Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Graphene Maling til biomedicinske implantater

Published: March 1, 2013 doi: 10.3791/50276
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,4
1Department of Physics, Clemson University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 3Department of Bioengineering, Clemson University, 4Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies, Clemson University

Summary

Graphene giver potentiale som et coatingmateriale til biomedicinske implantater. I denne undersøgelse har vi demonstrere en metode til belægning af nitinol legeringer med nanometer tykke lag af graphene og bestemme, hvordan graphene kan påvirke implantatet respons.

Abstract

Atomically glat graphene som en overfladebelægning har potentiale til at forbedre implantat egenskaber. Dette viser en fremgangsmåde til belægning af nitinol legeringer med nanometer tykke lag af graphene til anvendelse som en stent materiale. Graphene blev dyrket på kobber substrater via kemisk dampafsætning og derefter overført til nitinol substrater. For at forstå, hvordan graphene coating kunne ændre biologisk respons blev cellelevedygtighed af rotte-aorta-endothelceller og rotte aorta glatmuskelceller undersøgt. Desuden blev virkningen af ​​graphene-overtræk på celleadhæsion og morfologi undersøgt med fluorescerende konfokal mikroskopi. Celler blev farvet for actin og kerner, og der var tydelige forskelle mellem uberørte nitinol prøver sammenlignet med graphene-coatede prøver. I alt actin ekspression fra rotte aorta glatmuskelceller blev fundet ved hjælp af western blot. Proteinadsorption karakteristika, en indikator for potentiel thrombogenicitet, were bestemt for serum albumin og fibrinogen med gelelektroforese. Desuden blev overførsel af ladning fra fibrinogen til substratet udledt ved hjælp af Raman-spektroskopi. Det konstateredes, at graphene belægning på nitinol substrater opfyldt de funktionelle krav til en stent materiale og forbedret biologiske respons sammenlignet med uovertrukne nitinol. Således graphene-belagt nitinol er en mulig kandidat til en stent materiale.

Introduction

De seneste tre årtier har været vidne til opdagelsen af ​​nye materialer-baserede terapier og indretninger til sygdomsbehandlinger og diagnostik. Nye legering materialer såsom nitinol (NiTi) og rustfrit stål anvendes ofte i biomedicinsk implantat fremstilling på grund af deres overlegne mekaniske egenskaber. 1-3 imidlertid talrige udfordringer på grund af eksogent materiale cytotoksicitet, bio-og hæmo-kompatibilitet. Den metalliske natur af disse legeringer resulterer i dårlig bio-og hemocompatibility grund metal udvaskning, mangel på celleadhæsion, proliferation og thrombose, når det kommer i kontakt med strømmende blod (såsom katetre, blodkartransplantater, vaskulære stents, kunstige hjerteklapper etc.). 1, 4, 5 Interaktionen af proteiner eller levende celler med implantatoverfladen kan føre til en kraftig immunologisk reaktion og den efterfølgende kaskade af biokemiske reaktioner kan påvirke enhedens funktionalitet. Derfor er det pertinent for at opnå kontrol over samspillet mellem biomedicinske implantater og dens omgivende biologisk miljø. Overflademodifikation anvendes ofte til at reducere eller forebygge de negative fysiologiske respons hidrørende fra implantatmaterialet. En ideel overfladebelægning forventes at have høj adhæsionsstyrke, kemisk stabilitet, høj glathed, og god hæmo-og bioforligelighed. Tidligere har mange materialer, herunder diamant-lignende carbon (DLC), SiC, TiN, TiO 2 og mange polymermaterialer blevet testet som bio-kompatible implantater overfladebelægninger. 1, 6-23 Men disse materialer er stadig ikke i stand til at opfylde alle de funktionelle kriterier for en egnet implantat overfladebelægning.

