Summary
גראפן מציע פוטנציאל כחומר ציפוי לשתלים ביו. במחקר זה אנו מדגימים שיטה לציפוי Nitinol סגסוגות עם שכבות עבות ננומטרים של גרפן ולקבוע כיצד גרפן עשוי להשפיע על תגובת שתל.
Abstract
גרפן אטומי חלק כמו ציפוי פני שטח יש לו פוטנציאל לשיפור תכונות שתל. זה מדגים שיטה לציפוי Nitinol סגסוגות עם שכבות עבות ננומטרים של גרפן ליישומים כחומר תומכן. גראפן היה גדל על מצעי נחושת באמצעות שיקוע כימי ולאחר מכן העביר על Nitinol מצעים. על מנת להבין איך ציפוי גרפן יכול לשנות את התגובה ביולוגית, כדאיויות תא של תאי אב עורקי חולדות אנדותל ותאי שריר חלק אב עורקי חולדות נחקרו. יתר על כן, ההשפעה של ציפויי גראפן על הידבקות תא ומורפולוגיה נבדקה עם ניאון מיקרוסקופיה confocal. תאים הוכתמו לאקטין וגרעינים, והיו הבדלים בולטים בין דגימות Nitinol טהורות בהשוואה לדגימות גרפן מצופים. ביטוי יקטין סה"כ מתאי שריר חלק אב עורקי חולדות נמצא באמצעות כתם מערבי. מאפייני חלבון ספיחה, אינדיקטור לthrombogenicity פוטנציאל, Wפה נקבע לפיברינוגן אלבומין ועם ג'ל אלקטרופורזה. יתר על כן, העברת התשלום מפיברינוגן למצע הייתה להסיק באמצעות ספקטרוסקופיית ראמאן. נמצא כי ציפוי גרפן על Nitinol מצעים עמד בדרישות הפונקציונליות לחומר סטנט ושפר את התגובה הביולוגית לעומת Nitinol ללא ציפוי. לפיכך, Nitinol גרפן המצופה הוא מועמד קיימא לחומר תומכן.
Introduction
בשלושת העשורים האחרונים היינו עדים לגילוי טיפולי חומרים מבוססי רומן ומכשירים לטיפול במחלה ואבחון. חומרי סגסוגת רומן כגון Nitinol (NiTi) ונירוסטה משמשים לעתים קרובות בייצור ביו שתל בשל התכונות המכאניות המעולות שלהם. 1-3 עם זאת, אתגרים רבים להישאר בשל cytotoxicity החומרים אקסוגני, ביו וחמו תאימות. האופי המתכתי של תוצאות סגסוגות אלה בעניים ביו וhemocompatibility בשל שטיפת מתכת, חוסר הידבקות תא, התפשטות, ופקק כאשר הוא בא במגע עם דם זורם (כגון צנתרים, שתלי כלי דם, סטנטים כלי דם, מסתמי לב מלאכותי וכו '.). 1, 4, 5 האינטראקציה של חלבונים או תאי חיים עם פני שטח השתל יכולה לגרום לתגובה חיסונית חזקה והמפל שהתפתח בתגובות ביוכימיות עלולות להשפיע לרעה על תפקודו של המכשיר. לכן, הוא pertinאף אוזן גרון כדי להשיג שליטה על יחסי הגומלין בין השתלים ביו והסביבה הביולוגית סביבתה. שינוי פני שטח לעתים קרובות מועסק כדי להפחית או למנוע התגובה הפיזיולוגית השלילית שמקורו בחומר השתל. משטח ציפוי אידיאלי צפוי להיות גבוה כוח הידבקות, אדישות כימית, חלקות גבוהות, וחמו וbiocompatibility טוב. בעבר, חומרים רבים, ביניהם פחם, כמו יהלומים (DLC), SiC, פח, דוד 2 וחומרים פולימריים רבים נבדק כציפוי פני שטח שתל יו תואם. 1, 6-23 עם זאת, חומרים אלה עדיין לא מצליחין לעמוד בכל הקריטריונים הפונקציונליים לציפוי פני שטח שתל מתאים.
