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Bioengineering

बायोमेडिकल प्रत्यारोपण के लिए ग्राफीन कोटिंग्स

Published: March 1, 2013 doi: 10.3791/50276
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,4
1Department of Physics, Clemson University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 3Department of Bioengineering, Clemson University, 4Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies, Clemson University

Summary

Graphene जैव चिकित्सा प्रत्यारोपण के लिए एक कोटिंग सामग्री के रूप में क्षमता प्रदान करता है. इस अध्ययन में हम graphene के नैनोमीटर मोटी परतों के साथ कोटिंग nitinol मिश्र धातुओं के लिए एक विधि का प्रदर्शन और निर्धारित कैसे graphene प्रत्यारोपण प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते है.

Abstract

एक सतह कोटिंग रूप में Atomically चिकनी graphene प्रत्यारोपण गुणों में सुधार करने की क्षमता है. यह कोटिंग nitinol मिश्र धातु graphene के नैनोमीटर मोटी परतों साथ एक स्टेंट सामग्री के रूप में आवेदन के लिए के लिए एक तरीका दर्शाता है. Graphene तांबे substrates पर रासायनिक वाष्प जमाव के माध्यम से हो गया था और फिर nitinol substrates पर स्थानांतरित. आदेश में समझने के लिए कैसे graphene कोटिंग जैविक प्रतिक्रिया को बदल सकता है, चूहे महाधमनी endothelial कोशिकाओं और चूहे महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के सेल व्यवहार्यता की जांच की थी. इसके अलावा, कोशिका आसंजन और आकारिकी पर graphene कोटिंग्स के प्रभाव फ्लोरोसेंट confocal माइक्रोस्कोपी के साथ जांच की गई थी. सेल actin और नाभिक के लिए दाग रहे थे, और वहाँ graphene लेपित नमूनों की तुलना में प्राचीन nitinol नमूनों के बीच नजर मतभेद थे. चूहे महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से कुल actin अभिव्यक्ति वेस्टर्न ब्लॉट का उपयोग कर पाया गया था. प्रोटीन सोखना विशेषताओं, संभावित thrombogenicity के लिए एक सूचक है, wअरे जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ सीरम albumin और फाइब्रिनोजेन के लिए निर्धारित है. इसके अलावा, नि फाइब्रिनोजेन से सब्सट्रेट करने के लिए स्थानांतरण रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए deduced किया गया था. यह पाया गया कि nitinol substrates पर graphene कोटिंग एक स्टेंट सामग्री के लिए कार्यात्मक आवश्यकताओं से मुलाकात की और uncoated nitinol की तुलना में जैविक प्रतिक्रिया में सुधार. इस प्रकार, graphene लेपित nitinol एक स्टेंट सामग्री के लिए एक व्यवहार्य उम्मीदवार है.

Introduction

पिछले तीन दशकों उपन्यास सामग्री आधारित चिकित्सा और रोग के उपचार और निदान के लिए उपकरणों की खोज देखा है. Nitinol (NiTi) और स्टेनलेस स्टील के रूप में उपन्यास मिश्र धातु सामग्री अक्सर जैव चिकित्सा प्रत्यारोपण उनके बेहतर यांत्रिक गुणों के कारण निर्माण में उपयोग किया जाता है 1-3 हालांकि, कई चुनौतियों exogenous सामग्री cytotoxicity के कारण बने हुए हैं, जैव और hemo संगतता. इन धातुओं के परिणाम की धातु में प्रकृति गरीब जैव और धातु leaching, कोशिका आसंजन की कमी, प्रसार, और घनास्त्रता जब यह खून बह (जैसे कैथेटर, रक्त वाहिका grafts, संवहनी stents, कृत्रिम हृदय वाल्व के साथ संपर्क में आता है के कारण hemocompatibility आदि.) 1, 4, 5 प्रोटीन या सतह प्रत्यारोपण के साथ जीवित कोशिकाओं की बातचीत एक मजबूत प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रतिक्रिया और जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का आगामी झरना करने के लिए नेतृत्व के प्रतिकूल उपकरण की कार्यक्षमता को प्रभावित कर सकते हैं कर सकते हैं. इसलिए, यह pertin हैजैव चिकित्सा प्रत्यारोपण और उसके आसपास के जैविक वातावरण के बीच बातचीत पर नियंत्रण प्राप्त करने के ईएनटी. सतह संशोधन अक्सर कम करने या प्रतिकूल शारीरिक प्रत्यारोपण सामग्री से प्रारंभिक प्रतिक्रिया को रोकने के लिए कार्यरत है. एक आदर्श सतह कोटिंग उच्च आसंजन ताकत, रासायनिक निष्क्रियता, उच्च चिकनाई, और अच्छा hemo और biocompatibility की उम्मीद है. इससे पहले, हीरे की तरह कार्बन (DLC), इस प्रकार, टिन, TiO 2 और कई बहुलक सामग्री सहित कई सामग्री जैव संगत प्रत्यारोपण सतह कोटिंग्स के रूप में परीक्षण किया गया है 1, 6-23 हालांकि, इन सामग्रियों अब भी कर रहे हैं के सभी को पूरा करने में असमर्थ एक उपयुक्त प्रत्यारोपण सतह कोटिंग के लिए कार्यात्मक मापदंड.