Opdagelsen af atom tykt lag af sp 2 kulstof, kendt som graphene, har åbnet dørene for udvikling af nye multifunktionelle materialer. Graphene forventes at være en ideel kandidat til implantat overfladebelægning, da deter kemisk inert, atomically glat og meget holdbar. I dette brev undersøger vi levedygtigheden af ​​graphene som en overfladebelægning til biomedicinske implantater. Vore undersøgelser viser, at graphene overtrukne nitinol (Gr-NiTi) opfylder alle de funktionelle kriterier, og yderligere støtter fremragende glat muskulatur og endotelcellevækst fører til bedre celleproliferation. Vi finder endvidere den serumalbumin adsorption på Gr-NiTi er højere end fibrinogen. Vigtigt er, (i) vore detaljerede spektroskopiske målinger bekræftede manglen på ladningsoverførsel mellem graphene og fibrinogen antyder, at graphene coating inhiberer blodpladeaktivering af implantater, (ii) graphene overtræk udviser ikke nogen signifikant in vitro-toksicitet af endothel-og glatte muskelceller cellelinier bekræfter deres biokompatibilitet, og (iii) graphene belægninger er kemisk inerte, hårde og vandtætte i strømmende blod miljø. Disse hæmo-og biokompatible egenskaber samt høj strength, kemisk stabilitet og holdbarhed, gør graphene belægninger som en ideel overfladebelægning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Graphene-coating af NiTi

  1. De graphene prøver anvendt i dette studie blev dyrket på kobber (Cu) substrater ved hjælp af kemisk dampaflejring teknik, og efterfølgende overført til 4,5 mm 2 NiTi substrater.
  2. Cu folier (1 cm x 1 cm) blev anbragt i en 1 in kvartsrør ovn og opvarmet til 1000 ° C i nærværelse af 50 sccm af H2 og 450 sccm med Ar.
  3. Next, methan (1 og 4 sccm) indført i ovnen ved forskellige strømningshastigheder for 20-30 min. Prøverne blev endelig afkølet til stuetemperatur under strømmende H2, Ar og CH4.
  4. Next, Cu folier blev spin-belagt med PMMA (fortyndet med 4% anisol) ved 4.000 rpm efterfulgt af en varmebehandling i 5 minutter ved 150 ° C. Graphene fastgjort til PMMA lag blev fremstillet ved ætsning af Cu folie med Transene Inc., CE-100 ætsemiddel, og efterfølgende skylning i 10% HCI og afioniseret vand i 10 minutter.
  5. Den ssempler blev overført til NiTi substrater (4,5 mm 2) og udglødet ved 450 ° C i Ar (300 sccm) og H2 (700 sccm) i 2 timer til fjernelse af PMMA. Endelig blev substrater vasket med acetone for at opløse det tilbageværende PMMA til opnåelse af Gr-NiTi prøven. En Dilor XY triple rist monochromator blev anvendt til mikro-Raman karakterisering (hjælp 100X mål) af alle Gr-NiTisamples med 514,5 nm excitation fra en Ar +-ionlaser.

2. In vitro Toksicitet af Gr-NiTi

Rotte aorta-endothelceller (Cell ansøgning Inc.,) blev dyrket på et gelatine coated otte kamre slide. Til afprøvning af cellevækst, upåvirket og Gr-NiTisubstrates blev anbragt i brønde uden nogen gelatineovertræk. Scanning Electron Microscopy billeder blev opnået under anvendelse af et Hitachi S-4800 SEM. Derudover blev rotte aorta glatmuskelceller også dyrket i Cellbind plader med 96 brønde som en kontrolgruppe (Corning) i Dulbecco s Modified Eagle Medium (ATCC).

  1. Til afprøvning af cellelevedygtighed blev celler (både endothel og glatte muskelceller) podet med 10 5 celler / brønd i brønde indeholdende uberørt NiTi, 1 sccm eller 4 sccm Gr-NiTi substrater, hvor den angivne sccm svarer til methan flow anvendes i CVD vækst i graphene. Celler blev dyrket i det ønskede tidsrum i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2, udveksling medier hver anden dag.
  2. Ved afslutningen tidspunkt blev mediet fjernet, og frisk medium indeholdende 0,5 mg / ml thiazolyl blue tetrazolium-bromid (MTT eller opnået fra Sigma) blev tilsat til hver brønd. Celler blev derefter inkuberet i yderligere 3 timer. Til MTS-assayet blev mediet fjernet på det endelige tidspunkt og erstattet med 120 pi MTS arbejdsopløsning (Cell Tier 96 vandige, Promega) og inkuberet i 3 timer.
  3. Dernæst blev mediet forsigtigt fjernet, og 100 ml dimethylsulfoxid (Sigma) blev tilsat til hver brønd. Efter allovinge 10 min for MTT krystaller opløses, opløsningen blev overført til en anden brønds plade. Til MTS-assay blev der ikke dimethylsulfoxid tilsat til brøndene. Og indholdet blev overført til en ny plade.
  4. Absorbansen blev aflæst ved 490 nm, og den procentvise levedygtighed bestemtes ved at normalisere absorbans til den gennemsnitlige absorbans uberørt NiTi prøven. Mindst fem gentagelser blev udført for hver prøvetype.