הגילוי של שכבה עבה של אטום הפחמן 2 sp, המכונה גרפן, פתח דלתות לפיתוח חומרים רבים תכליתיים חדשים. גראפן הוא צפוי להיות מועמד אידיאלי לציפוי פני שטח שתל שכן היאהוא אדיש מבחינה כימית, אטומי חלק ועמיד מאוד. במכתב זה, אנו חוקרים את הכדאיות של גרפן כציפוי לשתלים ביו. המחקרים שלנו מראים שNitinol המצופה גרפן (GR-NiTi) עונה על כל הקריטריונים הפונקציונליים, ובנוסף תומכים בשריר חלק מצוין וצמיחת תאי אנדותל שהובילה לשגשוג של תאים טובים יותר. כמו כן, אנו מוצאים שספיחת אלבומין על GR-NiTi גבוהה מפיברינוגן. חשוב לציין, (אני) המדידות ספקטרוסקופיות המפורטות שלנו אשרו את חוסר העברת תשלום בין גרפן ופיברינוגן טוען כי ציפוי גרפן מעכב את הפעלת טסיות דם על ידי שתלים, (ii) ציפוי גרפן אינו מפגין כל משמעותי ברעילות מבחנה לשורות תאי שריר האנדותל וחלקות המאשרות biocompatibility, וכן (iii) ציפויי גראפן הוא אינרטי מבחינה כימית, עמידים ובלתי חדירים בסביבה זורמת דם. אלה חמו ונכסים ביולוגיים, יחד עם st הגבוהrength, אדישות כימית ועמידות, לדקלם ציפוי גרפן כציפוי משטח אידיאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. גראפן ציפוי של NiTi
- דגימות גרפן השתמשו במחקר זה גדלו על מצעי נחושת (Cu) בשיטת השיקוע הכימית, ומשם הועברו ל4.5 2 מצעי מ"מ NiTi.
- Cu שקפים (1 סנטימטר x 1 סנטימטר) הונחו ב1 פנימה צינור תנור קוורץ ומחומם ל 1000 מעלות צלזיוס בנוכחות של 50 SCCM של H 2 ו450 SCCM של אר.
- מתאן הבא (1 ו 4 SCCM) הוכנס לתנור בספיקות שונות למשך 20-30 דקות. הדגימות לבסוף מקוררות לטמפרטורת חדר תחת זורם H 2, אר וCH 4.
- בשלב הבא, foils Cu היו מצופה ספין עם PMMA (מדולל עם anisole 4%) ב4000 סל"ד ואחרי טיפול בחום למשך 5 דקות ב 150 ° C. גראפן מצורף PMMA שכבה הושג בתחריט רדיד Cu באמצעות Transene Inc, CE-100 איכול, ולאחר מכן שטיפה ב10% HCl ומים מיוננים למשך 10 דקות.
- שלamples הועברו לNiTi מצעים (4.5 מ"מ 2) וannealed ב450 ° C באר (300 SCCM) וH 2 (700 SCCM) עבור 2 שעות להסיר PMMA. לבסוף, המצעים נשטפו עם אצטון להמסת PMMA השיורים להשיג מדגם GR-NiTi. Monochromator צורם משולש Dilor XY שמש לאפיון המייקר ראמאן (באמצעות אובייקטיבי 100X) של כל NiTisamples GR-עם עירור 514.5 nm מאר + ליזר יון.
2. רעילות במבחנה של GR-NiTi
תאי האנדותל אב עורקי עכברוש (תא היישום Inc,) היו בתרבית תאים בשקופית ג'לטין מצופית 8. לבדיקת גדילת התאים, הטהורה וGR-NiTisubstrates הוצבו בבארות ללא כל ציפוי ג'לטין. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורקות התקבלו באמצעות היטאצ'י S-4800 SEM. בנוסף, תאי שריר חלק אב עורקי חולדות גם גדלו בCellBind צלחות 96-כן קבוצת ביקורת (Corning) בDuשל lbecco שינוי הנשר בינוני (ATCC).
- לבדיקת כדאיויות תא, תאים (תאי שריר הן האנדותל וחלקים) נזרעו ב10 5 תאים / היטב בבארות המכילות NiTi הטהור, 1 SCCM או 4 SCCM GR-NiTi מצעים, שם SCCM האמור מתאים לזרימה מתאן משמשת צמיחת CVD של גראפן. תאים גודל במשך פרק הזמן הרצוי בחממה ב 37 ° C ו 5% CO 2, מחליף תקשורת בכל יום אחר.
- בנקודת זמן הסיום, תקשורת הוסרה ותקשורת טריה המכילה 0.5 מ"ג / המ"ל thiazolyl הכחול tetrazolium רומיד (או MTT מתקבל מסיגמא) התווספה לכל באר. תאים הודגרו אז עבור 3 שעות נוספות. לבדיקת MTS, תקשורת הוסרה בנקודת הזמן הסופית והוחלפה ב120 μl של פתרון MTS עבודה (96 מימיים תא ראשוני, Promega) ודגר על 3 שעות.