सपा 2 कार्बन, graphene के रूप में जाना जाता है, की मोटी परत के परमाणु खोज उपन्यास multifunctional सामग्री के विकास के लिए दरवाजे खोल दिया है. ग्राफीन के बाद से यह सतह प्रत्यारोपण कोटिंग के लिए एक आदर्श उम्मीदवार होने की उम्मीद हैरासायनिक आभ्यांतरिक, atomically चिकनी और बेहद टिकाऊ है. इस पत्र में, हम जैव चिकित्सा प्रत्यारोपण के लिए एक सतह कोटिंग के रूप में graphene की व्यवहार्यता की जांच. हमारे अध्ययन से पता चलता है कि graphene लेपित nitinol (जीआर NiTi) कार्यात्मक मापदंड को पूरा करता है, और इसके अलावा उत्कृष्ट चिकनी मांसपेशियों और endothelial सेल बेहतर सेल प्रसार करने के लिए अग्रणी विकास का समर्थन करता है. हम यह भी पाते हैं कि जीआर NiTi पर सीरम albumin सोखना फाइब्रिनोजेन की तुलना में अधिक है. महत्वपूर्ण बात है, (i) हमारे विस्तृत स्पेक्ट्रोस्कोपी माप graphene और फाइब्रिनोजेन सुझाव है कि graphene कोटिंग के बीच चार्ज हस्तांतरण की कमी की पुष्टि प्रत्यारोपण द्वारा प्लेटलेट सक्रियण रोकता है, (ii) graphene कोटिंग्स endothelial और चिकनी पेशी सेल लाइनों की पुष्टि के लिए किसी भी महत्वपूर्ण प्रदर्शन नहीं इन विट्रो विषाक्तता में उनके biocompatibility, और (iii) graphene रासायनिक आभ्यांतरिक, टिकाऊ और रक्त पर्यावरण बह में अभेद्य कोटिंग्स हैं. इन hemo और उच्च सेंट के साथ साथ biocompatible गुण,rength, रासायनिक निष्क्रियता और स्थायित्व, एक आदर्श सतह कोटिंग के रूप में graphene कोटिंग्स प्रस्तुत करना.

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Protocol

1. NiTi ग्राफीन कोटिंग

  1. इस अध्ययन में इस्तेमाल graphene नमूने) तांबा (Cu substrates रासायनिक वाष्प जमाव तकनीक का उपयोग पर बड़े हो रहे थे, और बाद में 4.5 मिमी 2 NiTi substrates को हस्तांतरित.
  2. घन foils (1 सेमी एक्स 1 सेमी) में 1 क्वार्ट्ज ट्यूब भट्ठी के अंदर रखा गया है और 1000 के लिए गरम ° C 2 एच के 50 SCCM और एर के 450 SCCM की उपस्थिति में.
  3. अगले मीथेन (1 और 4 SCCM) भट्ठी में 20-30 मिनट के लिए अलग प्रवाह दरों पर पेश किया गया था. नमूने अंत में 2 एच, एर और 4 CH तैरल पदार्थ की तरह बहता हुआ के तहत कमरे के तापमान पर ठंडा.
  4. अगला, घन foils PMMA (4% Anisole के साथ पतला) के साथ स्पिन लेपित 150 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए गर्मी उपचार द्वारा 4,000 बाद rpm पर थे PMMA परत से जुड़ी ग्राफीन घन पन्नी का उपयोग कर, CE-100 etchant Transene इंक, और बाद में 10 मिनट के लिए 10% एचसीएल और de-ionized पानी में rinsing नक़्क़ाशी द्वारा प्राप्त किया गया था.
  5. एसamples NiTi substrates (4.5 2 मिमी) को स्थानांतरित कर दिया गया और 450 पर annealed ° गिरफ्तारी में सी (300 SCCM) और एच 2 घंटे के लिए (700 SCCM) 2 PMMA को दूर करने के लिए. अंत में, के substrates एसीटोन के साथ धोया गया अवशिष्ट PMMA भंग जीआर - NiTi नमूना प्राप्त करने के. एक DILOR XY ट्रिपल झंझरी monochromator एक ar + आयन लेजर से 514.5 एनएम उत्तेजना के साथ सभी जीआर NiTisamples सूक्ष्म रमन लक्षण वर्णन (100X उद्देश्य का उपयोग) के लिए इस्तेमाल किया गया था.