3. Konfokal mikroskopi Undersøgelser af cellemorfologi

  1. Til konfokal afbildning af rotte aorta glatmuskelceller blev substrater anbragt i en 8-kammer slide (Thermo Scientific). Cellerne blev podet ved 25.000 celler / kammer og inkuberet i 3 dage ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Celler blev fikseret på substratet med 4% formaldehyd i phosphatbufret saltvand i 20 minutter.
  3. Permeabiliseret med 0,1% Triton-X i 1 min.
  4. Actin blev farvet med Alexa Fluor 488 phalloidin (Life teknologier). 100 ul alexafluor 488 phalloidin på 200 enheder / ml i methanol blev tilsat til 1,9 ml phosphatbufret saltvand. Celler blev farvet med 250 ul alexafluor 488 phalloidin i 45 minutter og derefter vasket to gange med phosphatbufret saltvand.
  5. Kerner blev monteret med Vectashield fluorescerende indeholdende DAPI (Vector Laboratories). Konfokale billeder blev indsamlet ved hjælp af et Nikon Konfokal TI. Et kammer podet med celler uden substrat blev anvendt som kontrol.

4. Proteinadsorption Studies

  1. Substrat dimensioner blev målt med calipre, før du starter proteinadsorption eksperimenter. Tre målinger blev foretaget for hver side af de omtrent kvadratiske prøver og midles for at få den længde og bredde.
  2. Hver prøve, uberørt NiTi, 1sccm og 4sccm Gr-NiTiwere inkuberet med 1 mg / ml albumin i phosphatpufret saltvand (PBS) eller 1 mg / ml fibrinogen i PBS ved stuetemperatur temperatur i 3 timer.
  3. Ens prøver blev kombineret i et mikrocentrifugerør med 200 pi reducerende prøvebuffer og kogt i 5 min.
  4. Prøver blev derefter fortyndet i en Tris / Glycine / SDS-puffer (Bio-Rad) og køres gennem en 4-15% Tris polyacrylamid-elektroforese-gel (Bio-Rad) ved 90 V i 100 minutter.
  5. Gelerne blev derefter farvet med SYPRO Red. Fortynd SYPRO Red (Life Technologies) stamopløsning på 1:5000 i 7,5 v / v% eddikesyre. Stain geler i 60 min.
  6. Billed geler under anvendelse af en Flourchem SP (Alpha Innotech). Fluorescensintensitet blev kvantificeret ved anvendelse ImageJ software. Fluorescensintensitet fra hver prøve blev normaliseret med det samlede areal af substratet og fibrinogenadsorption blev sammenlignet med albumin adsorption.

5. Western Blotting til proteinekspression

  1. Western blot blev udført for at analysere totale actin i rotte aorta glatmuskelceller. Celler blev podet ved 10.000 celler / substrat i en 96-well plade.
  2. Cellerne blev dyrket i tre dage, før du fjerner medier. Totalt protein blev ekstraheret med RIPA-buffer og en standard BCA assay (Lamda) blev udført for at kvantificere totale proteinindhold.
  3. Prøver blev fortyndet til den samme koncentration i RIPA og derefter kogt i en reducerende prøvebuffer i 5 minutter.
  4. Proteiner blev adskilt af en 4-15% Tris polyacrylamidgel via elektroforese ved 90 V i 100 minutter. En kalejdoskop protein standard (Bio-Rad) blev anvendt til at vurdere protein molekylvægt.
  5. Proteiner blev overført til en PVDF-membran og blokeret med en 1% ikke-fedtholdig tørmælk (Bio-Rad) opløsning.
  6. I alt actin blev mærket med et kanin-anti-rotte-actin-antistof (Sigma). A BM kemiluminescerende kit (Roche) blev anvendt til at detektere det primære antistof. Membraner blev filmede med FlourChem SP imaging udstyr og fluorescensintensitet blev målt ved hjælp af ImageJ software. Fluorescensintensiteten blev normaliseret ved sammenligning af pristine NiTisample.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1
. Figur 1 a) CVD dyrket polykrystallinske graphene på Cu folier efterligner metal krystalkorn (skala bar: 10 pm). b) Raman-spektrum af 1 sccm (4 sccm) graphene viser intens (relativt svagere) G 'band indikerer monolag (få lag) arten af ​​som fremstillet graphene. c) AFM billede af graphene overføres til NiTi viser en ruhed på ~ 5 nm. Scale bar = 500 nm.