- בשלב הבא, התקשורת הוסרה בעדינות ו100 מ"ל של dimethylsulfoxide (סיגמא) התווסף לכל באר. לאחר allo10 דקים 'אגף לגבישי MTT לפזר, הפתרון הועבר לצלחת גם אחרת. לבדיקת MTS, לא dimethylsulfoxide נוסף לבארות. תוכן גם הועברו לצלחת חדשה.
- ספיגה הוקראה ב490 ננומטר וכדאיות האחוזים נקבעה על ידי נרמול ספיגה לספיגה הממוצעת של מדגם NiTi והטהור. לפחות חמש חזרות נעשו עבור כל סוג מדגם.
3. מחקרי מיקרוסקופיה confocal של מורפולוגיה סלולרית
- עבור הדמית confocal של תאי שריר חלק אב עורקי חולדות, מצעים הונחו בשקופית 8-קאמרית (Thermo Scientific). התאים נזרעו ב25,000 תאים / קאמרית וטופחו במשך 3 ימים על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2.
- תאים היו קבועים במצע עם פורמלין 4% בפוספט נאגר מלוח במשך 20 דקות.
- Permeabilized עם 0.1% Triton-X עבור 1 דקות.
- תקטין היה מוכתם בAlexa פלואוריד 488 phalloidin (יףטכנולוגיות ה). 100 μl של 488 phalloidin alexafluor ב200 יחידות / מ"ל במתנול התווסף ל1.9 מ"ל של פוספט נאגר מלוח. תאים הוכתמו 250 μl של 488 phalloidin alexafluor עבור 45 דקות ולאחר מכן שטפו פעמים עם פוספט נאגר מלוח.
- גרעינים היו רכובים עם מדיום הרכבת ניאון VectaShield מכיל DAPI (וקטור מעבדות). תמונות confocal נאספו באמצעות ניקון Confocal של TI. תא זרע עם תאים ללא כל מצע שמש כביקורת.
4. חלבון מחקרי ספיחה
- מידות מצע נמדדו עם מחוגה לפני תחילת ניסויי ספיחת החלבונים. שלוש מדידות נלקחו מכל צד של הדגימות כ המרובעות והממוצע כדי לקבל את האורך ורוחב.
- כל דגימה, NiTi וטהור, ו1sccm 4sccm GR-NiTiwere מודגרות עם 1 מ"ג / מיליליטר אלבומין בנאגר מלוח פוספט (PBS) או 1 מ"ג / המ"ל פיברינוגן ב PBS בחדר temperature עבור 3 שעות.
- דגימות זהות אוחדו בצינור microcentrifuge עם 200 μl של צמצום חיץ מדגם והרתיחו למשך 5 דקות.
- דוגמאות אז דוללו בטריס / גליצין / SDS חיץ (Bio-Rad) ולרוץ דרך 4-15% ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide טריס (Bio-Rad) ב 90 V עבור 100 דקות.
- ג'לי אז הוכתם SYPRO אדום. דלל אדום פתרון SYPRO (טכנולוגיות חיים) מלאה ב1:5,000 ב% חומצה 7.5 v / v אצטית. כתם ג'ל ל60 דקות.
- ג'לי תמונה באמצעות Flourchem SP (אלפא Innotech). עצמת פלורסנט כומתה באמצעות תוכנת ImageJ. עוצמת ניאון מכל מדגם הייתה נירמול של השטח הכולל של מצע ופיברינוגן הספיחה הייתה בהשוואה לספיחת אלבומין.
5. מערבי סופג לביטוי חלבון
- כתם מערבי בוצע לנתח תקטין מוחלט בתאי שריר חלק אב עורקי חולדות. תאים נזרעו ב10,000 תאים / מצע ב96-wצלחת ell.
- תאים גודל במשך שלושה ימים לפני הוצאת תקשורת. חלבון סה"כ הופק באמצעות חיץ Ripa והסטנדרטי BCA assay (Lamda) בוצע לכמת חלבון כולל.
- דגימות דוללו לאותו הריכוז בRipa ולאחר מכן מבושל בחיץ מדגם הפחתה למשך 5 דקות.
- חלבונים הופרדו על ידי 4-15% ג'ל polyacrylamide טריס באמצעות אלקטרופורזה ב 90 V עבור 100 דקות. חלבון סטנדרטי קליידוסקופ (Bio-Rad) שמש להערכת משקל מולקולרי חלבון.
- חלבונים הועברו לקרום PVDF וחסמו עם 1% פתרון חלב יבש ללא שומן (Bio-Rad).