2 जीआर NiTi में इन विट्रो विषाक्तता

चूहा महाधमनी endothelial कोशिकाओं (सेल आवेदन इंक) एक जेलाटीन लेपित 8 कक्षों स्लाइड पर सुसंस्कृत थे. सेल के विकास, प्राचीन परीक्षण और जीआर NiTisubstrates कुओं में किसी भी जेलाटीन कोटिंग के बिना रखा गया. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों एक Hitachi SEM S-4800 का उपयोग कर प्राप्त किया गया. इसके अतिरिक्त, चूहा महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं भी CellBind में बड़े हो रहे थे Du में एक नियंत्रण समूह (Corning) के रूप में 96 अच्छी तरह प्लेटेंlbecco संशोधित ईगल मध्यम (ATCC).

  1. सेल व्यवहार्यता परीक्षण के लिए, कोशिकाओं (दोनों endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं) / 10 5 कोशिकाओं को प्राचीन NiTi, 1 SCCM या 4 SCCM जीआर NiTi substrates, जहां कहा SCCM मीथेन में इस्तेमाल प्रवाह से मेल खाती है युक्त कुओं में अच्छी तरह से वरीयता प्राप्त किया गया सीवीडी graphene की वृद्धि हुई है. कोशिकाओं वांछित समय अवधि के लिए एक मशीन में 37 में बड़े हो रहे थे डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2, मीडिया हर दूसरे दिन का आदान प्रदान.
  2. अंत समय बिंदु पर, मीडिया हटाया गया था और नए सिरे से 0.5 मिलीग्राम / एमएल thiazolyl नीले tetrazolium ब्रोमाइड (या सिग्मा से प्राप्त MTT) युक्त मीडिया एक अच्छी तरह से जोड़ा गया है. कोशिकाओं तो एक अतिरिक्त 3 घंटे के लिए incubated रहे थे. टन परख के लिए, मीडिया अंतिम समय बिंदु पर हटा दिया गया था और टन काम (सेल टीयर 96 जलीय, PROMEGA) समाधान और 3 घंटे के लिए incubated के 120 μl के साथ बदल दिया.
  3. अगला, मीडिया और धीरे हटा दिया गया था dimethylsulfoxide के 100 मिलीलीटर (सिग्मा) एक अच्छी तरह से जोड़ा गया है. Allo के बादविंग MTT क्रिस्टल को भंग करने के लिए 10 मिनट, समाधान के लिए एक और अच्छी तरह से थाली के लिए स्थानांतरित किया गया था. टन परख के लिए, कोई dimethylsulfoxide कुओं को जोड़ा गया है. खैर सामग्री एक नई प्लेट के लिए चले गए थे.
  4. Absorbance 490 एनएम पर पढ़ा था और प्रतिशत व्यवहार्यता प्राचीन NiTi नमूना की औसत absorbance absorbance सामान्य से निर्धारित किया गया था. प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए कम से कम पांच दोहराता किया गया.

3. सेल आकारिकी Confocal माइक्रोस्कोपी अध्ययन

  1. चूहे महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के confocal इमेजिंग के लिए substrates एक स्लाइड 8 चैम्बर (थर्मो वैज्ञानिक) में रखा गया है. कोशिकाओं 25,000 कोशिकाओं / चैंबर में वरीयता प्राप्त किए गए थे और 37 में 3 दिनों के लिए incubated डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  2. सेल सब्सट्रेट पर फॉस्फेट में 4% formaldehyde के साथ तय किया गया 20 मिनट के लिए खारा buffered.
  3. 1 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन-X के साथ Permeabilized.
  4. Actin Alexa Fluor 488 phalloidin (Lif सना हुआ थाई टेक्नोलॉजीज). मेथनॉल में 200 इकाइयों / मिलीलीटर में 100 μl 488 phalloidin alexafluor की फॉस्फेट की 1.9 मिलीलीटर जोड़ा था खारा buffered. सेल 488 phalloidin alexafluor 45 मिनट के लिए 250 μl के साथ दाग थे और फिर दो बार धोया के साथ फास्फेट खारा buffered.
  5. नाभिक VectaShield फ्लोरोसेंट बढ़ते DAPI (वेक्टर प्रयोगशालाओं) युक्त मध्यम के साथ बढ़ रहे थे. Confocal छवियों एक Nikon Confocal तिवारी का उपयोग कर एकत्र किए गए. एक किसी भी सब्सट्रेट बिना कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त चैम्बर एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था.