Figur 2
Figur 2 konfokalt optisk mikroskopi billeder til SMC'er dyrket på a) kontrol objektglas, b) uberørt NiTi, C) 1 sccm Gr-NiTi og d) 4 sccm Gr-NiTi substrater (skala bar:. 50 um).


Fig. 3. a) MTT-analyse viser, at Gr-NiTi substrater (1 og 4 sccm) ikke udviser en signifikant forskel i SMC cellelevedygtighed i forhold til uberørt NiTi. B) MTS assay viser, at 3 dage cellelevedygtighed for RAECs ikke var signifikant anderledes end kontrollerne.

Figur 4
Figur 4. Scanning Electron Microscopy billeder til RAECs dyrkes a) uberørt NiTi, b) 1 sccm Gr-NiTi og c) 4 sccm Gr-NiTi substrater viser, at graphene belægninger føre til bedre sfæriske cellemorfologi af RAECs. Scale bar = 10 um.

Figur 5
Figur 5. A) Fibrinogen / Albumin ratio for uberørt NiTi, Gr-NiTi (1 og 4 sccm prøver). B) Energi niveau diagram for fibrinogen og elektronisk tæthed af stater for graphene viser ligevægt af Fermi-niveau. En elektron overførsel fra fibrinogen til Gr-NiTi er kun muligt fra de besatte elektroniske tilstande for fibrinogenmolekyle til tomme elektroniske tilstande af Gr-NiTi på samme energiniveau. Både enkelt-og få lag graphene er semi-metaller ved stuetemperatur med lav tæthed af stater hos EF hvilket resulterer i en svag (i forhold til bare nitinol) ladningsoverførsel fra fibrinogen til graphene.

Figur 6
Figur 6. Graphene ikke udviser ændringer i G-bånd lineshape eller frekvens angiver fraværet af en ladningsoverførsel fra plasmaproteiner. The deconvoluted toppe opnået fra kurvetilpasning er vist med sort.

Figur 7
Fig. 7. a) graphene overtrukket del af en Cu øre eksponeret for 5% H 2 O 2 forbliver uændret, mens den udækkede del er misfarvet. B) Ingen ændring i G-frekvensbånd blev observeret i vores in situ Raman undersøgelser af Gr- NiTi nedsænket i 70% HNO 3 bekræfter holdbarheden af graphene belægninger. c) etch tid for Cu i CE 100 solvent fordobles når Cu er belagt med graphene (som i Gr-NiTi), der angiver uigennemtrængelighed af graphene membraner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biokompatibilitet og cytotoksicitet: The kemisk dampudfældning (CVD) metode gav polykrystallinske graphene prøver at efterlignede Cu krystalkorn som vist i figur 1a. Vi anvendte Raman spektroskopi for at bekræfte tilstedeværelsen af monolaget (få lag) graphene på 1 sccm (4 sccm) prøver (se figur 1b). Det er klart, 1 SCCM (4 sccm) prøver udviser intens (relativt svagere) G 'band indikerer monolag (få lag) graphene. 1c viser en atomic force mikroskopi (AFM) billede af nogle lag graphene på NiTi substrater. Vores detaljerede målinger gav en værdi på overfladeruhed R q = 5 nm for overførte graphene lag (Gr-NiTi). Det er velkendt, at den nanostrukturerede overfladetopografi kraftigt påvirker celleform og cytoskeletale montering i endotelceller og glatte muskelceller. Disse cellelinier reagerer på de mekaniske påvirkninger ved at ændre deres lipid-dobbeltlagfluiditet, som kan påvirke protein translokation og opførelse af aktivatorer, såsom calcium i celler. Endnu vigtigere er, kan en stigning i cellemembranen stress gradient ændre konformationen og densitet af celleoverfladereceptorer. For at teste indflydelsen af ​​graphene belægning på stress gradienter af celler, studerede vi den glatte muskulatur og endotelceller morfologi med mikroskopi teknikker.