- תקטין סה"כ היה מתויג עם נוגדן אנטי עכברוש יקטין ארנב (סיגמא). BM chemiluminescent ערכה (רוש) שמשה לאיתור הנוגדן הראשוני. קרומים שצלמו באמצעות FlourChem SP הדמית ציוד ועוצמת ניאון נמדדה באמצעות תוכנת ImageJ. עוצמת ניאון הייתה מנורמלת על ידי השוואה לפריstine NiTisample.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. איור 1 CVD גרפן) גדל polycrystalline על Cu foils מחק את הגרגרים גבישיים המתכת (סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר). ב) ספקטרום ראמאן של SCCM 1 (4 SCCM) גרפן מראה האופי של גרפן שכהוכן monolayer המציין הלהקה האינטנסיבי (יחסית חלש) G (מעטי שכבה). ג) תמונת מיקרוסקופ כוח אטומי של גרפן הועבר לNiTi מראה חספוס של ~ 5 ננומטר. סרגל קנה מידה = 500 ננומטר.
איור 2 תמונות confocal מיקרוסקופ אופטיים לSMCs גדל על) שקופית זכוכית שליטה, ב) NITI הטהור, ג) 1 SCCM GR-NITI וד) 4 SCCM GR-NiTi מצעים (סרגל קנה מידה:. 50 מיקרומטר).
e = "תמיד"> 
איור 3.) Assay MTT מראה כי GR-NiTi מצעים (1 ו 4 SCCM) אינם מציגים הבדל משמעותי בכדאיויות תא SMC יחסית לNiTi הטהור. ב) assay MTS מראה כי כדאיויות התא 3 הימים לRAECs לא הייתה משמעותית שונה מפקדים.
איור 4. סריקת תמונות מיקרוסקופיה אלקטרונית עבור RAECs גדל) וטהור NiTi, ב) 1 SCCM GR-NiTi וג) 4 SCCM GR-NiTi מצעי התכנית שציפוי גרפן להוביל למורפולוגיה תא הכדורית טובים יותר של RAECs. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.
איור 5.) יחס פיברינוגן / אלבומין לNiTi הטהור, GR-NiTi (1 ו 4 דגימות SCCM). ב) תרשים רמת אנרגיה לפיברינוגן וצפיפות אלקטרונית של גרפן מדינות למראה התאזנות של רמת פרמי. העברת אלקטרון מפיברינוגן לGR-NiTi אפשרית רק מהמצבים האלקטרוניים הכבושים של מולקולת פיברינוגן למצבים אלקטרוניים ריקים של GR-NiTi באותה רמת אנרגיה. שניהם גרפן היחיד וכמה שכבות הם מתכות למחצה בטמפרטורת חדר עם צפיפות נמוכה של המדינות בEF שתוצאתה העברה חלשה (בהשוואה לNitinol החשוף) תשלום מפיברינוגן לגראפן.
האיור 6. גראפן אינו מפגין כל שינויים בlineshape G-הלהקה או תדירות המציין את היעדריו של כל העברת תשלום מחלבוני הפלזמה. Deconvoluפסגות טד מתקבלות מהתאמת עקומות מוצגות בשחור.
איור 7. חלק) גראפן מצופה של אגורת Cu נחשף עד 5% H 2 O 2 נשאר ללא שינוי ואילו חלק שנחשף הוא דהוי. ב) אין שינוי בתדר ה-G-הלהקה נצפה במחקרים שלנו באתרו של ראמאן GR- NiTi שקוע ב70% 3 HNO מאשר את העמידות של ציפויי גראפן. ג) הזמן לחרוט לCu בספירת 100 ממס הוכפל כאשר Cu מצופה בגרפן (כמו בGR-NiTi) מציין את האטימות של קרומי גרפן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biocompatibility וcytotoxicity: התצהיר הכימי האדים (CVD) השיטה הניבו דגימות גראפן polycrystalline שחיקו גרגרים גבישיים Cu, כפי שמוצגים באיור 1 א. אנחנו עובדים ספקטרוסקופיית ראמאן כדי לאשר את קיומו של גרפן monolayer (מעטי שכבה) על 1 SCCM (4 SCCM) דגימות (ראה איור 1b). ברור, 1 SCCM (4 SCCM) דגימות מפגינות הלהקה מעידה על monolayer 'החזק (יחסית חלש) G (מעטי שכבה) גראפן. האיור 1c מראה כוח מיקרוסקופיה תמונה אטומית (AFM) של כמה גרפן שכבה על NiTi מצעים. המדידה המפורטת שלנו הניבה ערך של חספוס פני השטח R Q = 5 ננומטר לשכבות גרפן הועברו (GR-NiTi). העובדה ידועה היא שטופוגרפית משטח nanostructured מאוד משפיעה על צורת תא והרכבת cytoskeletal בתאי אנדותל ותאי שריר חלק. שורות תאים אלו מגיבים ללחצים המכאניים על ידי שינוי רמות השומנים בbilayerנזילות, אשר עלול להשפיע לרעה טרנסלוקציה חלבון ואת כניסתם של מפעילים כגון סידן לתוך תאים. חשוב מכך, עלייה בשיפוע מתח קרום התא יכולה לשנות את הקונפורמציה וצפיפות של הקולטנים בתא שטח. על מנת לבחון את ההשפעה של ציפוי גרפן על שיפועי הלחץ של תאים, שחקרנו את שריר החלק ומורפולוגיה של תאי האנדותל באמצעות שיטות מיקרוסקופיה.