4. प्रोटीन सोखना अध्ययन

  1. सब्सट्रेट आयाम प्रोटीन सोखना प्रयोगों के शुरू करने से पहले नली का व्यास के साथ मापा गया. तीन माप लगभग वर्ग नमूने के प्रत्येक पक्ष के लिए ले जाया गया और औसत लंबाई और चौड़ाई.
  2. प्रत्येक नमूना, प्राचीन NiTi 1sccm, और जीआर NiTiwere 4sccm 1 मिलीग्राम / फॉस्फेट में albumin मिलीलीटर के साथ incubated खारा (पीबीएस) या 1 मिलीग्राम / एमएल फाइब्रिनोजेन कमरा टी पीबीएस में buffered3 घंटे के लिए emperature.
  3. एक जैसे नमूने एक microcentrifuge ट्यूब में नमूना बफर को कम करने के 200 μl के साथ संयुक्त थे और 5 मिनट के लिए उबला हुआ.
  4. नमूने तो एक Tris / / Glycine एसडीएस बफर (जैव रेड) में थे पतला और 100 मिनट के लिए 90 वी में 4-15% Tris polyacrylamide वैद्युतकणसंचलन जेल (जैव रेड) के माध्यम से चलाने के.
  5. जैल तो SYPRO लाल के साथ दाग थे. SYPRO रेड (जीवन टेक्नोलॉजीज) 1:5,000 में 7.5% v / v एसिटिक एसिड में स्टॉक समाधान पतला. 60 मिनट के लिए जैल दाग.
  6. छवि एक Flourchem सपा (अल्फा Innotech) फ्लोरोसेंट तीव्रता का उपयोग जैल. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया गया था. प्रत्येक नमूना से फ्लोरोसेंट तीव्रता सब्सट्रेट के कुल क्षेत्र द्वारा सामान्यीकृत था और फाइब्रिनोजेन सोखना albumin सोखना की तुलना में किया गया था.

5. पश्चिमी प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सोख्ता

  1. वेस्टर्न ब्लॉट चूहे महाधमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में कुल actin का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन किया था. सेल 10,000 कोशिकाओं / सब्सट्रेट पर एक 96-w में वरीयता प्राप्त किया गयापक्ष थाली.
  2. कोशिकाओं मीडिया हटाने से पहले तीन दिनों के लिए हो गया है. कुल प्रोटीन RIPA बफर और एक मानक बीसीए परख (Lamda) कुल प्रोटीन यों प्रदर्शन किया गया था का उपयोग कर निकाला गया था.
  3. नमूने RIPA में एक ही एकाग्रता को पतला किया गया और फिर एक कम 5 मिनट के लिए नमूना बफर में उबला हुआ.
  4. प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से एक 4-15% Tris polyacrylamide जेल से 100 मिनट के लिए 90 वी में अलग हो गए थे. एक बहुरूपदर्शक प्रोटीन मानक (जैव रेड) करने के लिए प्रोटीन आणविक भार का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  5. प्रोटीन एक PVDF झिल्ली को स्थानांतरित कर दिया गया और एक 1% गैर वसा सूखा दूध समाधान (जैव रेड) के साथ अवरुद्ध.
  6. कुल actin एक खरगोश विरोधी चूहा actin एंटीबॉडी (सिग्मा) के साथ टैग किया गया था. एक बी.एम. chemiluminescent किट (Roche) प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. झिल्ली FlourChem सपा इमेजिंग उपकरण का उपयोग कर और फ्लोरोसेंट तीव्रता ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा गया था imaged थे. फ्लोरोसेंट तीव्रता प्राथमिक करने के लिए की तुलना द्वारा सामान्यीकृत थाStine NiTisample.

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Representative Results

चित्रा 1
10 सुक्ष्ममापी): चित्रा 1) बड़े हो सीवीडी घन foils पर polycrystalline graphene धातु क्रिस्टल अनाज (पैमाने बार mimics. ख) 1 (4 SCCM) SCCM graphene के रमन तीव्र (अपेक्षाकृत कमजोर) 'जी स्पेक्ट्रम बैंड का संकेत monolayer (कुछ परत) के रूप में तैयार graphene की प्रकृति को दर्शाता है. ग) NiTi पर स्थानांतरित graphene AFM छवि ~ 5 एनएम के एक खुरदरापन से पता चलता है. पैमाने बार = 500 एनएम.

चित्रा 2
चित्रा 2) नियंत्रण गिलास स्लाइड पर हो एसएमसी लिए ऑप्टिकल छवियों Confocal माइक्रोस्कोपी, ख) प्राचीन NiTi, ग) 1 SCCM जीआर NiTi और घ) 4 SCCM जीआर NiTi substrates (पैमाने बार: 50 सुक्ष्ममापी).