Som vist i figur 2, glat muskelcelle-(SMC) morfologi på uberørt NiTi er ikke-sfærisk. Yderligere er cellerne sparsomt spredt indikerer svag adhæsion af SMC'er til den uberørte NiTi. Tværtimod er SMC'er tæt og sfærisk i Gr-NiTi (både 1 og 4 sccm) overflader svarede til kontrollen. Graphene coating reducerer stress gradienter i cellerne ved at give glattere overflader (fremgår lave R q værdierne som vist i figur 1c) og derfor fører til en bedre cellemorfologi.For at måle cellelevedygtighed og proliferation, udførte vi MTT-assay på SMC'er dyrket på upåvirket og Gr-NiTisubstrates ved 3 og 7 dage tidspunkter. I dette assay er MTT farvestof (gul farve) reduceres til formazanfarvestof (lilla farve) af de aktive reduktase-enzymer og derfor er sunde og prolifererende celler (eller materialets cytotoksicitet) kan kvantificeres ved udførelse af kolorimetriske målinger. Som vist i figur 3a, vi ikke observere eventuelle væsentlige ændringer i giftighed ved Gr-NiTi substrater efter 3 og 7 dage. Disse resultater bekræfter, at graphene overtræk ikke inducerer overskydende toksicitet sammenlignet med uberørte NiTi substrater selv.

At bekræfte virkningerne af graphene coating, udførte vi detaljerede elektronmikroskopi imaging forsøg på rotte-aorta endotelceller (se figur 4). Cellerne på uberørte NiTi substrater er sparsomme og langstrakt, mens de er elliptisk og dEnse på Gr-NiTi substrater. Sådan forbedret cellemorfologi og densiteten blev fundet at være beslægtet med SMC'er bekræfter reduktion af stress-gradienter, som den graphene coating. Yderligere, målte vi graphene coating cytotoksicitet på RAEC hjælp MTS 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-assayet. Begrundelsen for at anvende MTS assay (i stedet for MTT) ligger i dens bedre kompatibilitet med de RAEC vækstmedier og betingelser. Som vist i figur 3b, vores MTS assay på endotelcelle udviste meget god cellelevedygtighed og proliferation bekræfter ingen overskydende toksicitet fra graphene overtræk selv for RAEC. Vigtigere, udviste både 1 og 4 sccm Gr-NiTi ingen væsentlige ændringer i celleproliferation antyder ingen afhængighed af cellens morfologi efter antal graphene lag.

Proteinadsorption og Hemocompatibility: Blodpropper i nærheden af implantatmaterialet has været en af ​​de største hindringer i implantatet teknologi siden 2003. Som tidligere nævnt, implantatmaterialet udløser koagulationskaskaden, når det kommer i kontakt med blod. Samspillet mellem biomedicinske implantat og blod begynder med adsorptionen af plasmaproteiner (serumalbumin, fibrinogen, etc.) På sin overflade. Indledningsvis er meget rigelige proteiner, såsom serumalbumin, flbrinogen, og flbronectin adsorberet men er senere erstattet af faktorer XII og høj molekylvægt kininogen. Forholdet mellem adsorberet flbrinogen og albumin er af afgørende betydning ved bestemmelse af hemocompatibility af biomaterialet. Tidligere et lavt forhold mellem fibrinogen / albumin adsorberes på en biomedicinsk implantatets overflade er blevet korreleret med lav blodplade-adhæsion og thrombusdannelse. 1. Som vist i figur 5a, Gr-NiTi udviser lav fibrinogen / albumin forhold i forhold til uberørt NiTi tyder på bedre hemocompatibility opstår fra graphene. FIB / alb ratificereto var væsentligt lavere for både 1 og 4 sccm Gr-NiTi indikerer, at hemocompatibility af graphene er lag uafhængig.

Det er kendt, at elektronoverførsel fra fibrinogen-molekylet til implantatet er ansvarlig for dannelsen af ​​fibrin som et første skridt til thrombus vækst. Som vist i figur 5b, fibrinogen udviser halvledere som densiteten af elektroniske tilstande eller DOS (betegnet med p (E)) med en energi mellemrum på 1,8 eV. Fermi-niveauer (EF) i fibrinogen og Gr-NiTi ligevægt ved deres grænseflade. En ladning overførsel af en elektron pr fibrinogen er nødvendig for dannelsen af ​​fibrin på uberørt NiTi, og elektronoverførsel fra fibrinogen-molekylet til Gr-NiTi kun er mulig fra de besatte elektroniske tilstande af fibrinogen-molekylet til tomme elektroniske tilstande af Gr-NiTi på samme energiniveau. Både enkelt-og få lag graphene er semi-metaller ved stuetemperatur med en lav p (E) E F. 24 således ladning udveksling strøm fra fibrinogen til graphene er ubetydelig (i forhold til det rene nitinol) på grund af lave værdier af p (E). Denne iboende egenskab ved graphene belægninger er afgørende for at hæmme enhver afgift overførsel fra fibrinogen (og efterfølgende dannelse af blodpropper).