כפי שמוצג באיור 2, שריר תא מורפולוגיה חלקה (SMC) על NiTi הטהור הוא שאינם כדורי. בהמשך, התאים מפוזרים בדלילות המציין הידבקות חלשה של SMCs לNiTi והטהור. להיפך, SMCs הם צפופים וכדוריים בGR-NiTi (גם 1 ו 4 SCCM) משטחים הדומים לשליטה. ציפוי גרפן מפחית מתח הדרגות בתאים על ידי מתן משטחים חלקים (עולה מערכי q R נמוכים שמוצגים באיור 1 ג) ולכן תוצאות במורפולוגיה של תאים טובה יותר.על מנת למדוד את כדאיויות תא והשגשוג, בצע assay MTT על SMCs גדל על טהור וGR-NiTisubstrates בשעת 3 ו 7 נקודות ביום בזמן. בבדיקה זו, MTT הצבע (צבע צהוב) מצטמצם לformazan צבע (צבע סגול) על ידי אנזימי reductase הפעילים, ולכן התאים הבריאים ומתרבים (או cytotoxicity של החומר) ניתן לכמת על ידי ביצוע מדידות colorimetric. כפי שמוצגים באיור 3 א, אנחנו לא צופים שינויים משמעותיים ברעילות לGR-NiTi מצעים לאחר 3 ו 7 ימים. תוצאות אלה מאשרות כי ציפויי גראפן לא לגרום רעילויות עודפות בהשוואה לNiTi המצעים והטהורים עצמם.
כדי לאשרר את ההשפעות של ציפוי גרפן, בצעו ניסויי הדמיה מפורטת אלקטרונים מיקרוסקופים בתאי אנדותל עכברוש אב עורקים (ראה איור 4). התאים על מצעי NITI טהורים הם דלילים ומוארכים בזמן שהם ellipsoidal ודense על GR-NiTi המצעים. מורפולוגיה כגון שיפור תא וצפיפות נמצאה להיות דומה לSMCs מאשר את ההפחתה הדרגתית במתח המסופק על ידי ציפוי גרפן. יתר על כן, מדד cytotoxicity הציפוי גרפן על RAEC באמצעות 3 - MTS (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium assay. הרציונל לשימוש בMTS assay (במקום MTT) הוא בתאימות הטובה יותר שלו עם תקשורת הצמיחה RAEC ותנאים. כפי שמוצג באיור 3 ב, assay MTS על התא האנדותל הציג יכולת קיום טובה מאוד תא והתפשטות מאשרת שום רעילויות עודפים מציפויי גראפן אפילו לRAEC. חשוב לציין, גם 1 ו 4 SCCM GR-NiTi הציג שום שינויים משמעותיים בריבוי תאים המצביעים על תלות של המורפולוגיה של תאים על מספר שכבות גרפן.
חלבון הספיחה וHemocompatibility: קרישת דם באזור חה חומר השתלזה היה אחד המכשולים העיקריים בטכנולוגיית השתל מאז 2003. כפי שהוזכר קודם לכן, חומר השתל מפעיל מפל קרישה כאשר הוא בא במגע עם דם. האינטראקציה בין השתל והדם יו מתחילה בספיחה של חלבוני פלזמה (, פיברינוגן אלבומין, וכו '.) על פני השטח שלו. בתחילה, חלבונים נפוצים מאוד כגון, flbrinogen אלבומין, והם flbronectin adsorbed אך מאוחר יותר הוחלפו על ידי הגורמים XII וkininogen משקל המולקולרי הגבוה. יחס flbrinogen adsorbed ואלבומין הוא קריטי בקביעת hemocompatibility של החומר הביולוגי. בעבר, שיעור נמוך של פיברינוגן / אלבומין adsorbed על פני שטח שתל ביו נמצא קשור להידבקות טסיות דם נמוך והיווצרות קרישים. 1 כפי שמוצג באיור 5 א, יחס GR-NiTi תערוכה נמוך פיברינוגן / אלבומין יחסית לNiTi הטהור מציע hemocompatibility טוב יותר נובעים מגראפן. לבלף / Alb למאזןo הייתה נמוכה באופן משמעותי לשני 1 ו 4 SCCM GR-NiTi המציין כי hemocompatibility של גראפן הוא שכבה עצמאית.