चित्रा 3.) MTT परख से पता चलता है कि जीआर NiTi substrates (1 और 4 SCCM) एसएमसी प्राचीन NiTi सापेक्ष सेल व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण अंतर). टन परख से पता चलता है कि 3 दिन RAECs के लिए सेल व्यवहार्यता काफी नहीं था प्रदर्शन नहीं करते नियंत्रण की तुलना में अलग है.

चित्रा 4
चित्रा 4) प्राचीन NiTi ख, हो RAECs के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों स्कैनिंग) 1 SCCM जीआर NiTi और ग) 4 SCCM जीआर NiTi substrates शो कि graphene कोटिंग्स बेहतर गोलाकार RAECs सेल आकारिकी नेतृत्व. पैमाने बार = 10 सुक्ष्ममापी.

चित्रा 5
चित्रा 5एक) प्राचीन NiTi, जीआर NiTi (1 और 4 SCCM के नमूने) के लिए अनुपात / फाइब्रिनोजन Albumin ख) और फाइब्रिनोजेन फर्मी स्तर के संतुलन दिखा graphene के लिए राज्यों के इलेक्ट्रॉनिक घनत्व के लिए ऊर्जा स्तर आरेख. फाइब्रिनोजेन से जीआर NiTi एक इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण केवल वही ऊर्जा स्तर पर खाली इलेक्ट्रॉनिक जीआर NiTi के राज्यों में फाइब्रिनोजेन अणु के कब्जे इलेक्ट्रॉनिक राज्यों से संभव है. दोनों एकल और कुछ परत graphene कमरे के तापमान पर अर्द्ध धातुओं एफई में राज्यों के कम घनत्व जो एक कमजोर (रूप में नंगे nitinol तुलना) प्रभारी फाइब्रिनोजेन से graphene हस्तांतरण में परिणाम के साथ कर रहे हैं.

चित्रा 6
चित्रा 6 ग्राफीन जी बैंड lineshape या प्लाज्मा प्रोटीन से किसी भी चार्ज हस्तांतरण के अभाव का संकेत आवृत्ति में कोई परिवर्तन नहीं प्रदर्शित करती है. deconvoluटेड चोटियों वक्र ढाले से प्राप्त काले रंग में दिखाया जाता है.

7 चित्रा
चित्रा 7) एक घन पैसे का ग्राफीन लेपित हिस्सा 5% करने के लिए अवगत कराया एच 2 2 हे अपरिवर्तित रहता है जबकि खुला हिस्सा फीका पड़ा हुआ है ख) जी बैंड आवृत्ति में कोई परिवर्तन नहीं हमारे बगल रमन अध्ययन में मनाया गया. जीआर NiTi HNO 70% में डूबे 3 graphene कोटिंग्स के स्थायित्व की पुष्टि ग) में CE विलायक 100 घन के लिए खोदना समय जब घन (जीआर NiTi में) graphene graphene झिल्ली के अछिद्रता संकेत के साथ लेपित है दोगुनी है.

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Discussion

Biocompatibility और cytotoxicity: रासायनिक वाष्प (सीवीडी) बयान विधि polycrystalline नमूनों है graphene है कि घन क्रिस्टल अनाज, के रूप में चित्र 1a में दिखाया मजाक उड़ाया झुकेंगे. हम रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी कार्यरत 1 SCCM (4 SCCM) नमूने (चित्रा 1b देखें) पर monolayer graphene (कुछ परत) की उपस्थिति की पुष्टि की है. जाहिर है, 1 SCCM नमूने (4 SCCM) प्रदर्शन तीव्र (अपेक्षाकृत कमजोर) 'जी monolayer का संकेत बैंड (कुछ परत) graphene चित्रा -1 सी NiTi substrates पर कुछ परत graphene के एक परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी छवि (AFM) से पता चलता है. हमारे विस्तृत माप सतह खुरदरापन की एक मूल्य मिले R q = हस्तांतरित graphene परतों के लिए 5 एनएम (जीआर NiTi). यह सर्वविदित है कि nanostructured सतह स्थलाकृति दृढ़ता सेल और endothelial कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में cytoskeletal विधानसभा आकार को प्रभावित करता है. ये सेल लाइनों को अपने लिपिड bilayer बदलने के द्वारा यांत्रिक तनाव के जवाबतरलता है, जो प्रतिकूल प्रोटीन स्थानान्तरण और कोशिकाओं में कैल्शियम के रूप में activators की प्रविष्टि को प्रभावित कर सकता है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, कोशिका झिल्ली तनाव ढाल में वृद्धि हुई है और कोशिका की सतह रिसेप्टर्स की रचना घनत्व बदल सकते हैं. कोशिकाओं के तनाव gradients पर graphene कोटिंग के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए आदेश में, हम चिकनी मांसपेशियों और endothelial माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग करते हुए सेल आकारिकी का अध्ययन किया.

