥粉末; 4 =バッフル; 5 =シリンダー; 6 =ベンチュリ分散; 7 =サイクロン分離; 8 =バルブ（希釈空気） ; 9 =チャコール＆HEPAフィルター; 10 =バイブレーター; 11 =バルブ（乾燥粉末を通る空気）。
図3。チャンバ圧力チャンバ内の若干の負圧が-0.2ミリバール（ターゲットの圧力）に維持した。一度圧力が目標と圧力（スパイク）、ターゲットを絞った圧力に背圧を調整する制御システムはオフになっています。
図4。チャンバ入口および出口空気流量。入口空気流量の平均値= 89.9 LPM、排気空気流量チャンバ内の若干の負圧を維持する= 111.9 LPM。
図5。室の温度と湿度、平均臨時雇用者 erature = 22.6±0.4℃、相対湿度は6.9±0.6％である。
図6。チャンバO 2およびCO 2 O 2が 20.79パーセントであり、CO 2が 580 ppmである。
図7。 。TiO 2のエアロゾルのサイズ分布）ELPI、メディアン空気力学的直径D P = 157nmのを数え、B）SMPSは、D gの幾何標準偏差= 145 nmの2.3 グラム σメジアンモビリティ径をカウントC）粒子サイズ対時間。 ELPIから。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図8A。 4時間TiO 2のエアロゾル質量濃度。
図8B。 29個々の4時間の吸入暴露のTiO 2のエアロゾル質量濃度。
図9。 TiO 2のエアロゾルのSEM顕微鏡写真。フィルタ47ミリメートル）に標準的な粒度分布。B）赤矢印、1.78程度である。C）黄色の矢印、159 nmが。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
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図10。 TiO 2のエアロゾル試料のスペクトル。炭素は、フィルタからのものであり、金/パラジウムコーティングからです。 SEM-EDX結果に基づいて、試験した全ての粒子が真のTiO 2粒子であったことを実証し、チタン及び酸素のみから成っていた。
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Discussion
私たちは、組み立てと全身ナノ粒子エアロゾル吸入暴露系で、ここで説明している。システム機能は、最先端のナノ粒子のエアロゾルの特性評価技術で検証した。新規なナノ粒子のエーロゾル発生システムと、この吸入露光システムは、比較的一貫した温度、湿度、空気の流れ、および実験動物のための酸素含有量を十分に特徴づけられ、制御された均一なナノ粒子のエアロゾル試験雰囲気を提供することができる。露光システムは、動物の多数、または長期研究のための最も効率的である。この大全身チャンバ内に、実験動物は、気ままな快適な熱応力が最小化されている。露光の主な制限は、実験動物は、露光チャンバ内の雰囲気中に浸漬されることである。このような経口および経皮暴露として暴露他のルートが発生する可能性があります。また、全身系では、バルク材料が多量に必要とされるbecauより大きな入口流量のそれ。 12ポート鼻部吸入暴露システムでは、吸気流量が12 LPMである間、例えば0.5 m 3の露光チャンバと、このシステムでは、吸気流量は、90 LPMである。吸入暴露試験を計画する際にそのため、バルク材料のコストと可用性を考慮する必要があります。
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Disclosures
本報告書における調査結果と結論は著者のものであり、必ずしも国立労働安全衛生研究所の見解を表すものではありません。任意の会社名または製品の言及はNIOSHによる支持を意味するものではありません。また、代替製品が使用不能、または適切な評価の後に置換することができないことを意味するものではありません。
Acknowledgments
リスト謝辞と資金源。
NIH-ES015022およびES018274（TRN）
NSF-協力協定1003907（VCM）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhalation exposure system | TSE Systems GmbH, Bad Homburg, Germany | ||
| Air monitoring system | TSE Systems GmbH, Bad Homburg, Germany | ||
| Titanium dioxide Aeroxide P25 | Evonik, Germany | ||
| Scanning mobility particle sizer-3936L75 | TSI Inc., Shoreview, MN | ||
| Electric low pressure impactor, Standard 10 LPM | Dekati, Tampere, Finland | ||
| Ultra Micro Balance, XP2U | METTLER TOLEDO, Switzerland | ||
| Field Emission Scanning Electron Microscope-S-4800 | Hitachi, Japan | ||
| Energy dispersive X-ray analysis | Princeton Gamma-Tech, Rocky Hill, N.J. | ||
| Nuclepore polycarbonate filters | Whatman, Clinton, PA | ||
| PTFE membrane filters | Pall corporation, Ann Arbor, Michigan |
References
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