זה ידוע כי העברת האלקטרון מהמולקולה פיברינוגן לשתל היא אחראית להיווצרות של הפיברין, כצעד ראשון לצמיחת פקיק. כפי שמוצג באיור 5b, פיברינוגן מציג מוליכים למחצה כמו צפיפות של מדינות אלקטרוניות או DOS (מסומן בעמ '(E)) עם פער אנרגיה של 1.8 eV. הרמות פרמו (EF) של פיברינוגן וGR-NiTi לאזן בממשק שלהם. העברת תשלום של אלקטרון אחד לפיברינוגן דרושה להיווצרות של הפיברין על NiTi והטהור, והעברת אלקטרון ממולקולת פיברינוגן לGR-NiTi אפשרי רק מהמצבים האלקטרוניים הכבושים של מולקולת פיברינוגן למצבים אלקטרוניים ריקים של GR-NiTi באותה רמת אנרגיה. שניהם גרפן היחיד וכמה שכבות הם מתכות למחצה בטמפרטורת חדר עם עמ נמוך (E) F E 24. כך, חילופי זרם הטעינה מפיברינוגן לגרפן הם זניח (לעומת חשוף Nitinol) בשל ערכים נמוכים של p (E). מאפיין מהותי זה של ציפויי גראפן הוא חיוני לכל עיכוב העברת תשלום מפיברינוגן (וקרישת דם שלאחר מכן).
אנחנו עובדים ספקטרוסקופיה המייקר ראמאן כדי לאשר שדינמיקת העברת התשלום בין פיברינוגן וGR-NiTi היא אכן משמעותית. ספקטרום ראמאן של גראפן מציג מספר תכונות חדות בעקבות תופעות תהודה. יש לציין, הלהקה המשיקה (G-Band) נובעת מרטט המישורים של אטומי הפחם ונמצאה בעבר להיות רגיש מאוד להעברת התשלום. התדר 25-G-הלהקה ידועה upshift (downshift) כאשר כל acceptor מינים (תורם) אינטראקציה עם גרפן באמצעות חור העברה (אלקטרונים). חשוב לציין, lineshape של ה-G-dev הלהקהiates מהלורנצי סימטרית לאסימטרי (bwf) עקב לחייב העברת lineshape רייט-יגנר-Fano. 25 כצפוי, אנו לא צופים שינוי בתדר ה-G-הלהקה של גראפן על ספיחה של פיברינוגן המאשר את היעדר העברת תשלום בין GR-NiTi ופיברינוגן (איור 6). עיכוב כזה של העברת תשלום ויחס נמוך לבלף / Alb מצביע hemocompatibility הטוב של ציפויי גראפן.
אדישות כימית של ציפויי גראפן: גראפן ידוע לפעול כשכבת הגנה בשל מאפייני physicochemical הייחודיים שלה. sp סריג חלת הדבש שלה 2 מספק מחסום דיפוזיה טבעית, ולפיכך מונע שטיפת יון מתכת מחומר השתל. לאחרונה, גרפן שמש כבלון מיקרוסקופי אטום 26 ושכבת הגנה לCu / ניקל 27. למרות היציבות והאטימות של גרפן הם מתועדים היטב בליטרשבמקום, אנו מציגים את הנתונים שלנו הקשורים לתחריט של מטבע Cu באיור 7 לחזור על השימושיות והכדאיות של גרפן כמו ציפויי שתל. כפי שמוצג באיור 7 א, החלק המצופה גרפן של המטבע (~ 95% Cu) ימשיך להיות מוגן מחמצון כאשר הם נחשפים לH 2 O 2 תוך האזור החשוף של המטבע הפך את צבע במגע עם 5% H 2 O 2 (ראה התמונה המוגדלת האופטית מיקרוסקופ ב7a איור).
כדי לבדוק את העמידות של ציפוי גרפן, אנו נחשפים GR-NiTi מצעים עד 70% חומצה חנקתית עד NiTi היה חרוט בחלקו. בספקטרוסקופיית ראמאן באתרו של GR-NiTi השקוע ב3 HNO לא הראתה כל שינוי ב- ו-D-G-הלהקה של גראפן רומז כי ציפוי גרפן הוא עמיד ביותר (איור 7 ב). יתר על כן, מצא כי ציפוי גרפן בGR-NiTi מפחית את השיעור לחרוט של coppe הבסיסיr כפי שמוצג באיור 7 ג.