Vi ansat mikro-Raman spektroskopi til at bekræfte, at de ladningsoverførsel dynamikken mellem fibrinogen og Gr-NiTi er virkelig ubetydeligt. Raman-spektrum af graphene udviser flere skarpe træk grund resonansvirkninger. Især den tangentielle bånd (G-bånd) opstår fra den plane vibrationer af carbonatomer og er tidligere blevet fundet at være meget følsomme over for ladningsoverførsel. 25. G-frekvensbånd vides at upshift (downshift), forudsat at enhver acceptor (donor) arter interagerer med graphene via hul (elektron) overførsel. Vigtigere, lineshape af G-band deviates fra en symmetrisk Lorentz til et asymmetrisk Breit-Wigner-Fano (BWF) lineshape grund til at opkræve transfer. 25 Som forventet, vi ikke iagttage en forskydning i G-band frekvens af graphene ved adsorption af fibrinogen bekræfter fravær af ladningsoverførsel mellem Gr-NiTi og fibrinogen (figur 6). En sådan hæmning af ladningsoverførsel og lav fib / ALB-forholdet indikerer god hemocompatibility af graphene belægninger.

Kemisk stabilitet af graphene Coatings: Graphene er kendt for at virke som et beskyttelseslag på grund af dets enestående fysisk-kemiske egenskaber. Dens sp 2 honeycomb gitter giver en naturlig diffusionsbarriere og forhindrer derfor metalion udvaskning fra implantatet materiale. Senest har graphene blevet brugt som en mikroskopisk lufttæt ballon 26 og beskyttende belægning for Cu / Ni. 27 Selv om stabilitet og tæthed af graphene er veldokumenteret i literratur, præsenterer vi vores data relateret til ætsning af en Cu mønt i figur 7 at gentage nytten og levedygtigheden af graphene som implantat belægninger. Som vist i figur 7a, forbliver graphene coatede del af mønten (~ 95% Cu) beskyttet mod oxidation ved udsættelse for H 2 O 2 medens den nøgne region af mønten blev misfarvet ved kontakt med 5% H 2 O 2 (se det forstørrede optiske mikroskop billedet i figur 7a).

At afprøve holdbarheden af ​​graphene belægninger, vi udsat Gr-NiTi substrater til 70% salpetersyre indtil NiTi delvist blev ætset væk. Vores in situ Raman spektroskopi for Gr-NiTi nedsænket i HNO 3 viste ingen ændring i D-og G-bånd af graphene hvilket indebærer, at graphene coating er yderst holdbart (figur 7b). Endvidere har vi fundet, at graphene coating i Gr-NiTi reducerer ætsehastigheden af ​​den underliggende copper som vist i figur 7c.

Som konklusion bekræftede vores detaljerede spektroskopiske målinger manglende ladningsoverførsel mellem graphene og fibrinogen tyder på, at graphene belægning hæmmer blodplade aktivering ved implantater. Derudover reagerer graphene belægninger ikke udviser nogen væsentlig in vitro toksicitet for endothel og glatte muskelceller cellelinjer bekræfter deres biokompatibilitet. Endvidere blev graphene overtræk vist sig at være kemisk inert, hårde og vandtætte i strømmende blod miljø. Den bio-og hemocompatibility af graphene belægninger sammen med dets kemiske inaktivitet, holdbarhed og tæthed gør graphene et unikt materiale til belægning af biomedicinske implantater. Endelig bemærker vi, at vi lykkedes at overføre graphene ark på individuelle NiTi fibre, ved hjælp af hvilken den graphene-belagt mesh kan fremstilles. Vi har også udviklet kemisk eksfolierede graphene ark, der kan direkte centrifugere belagt onto Det maskelignende stents. Desuden viser vores foreløbige eksperimenter, at det faktisk er muligt at dyrke graphene direkte på NiTi legering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium ATCC 30-2002
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma-Aldrich M2128
CellTiter 96 Aqueous One solution cell proliferation assay (MTS) Promega G3582
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
36.5% formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Alexafluor 488 phalloidin Life Technologies A12379
VECTASHIELD mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Human serum albumin Sigma-Aldrich A9511
Human fibrinogen
Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 161-0732
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1158
Acetic acid Sigma-Aldrich 45726
SYPRO Red Life Technologies S-6653
Protein low BCA assay Lamda Biotech G1003
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standard Bio-Rad 161-0375
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Blotting grade blocker non-fat dry milk Bio-Rad 170-6404XTU
Anti-actin antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich A2066
BM Chemiluminescence Western Blotting kit (mouse/rabbit) Roche Applied Science 11520709001
RIPA buffer Sigma-Aldrich R0278
NiTi (51% Ni, 49% Ti) Alfa-Aesar 44953
Equipment
Horiba JobinYvon Raman spectrometer Dilor XY 98
Nikon Confocal microscope Eclipse TI microscope
Thermoscientific Plate reader
Bio-Rad Power supply 164-5050 PowerPac basic power supply
Bio-Rad Electrophoresis cell 165-8004 Mini-PROTEAN tetra cell
Bio-Rad Gel holder cassette 170-3931 Mini gel holder cassette