चित्रा 2, चिकनी प्राचीन NiTi पर पेशी सेल आकारिकी (एसएमसी) में दिखाया गैर गोलाकार है. इसके अलावा, कोशिकाओं को कम प्राचीन NiTi एसएमसी के कमजोर आसंजन का संकेत फैले हुए हैं. इसके विपरीत, एसएमसी (दोनों 1 और 4 SCCM) जीआर NiTi नियंत्रित करने के लिए इसी तरह की सतहों पर घने और गोलाकार हैं. ग्राफीन कोटिंग कोशिकाओं में चिकनी (कम आर क्ष चित्र -1 सी में दिखाया मूल्यों से स्पष्ट) सतहों और इसलिए एक बेहतर सेल आकारिकी में परिणाम उपलब्ध कराने के द्वारा तनाव gradients कम कर देता है.आदेश में सेल व्यवहार्यता और प्रसार को मापने के लिए, हम 3 प्राचीन और जीआर NiTisubstrates पर हो एसएमसी और 7 दिन का समय अंक पर MTT परख प्रदर्शन किया. इस परख में, MTT डाई (पीले रंग) formazan डाई (बैंगनी रंग) में सक्रिय reductase एंजाइमों से कम है और इसलिए स्वस्थ और proliferating कोशिकाओं (या सामग्री cytotoxicity) वर्णमिति माप प्रदर्शन द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. चित्रा 3a में दिखाया गया है, हम 3 और 7 दिनों के बाद जीआर NiTi substrates के लिए किसी भी विषाक्तता में महत्वपूर्ण परिवर्तन का पालन नहीं किया था. इन परिणामों की पुष्टि है कि graphene कोटिंग्स प्राचीन NiTi substrates खुद की तुलना में अतिरिक्त विषाक्तता प्रेरित नहीं करते.

Graphene कोटिंग के प्रभाव reconfirm, हम चूहे महाधमनी endothelial कोशिकाओं (4 चित्र देखें) पर विस्तृत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग प्रयोगों का प्रदर्शन किया. प्राचीन NiTi substrates पर कोशिकाओं विरल और लम्बी हैं, जबकि वे ellipsoidal और विकास कर रहे हैंजीआर NiTi substrates पर ense. इस तरह के सुधार सेल आकारिकी और घनत्व करने के तनाव graphene कोटिंग के द्वारा प्रदान gradients में कमी की पुष्टि एसएमसी जैसा होना पाया गया था. इसके अलावा, हम 3 लाख टन का उपयोग RAEC graphene कोटिंग cytotoxicity मापा (4,5 - dimethylthiazol-2-YL) -5 - (3 - carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfophenyl) 2H - tetrazolium परख. टन परख (बजाय MTT) का उपयोग करने के लिए तर्क RAEC विकास मीडिया और शर्तों के साथ बेहतर संगतता में निहित है. के रूप में चित्रा 3b में दिखाया गया, हमारे टन endothelial सेल पर परख बहुत अच्छा सेल व्यवहार्यता और प्रसार RAEC लिए भी graphene कोटिंग्स से कोई अतिरिक्त विषाक्तता की पुष्टि का प्रदर्शन किया. महत्वपूर्ण बात है, दोनों 1 और 4 जीआर NiTi SCCM graphene परतों की संख्या पर सेल प्रसार में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन सेल आकारिकी का कोई निर्भरता का सुझाव दे प्रदर्शन किया.

प्रोटीन सोखना और Hemocompatibility प्रत्यारोपण सामग्री हेक्टेयर के आसपास के क्षेत्र में रक्त के थक्के2003 के बाद से एक प्रत्यारोपण प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में एक प्रमुख बाधा है. जैसा कि पहले उल्लेख किया है, प्रत्यारोपण सामग्री जमावट झरना से चलाता है जब यह खून के साथ संपर्क में आता है. जैव चिकित्सा प्रत्यारोपण और रक्त के बीच बातचीत इसकी सतह पर प्लाज्मा प्रोटीन सोखना (सीरम albumin, फाइब्रिनोजेन, आदि) के साथ शुरू होता है. प्रारंभ में, सीरम albumin flbrinogen, और flbronectin जैसे अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन adsorbed कर रहे हैं, लेकिन बाद में कारकों बारहवीं और उच्च आणविक भार kininogen द्वारा प्रतिस्थापित. adsorbed flbrinogen और albumin के अनुपात biomaterial की hemocompatibility के निर्धारण में महत्वपूर्ण है. इससे पहले, / एक बायोमेडिकल प्रत्यारोपण सतह पर adsorbed फाइब्रिनोजेन albumin की एक कम अनुपात कम प्लेटलेट आसंजन और thrombus गठन के साथ सहसंबद्ध किया गया है 1. रूप में चित्रा 5a में दिखाया, जीआर NiTi प्रदर्शनी कम / फाइब्रिनोजेन albumin प्राचीन बेहतर उत्पन्न होने वाली hemocompatibility सुझाव NiTi के सापेक्ष अनुपात graphene से. मिथ्या / जुब्बा रतिओ दोनों 1 और 4 जीआर NiTi SCCM के लिए काफी कम था, यह दर्शाता है कि graphene के hemocompatibility परत स्वतंत्र है.