לסיכום, המדידות ספקטרוסקופיות המפורטות שלנו אשרו את חוסר העברת תשלום בין גרפן ופיברינוגן טוען כי ציפוי גרפן מעכב את הפעלת טסיות דם על ידי שתלים. בנוסף, ציפוי גרפן אינו מפגין כל משמעותי ברעילות מבחנה לשורות תאי שריר חלקות האנדותל ומאשרות biocompatibility. יתר על כן, ציפויי גראפן נמצאו אינרטי מבחינה כימית, עמיד ובלתי חדיר בסביבה זורמת דם. ויו hemocompatibility של ציפויי גראפן יחד עם האדישות הכימית שלו, עמידותו ואטימותו להפוך גרפן חומר ייחודי לציפוי שתלים ביו. לבסוף, יציינו כי הצלחנו להעביר יריעות גרפן גבי סיבי NITI בודדים, באמצעות שרשת גרפן המצופה יכולה להיות מיוצרת. יש לנו גם פתחו יריעות גרפן כימי נשרו שניתן ישירות ספין ont המצופהo סטנטים רשת הדמויים. בנוסף, הניסויים הראשוניים שלנו מראים שזה אכן אפשרי לגדל גרפן ישירות על סגסוגת NiTi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ATCC | 30-2002 | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| CellTiter 96 Aqueous One solution cell proliferation assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 36.5% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexafluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Human fibrinogen | |||
| Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1158 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 45726 | |
| SYPRO Red | Life Technologies | S-6653 | |
| Protein low BCA assay | Lamda Biotech | G1003 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standard | Bio-Rad | 161-0375 | |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Blotting grade blocker non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Anti-actin antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting kit (mouse/rabbit) | Roche Applied Science | 11520709001 | |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| NiTi (51% Ni, 49% Ti) | Alfa-Aesar | 44953 | |
| Equipment | |||
| Horiba JobinYvon | Raman spectrometer | Dilor XY 98 | |
| Nikon | Confocal microscope | Eclipse TI microscope | |
| Thermoscientific | Plate reader | ||
| Bio-Rad | Power supply | 164-5050 | PowerPac basic power supply |
| Bio-Rad | Electrophoresis cell | 165-8004 | Mini-PROTEAN tetra cell |
| Bio-Rad | Gel holder cassette | 170-3931 | Mini gel holder cassette |
References
- Roy, R. K., Lee, K. -R. Biomedical applications of diamond-like carbon coatings: A review. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 83 B (1), 72-84 (2007).
- Shah, A. K., Sinha, R. K., Hickok, N. J., Tuan, R. S. High-resolution morphometric analysis of human osteoblastic cell adhesion on clinically relevant orthopedic alloys. Bone. 24 (5), 499-506 (1999).
- Huang, N., Yang, P., Leng, Y. X., Chen, J. Y., Sun, H., Wang, J., Wang, G. J., Ding, P. D., Xi, T. F., Leng, Y. Hemocompatibility of titanium oxide films. Biomaterials. 24 (13), 2177-2187 (2003).
- Gutensohn, K., Beythien, C., Bau, J., Fenner, T., Grewe, P., Koester, R., Padmanaban, K., Kuehnl, P. In vitro analyses of diamond-like carbon coated stents: Reduction of metal ion release, platelet activation, and thrombogenicity. Thrombosis Research. 99 (6), 577-585 (2000).
- Gillespie, W. J., Frampton, C. M. A., Henderson, R. J., Ryan, P. M. The Incidence of Cancer Following Total Hip-Replacement. Journal of Bone and Joint Surgery-British Volume. 70 (4), 539-542 (1988).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26 (33), 6547-6557 (2005).
- Mikhalovska, L. I., Santin, M., Denyer, S. P., Lloyd, A. W., Teer, D. G., Field, S., Mikhalovsky, S. Fibrinogen adsorption and platelet adhesion to metal and carbon coatings. Thrombosis and Haemostasis. 92 (5), 1032-1039 (2004).
- Airoldi, F., Colombo, A., Tavano, D., Stankovic, G., Klugmann, S., Paolillo, V., Bonizzoni, E., Briguori, C., Carlino, M., Montorfano, M., Liistro, F., Castelli, A., Ferrari, A., Sgura, F., Mario, C. D. i Comparison of diamond-like carbon-coated stents versus uncoated stainless steel stents in coronary artery disease. American Journal of Cardiology. 93 (4), 474-477 (2004).
- Allen, M., Myer, B., Rushton, N. In vitro and in vivo investigations into the biocompatibility of diamond-like carbon (DLC) coatings for orthopedic applications. Journal of Biomedical Materials Research. 58 (3), 319-328 (2001).