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, R. K., Lee, K. -R. Biomedical applications of diamond-like carbon coatings: A review. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 83 B (1), 72-84 (2007).
  2. Shah, A. K., Sinha, R. K., Hickok, N. J., Tuan, R. S. High-resolution morphometric analysis of human osteoblastic cell adhesion on clinically relevant orthopedic alloys. Bone. 24 (5), 499-506 (1999).
  3. Huang, N., Yang, P., Leng, Y. X., Chen, J. Y., Sun, H., Wang, J., Wang, G. J., Ding, P. D., Xi, T. F., Leng, Y. Hemocompatibility of titanium oxide films. Biomaterials. 24 (13), 2177-2187 (2003).
  4. Gutensohn, K., Beythien, C., Bau, J., Fenner, T., Grewe, P., Koester, R., Padmanaban, K., Kuehnl, P. In vitro analyses of diamond-like carbon coated stents: Reduction of metal ion release, platelet activation, and thrombogenicity. Thrombosis Research. 99 (6), 577-585 (2000).
  5. Gillespie, W. J., Frampton, C. M. A., Henderson, R. J., Ryan, P. M. The Incidence of Cancer Following Total Hip-Replacement. Journal of Bone and Joint Surgery-British Volume. 70 (4), 539-542 (1988).
  6. Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26 (33), 6547-6557 (2005).
  7. Mikhalovska, L. I., Santin, M., Denyer, S. P., Lloyd, A. W., Teer, D. G., Field, S., Mikhalovsky, S. Fibrinogen adsorption and platelet adhesion to metal and carbon coatings. Thrombosis and Haemostasis. 92 (5), 1032-1039 (2004).
  8. Airoldi, F., Colombo, A., Tavano, D., Stankovic, G., Klugmann, S., Paolillo, V., Bonizzoni, E., Briguori, C., Carlino, M., Montorfano, M., Liistro, F., Castelli, A., Ferrari, A., Sgura, F., Mario, C. D. i Comparison of diamond-like carbon-coated stents versus uncoated stainless steel stents in coronary artery disease. American Journal of Cardiology. 93 (4), 474-477 (2004).
  9. Allen, M., Myer, B., Rushton, N. In vitro and in vivo investigations into the biocompatibility of diamond-like carbon (DLC) coatings for orthopedic applications. Journal of Biomedical Materials Research. 58 (3), 319-328 (2001).
  10. Butter, R., Allen, M., Chandra, L., Lettington, A. H., Rushton, N. In-vitro Studies of DLC Coatings with Silicon Intermediate Layer. Diamond and Related Materials. 4 (5-6), 857-861 (1995).
  11. Dearnaley, G., Arps, J. H. Biomedical applications of diamond-like carbon (DLC) coatings: A review. Surface & Coatings Technology. 200 (7), 2518-2524 (2005).
  12. Dorner-Reisel, A., Schurer, C., Nischan, C., Seidel, O., Muller, E. Diamond-like carbon: alteration of the biological acceptance due to Ca-O incorporation. Thin Solid Films. 420, 263-268 (2002).
  13. Dowling, D. P., Kola, P. V., Donnelly, K., Kelly, T. C., Brumitt, K., Lloyd, L., Eloy, R., Therin, M., Weill, N. Evaluation of diamond-like carbon-coated orthopaedic implants. Diamond and Related Materials. 6 (2-4), 390-393 (1997).
  14. Grill, A. Diamond-like carbon coatings as biocompatible materials - an overview. Diamond and Related Materials. 12 (2), 166-170 (2003).
  15. Hauert, R. A review of modified DLC coatings for biological applications. Diamond and Related Materials. 12 (3-7), 583-589 (2003).
  16. Windecker, S., Mayer, I., De Pasquale, G., Maier, W., Dirsch, O., De Groot, P., Wu, Y. P., Noll, G., Leskosek, B., Meier, B., Hess, O. M. Working Grp Novel Surface, C., Stent coating with titanium-nitride-oxide for reduction of neointimal hyperplasia. Circulation. 104 (8), 928-933 (2001).