यह ज्ञात है कि फाइब्रिनोजेन अणु से समाविष्ट करने के लिए इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण thrombus विकास के लिए पहले कदम के रूप में आतंच के गठन के लिए जिम्मेदार है. रूप में चित्रा 5b में दिखाया गया, फाइब्रिनोजेन घनत्व 1.8 eV की एक ऊर्जा अंतराल के साथ इलेक्ट्रॉनिक राज्यों या डॉस (पी (ई) में निरूपित) की तरह अर्द्ध कंडक्टर दर्शाती है. फाइब्रिनोजेन और जीआर NiTi फर्मी स्तर (एफई) अपने इंटरफेस पर संतुलन में लाना. फाइब्रिनोजेन प्रति एक इलेक्ट्रॉन के एक चार्ज हस्तांतरण प्राचीन NiTi पर आतंच के गठन और जीआर NiTi में फाइब्रिनोजेन अणु से इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण के लिए आवश्यक है जीआर NiTi खाली इलेक्ट्रॉनिक राज्यों में फाइब्रिनोजेन अणु के कब्जे इलेक्ट्रॉनिक राज्यों से ही संभव है वही ऊर्जा स्तर पर. दोनों एकल और कुछ परत graphene कमरे के तापमान पर अर्द्ध धातु एक कम पी (ई) के साथ कर रहे हैं ई एफ के आसपास के क्षेत्र में. 24 इस प्रकार, प्रभारी graphene के लिए फाइब्रिनोजेन से मौजूदा विनिमय नगण्य है (रूप में नंगे nitinol तुलना) पी के मूल्यों को कम (ई) के कारण. Graphene कोटिंग्स के इस आंतरिक संपत्ति बाधा फाइब्रिनोजेन से किसी भी चार्ज हस्तांतरण (और बाद रक्त के थक्के) के लिए महत्वपूर्ण है.

हम सूक्ष्म रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी कार्यरत पुष्टि करते हैं कि फाइब्रिनोजेन और जीआर NiTi के बीच चार्ज हस्तांतरण गतिशीलता वास्तव में नगण्य है. Graphene के रमन स्पेक्ट्रम कई तेज गूंज प्रभाव के कारण सुविधाओं दर्शाती है. विशेष रूप से, स्पर्शरेखा बैंड (G-बैंड) कार्बन परमाणुओं के planar कंपन से उठता है और पहले से बेहद संवेदनशील होने को हस्तांतरण चार्ज पाया upshift 25 जी बैंड आवृत्ति (downshift) के लिए जाना जाता है जब किसी भी स्वीकर्ता प्रजातियों (दाता). छेद हस्तांतरण (इलेक्ट्रॉन) के माध्यम से graphene के साथ सूचना का आदान प्रदान. महत्वपूर्ण बात है, जी बैंड देव के lineshapeएक सममित Lorentzian से एक असममित Breit Wigner-Fano (BWF) चार्ज को हस्तांतरण के कारण lineshape iates. 25 के रूप में की उम्मीद है, हम जी बैंड graphene की आवृत्ति में सोखना पर फाइब्रिनोजेन का चार्ज हस्तांतरण की अनुपस्थिति की पुष्टि बदलाव का पालन नहीं किया था जीआर NiTi और फाइब्रिनोजेन (6 चित्रा) के बीच. चार्ज हस्तांतरण और कम अनुपात / मिथ्या जुब्बा के इस तरह के निषेध graphene कोटिंग्स के अच्छा hemocompatibility संकेत मिलता है.

ग्राफीन कोटिंग्स रासायनिक निष्क्रियता: ग्राफीन अपनी अनूठी भौतिक गुणों के कारण एक सुरक्षा परत के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है. इसकी सपा 2 मधुकोश जाली एक प्राकृतिक प्रसार बाधा प्रदान करता है और इसलिए प्रत्यारोपण सामग्री से धातु आयन leaching रोकता है. हाल ही में, graphene एक सूक्ष्म airtight 26 / घन नी के लिए सुरक्षात्मक कोटिंग के गुब्बारे के रूप में इस्तेमाल किया गया है 27 हालांकि स्थिरता और graphene के अछिद्रता लीटर में प्रलेखित रहे हैं.ature, हम हमारे 7 चित्रा में एक घन सिक्के के नक़्क़ाशी graphene के उपयोगिता और प्रत्यारोपण कोटिंग्स के रूप में व्यवहार्यता दोहराना संबंधित आंकड़ों को प्रस्तुत करते हैं. चित्रा 7a में दिखाया गया है, सिक्का (~ 95% घन) के graphene लेपित भाग ऑक्सीकरण से सुरक्षित रहता है, जब 2 एच उजागर 2 हे जबकि सिक्के के नंगे क्षेत्र संपर्क पर फीका पड़ा हुआ 5% एच 2 2 हे (देखें के साथ बन गया चित्रा 7a में बढ़ाया ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप छवि).

Graphene कोटिंग्स के स्थायित्व का परीक्षण करने के लिए, हम 70% नाइट्रिक एसिड जीआर NiTi substrates उजागर जब तक NiTi आंशिक रूप से दूर etched था. हमारे जीआर NiTi स्वस्थानी रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी HNO 3 में डूबे में डी और जिसका अर्थ है है कि graphene कोटिंग बेहद टिकाऊ (चित्रा 7b) है graphene के जी बैंड में कोई परिवर्तन नहीं दिखाई. इसके अलावा, हमने पाया है कि जीआर NiTi में graphene कोटिंग अंतर्निहित coppe के खोदना दर को कम कर देता हैआर के रूप में 7c चित्र में दिखाया गया है.

अंत में, हमारे विस्तृत स्पेक्ट्रोस्कोपी माप graphene और सुझाव है कि graphene कोटिंग प्रत्यारोपण द्वारा प्लेटलेट सक्रियण रोकता फाइब्रिनोजेन के बीच चार्ज हस्तांतरण की कमी की पुष्टि की. इसके अतिरिक्त, graphene कोटिंग्स endothelial और चिकनी पेशी सेल लाइनों उनके biocompatibility की पुष्टि के लिए किसी भी महत्वपूर्ण प्रदर्शन नहीं इन विट्रो विषाक्तता में. इसके अलावा, graphene कोटिंग्स रक्त वातावरण बह में रासायनिक आभ्यांतरिक, टिकाऊ और अभेद्य हो पाए गए. जैव और अपने रासायनिक निष्क्रियता के साथ साथ graphene कोटिंग्स के hemocompatibility, स्थायित्व और अछिद्रता graphene कोटिंग जैव चिकित्सा प्रत्यारोपण के लिए एक अद्वितीय सामग्री बनाने. अन्त में, हम ध्यान दें कि हम व्यक्तिगत NiTi फाइबर पर graphene चादरों को स्थानांतरित करने में सफल रहा है, जो graphene लेपित जाल निर्मित किया जा सकता है. हम भी रासायनिक exfoliated graphene चादरें कि सीधे लेपित ont स्पिन कर सकते हैं विकसित किया हैजाल की तरह stents ओ. इसके अलावा, हमारी प्रारंभिक प्रयोगों चलता है कि यह संभव है वास्तव NiTi मिश्र धातु पर सीधे graphene बढ़ने.

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Disclosures

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium ATCC 30-2002
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma-Aldrich M2128
CellTiter 96 Aqueous One solution cell proliferation assay (MTS) Promega G3582
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
36.5% formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Alexafluor 488 phalloidin Life Technologies A12379
VECTASHIELD mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Human serum albumin Sigma-Aldrich A9511
Human fibrinogen
Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 161-0732
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1158
Acetic acid Sigma-Aldrich 45726
SYPRO Red Life Technologies S-6653
Protein low BCA assay Lamda Biotech G1003
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standard Bio-Rad 161-0375
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Blotting grade blocker non-fat dry milk Bio-Rad 170-6404XTU
Anti-actin antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich A2066
BM Chemiluminescence Western Blotting kit (mouse/rabbit) Roche Applied Science 11520709001
RIPA buffer Sigma-Aldrich R0278
NiTi (51% Ni, 49% Ti) Alfa-Aesar 44953
Equipment
Horiba JobinYvon Raman spectrometer Dilor XY 98
Nikon Confocal microscope Eclipse TI microscope
Thermoscientific Plate reader
Bio-Rad Power supply 164-5050 PowerPac basic power supply
Bio-Rad Electrophoresis cell 165-8004 Mini-PROTEAN tetra cell
Bio-Rad Gel holder cassette 170-3931 Mini gel holder cassette

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References

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Podila, R., Moore, T., Alexis, F., Rao, A. Graphene Coatings for Biomedical Implants. J. Vis. Exp. (73), e50276, doi:10.3791/50276 (2013).

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