- Butter, R., Allen, M., Chandra, L., Lettington, A. H., Rushton, N. In-vitro Studies of DLC Coatings with Silicon Intermediate Layer. Diamond and Related Materials. 4 (5-6), 857-861 (1995).
- Dearnaley, G., Arps, J. H. Biomedical applications of diamond-like carbon (DLC) coatings: A review. Surface & Coatings Technology. 200 (7), 2518-2524 (2005).
- Dorner-Reisel, A., Schurer, C., Nischan, C., Seidel, O., Muller, E. Diamond-like carbon: alteration of the biological acceptance due to Ca-O incorporation. Thin Solid Films. 420, 263-268 (2002).
- Dowling, D. P., Kola, P. V., Donnelly, K., Kelly, T. C., Brumitt, K., Lloyd, L., Eloy, R., Therin, M., Weill, N. Evaluation of diamond-like carbon-coated orthopaedic implants. Diamond and Related Materials. 6 (2-4), 390-393 (1997).
- Grill, A. Diamond-like carbon coatings as biocompatible materials - an overview. Diamond and Related Materials. 12 (2), 166-170 (2003).
- Hauert, R. A review of modified DLC coatings for biological applications. Diamond and Related Materials. 12 (3-7), 583-589 (2003).
- Windecker, S., Mayer, I., De Pasquale, G., Maier, W., Dirsch, O., De Groot, P., Wu, Y. P., Noll, G., Leskosek, B., Meier, B., Hess, O. M. Working Grp Novel Surface, C., Stent coating with titanium-nitride-oxide for reduction of neointimal hyperplasia. Circulation. 104 (8), 928-933 (2001).
- Zhang, F., Zheng, Z. H., Chen, Y., Liu, X. G., Chen, A. Q., Jiang, Z. B. In vivo investigation of blood compatibility of titanium oxide films. Journal of Biomedical Materials Research. 42 (1), 128-133 (1998).
- Bolz, A., Schaldach, M. Artificial-Heart Valves - Improved Blood Compatibility By PECVD a-SiC-H COATING. Artificial Organs. 14 (4), 260-269 (1990).
- Haude, M., Konorza, T. F. M., Kalnins, U., Erglis, A., Saunamaki, K., Glogar, H. D., Grube, E., Gil, R., Serra, A., Richardt, H. G., Sick, P., Erbel, R., Invest, C. T. Heparin-coated stent placement for the treatment of stenoses in small coronary arteries of symptomatic patients. Circulation. 107 (9), 1265-1270 (2003).
- Suggs, L. J., Shive, M. S., Garcia, C. A., Anderson, J. M., Mikos, A. G. In vitro cytotoxicity and in vivo biocompatibility of poly(propylene fumarate-co-ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 46 (1), 22-32 (1999).
- Clarotti, G., Schue, F., Sledz, J., Benaoumar, A. A., Geckeler, K. E., Orsetti, A., Paleirac, G. Modification of the biocompatible and haemocompatible properties of polymer substrates by plasma-deposited fluorocarbon coatings. Biomaterials. 13 (12), 832-840 (1992).
- Gombotz, W. R., Guanghui, W., Horbett, T. A., Hoffman, A. S. Protein adsorption to poly(ethylene oxide) surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (12), 1547-1562 (1991).
- Ishihara, K., Fukumoto, K., Iwasaki, Y., Nakabayashi, N. Modification of polysulfone with phospholipid polymer for improvement of the blood compatibility. Part 2. Protein adsorption and platelet adhesion. Biomaterials. 20 (17), 1553-1559 (1999).
- Jung, N., Kim, B., Crowther, A. C., Kim, N., Nuckolls, C., Brus, L. Optical Reflectivity and Raman Scattering in Few-Layer-Thick Graphene Highly Doped by K and Rb. ACS Nano. 5 (7), 5708-5716 (2011).
- Rao, A. M., Eklund, P. C., Bandow, S., Thess, A., Smalley, R. E. Evidence for charge transfer in doped carbon nanotube bundles from Raman scattering. Nature. 388 (6639), 257-259 (1997).
- Bunch, J. S., Verbridge, S. S., Alden, J. S., vander Zande, A. M., Parpia, J. M., Craighead, H. G., McEuen, P. L. Impermeable atomic membranes from graphene sheets. Nano Letters. 8 (8), 2458-2462 (2008).
- Chen, S., Brown, L., Levendorf, M., Cai, W., Ju, S. -Y., Edgeworth, J., Li, X., Magnuson, C. W., Velamakanni, A., Piner, R. D., Kang, J., Park, J., Ruoff, R. S. Oxidation Resistance of Graphene-Coated Cu and Cu/Ni Alloy. Acs Nano. 5 (2), 1321-1327 (2011).