  17. Zhang, F., Zheng, Z. H., Chen, Y., Liu, X. G., Chen, A. Q., Jiang, Z. B. In vivo investigation of blood compatibility of titanium oxide films. Journal of Biomedical Materials Research. 42 (1), 128-133 (1998).
  18. Bolz, A., Schaldach, M. Artificial-Heart Valves - Improved Blood Compatibility By PECVD a-SiC-H COATING. Artificial Organs. 14 (4), 260-269 (1990).
  19. Haude, M., Konorza, T. F. M., Kalnins, U., Erglis, A., Saunamaki, K., Glogar, H. D., Grube, E., Gil, R., Serra, A., Richardt, H. G., Sick, P., Erbel, R., Invest, C. T. Heparin-coated stent placement for the treatment of stenoses in small coronary arteries of symptomatic patients. Circulation. 107 (9), 1265-1270 (2003).
  20. Suggs, L. J., Shive, M. S., Garcia, C. A., Anderson, J. M., Mikos, A. G. In vitro cytotoxicity and in vivo biocompatibility of poly(propylene fumarate-co-ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 46 (1), 22-32 (1999).
  21. Clarotti, G., Schue, F., Sledz, J., Benaoumar, A. A., Geckeler, K. E., Orsetti, A., Paleirac, G. Modification of the biocompatible and haemocompatible properties of polymer substrates by plasma-deposited fluorocarbon coatings. Biomaterials. 13 (12), 832-840 (1992).
  22. Gombotz, W. R., Guanghui, W., Horbett, T. A., Hoffman, A. S. Protein adsorption to poly(ethylene oxide) surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (12), 1547-1562 (1991).
  23. Ishihara, K., Fukumoto, K., Iwasaki, Y., Nakabayashi, N. Modification of polysulfone with phospholipid polymer for improvement of the blood compatibility. Part 2. Protein adsorption and platelet adhesion. Biomaterials. 20 (17), 1553-1559 (1999).
  24. Jung, N., Kim, B., Crowther, A. C., Kim, N., Nuckolls, C., Brus, L. Optical Reflectivity and Raman Scattering in Few-Layer-Thick Graphene Highly Doped by K and Rb. ACS Nano. 5 (7), 5708-5716 (2011).
  25. Rao, A. M., Eklund, P. C., Bandow, S., Thess, A., Smalley, R. E. Evidence for charge transfer in doped carbon nanotube bundles from Raman scattering. Nature. 388 (6639), 257-259 (1997).
  26. Bunch, J. S., Verbridge, S. S., Alden, J. S., vander Zande, A. M., Parpia, J. M., Craighead, H. G., McEuen, P. L. Impermeable atomic membranes from graphene sheets. Nano Letters. 8 (8), 2458-2462 (2008).
  27. Chen, S., Brown, L., Levendorf, M., Cai, W., Ju, S. -Y., Edgeworth, J., Li, X., Magnuson, C. W., Velamakanni, A., Piner, R. D., Kang, J., Park, J., Ruoff, R. S. Oxidation Resistance of Graphene-Coated Cu and Cu/Ni Alloy. Acs Nano. 5 (2), 1321-1327 (2011).

Tags

Biomedical Engineering Bioengineering medicin Biofysik Materials Science fysik farmakologi toksikologi Kirurgi Kemi og Materialer (Generelt) graphene biomedicinske implantater overflademodifikation kemisk dampudfældning proteinekspression konfokal mikroskopi implantater stents klinisk
Graphene Maling til biomedicinske implantater
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Podila, R., Moore, T., Alexis, F.,… More

Podila, R., Moore, T., Alexis, F., Rao, A. Graphene Coatings for Biomedical Implants. J. Vis. Exp. (73), e50276, doi:10.3791/50276 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter