Summary
Grafene offre potenziale come materiale di rivestimento per protesi biomedicali. In questo studio si dimostra un metodo per il rivestimento di leghe in nitinol con strati di grafene nanometri di spessore e di determinare il modo in grafene possono influenzare la risposta dell'impianto.
Abstract
Grafene atomico liscio come un rivestimento di superficie ha il potenziale per migliorare le proprietà degli impianti. Questo viene illustrato un metodo per il rivestimento di leghe di nitinol con strati spessi nanometri di grafene per applicazioni come materiale stent. Grafene è stato coltivato su substrati di rame attraverso la deposizione di vapore chimico e quindi trasferita su substrati nitinol. Per comprendere come il rivestimento grafene potrebbe cambiare risposta biologica, vitalità cellulare delle cellule endoteliali aortiche ratto e topo cellule muscolari lisce aortiche stato studiato. Inoltre, l'effetto di grafene rivestimenti su adesione cellulare e la morfologia è stato esaminato con microscopia confocale a fluorescenza. Le cellule sono state colorate per actina e nuclei, e c'erano differenze notevoli tra incontaminate campioni nitinol rispetto al grafene rivestite campioni. Espressione di actina totale da ratto cellule muscolari lisce dell'aorta è stato trovato con Western Blot. Proteine caratteristiche di adsorbimento, un indicatore per trombogenicità potenziale, were determinata per il fibrinogeno albumina sierica e con elettroforesi su gel. Inoltre, il trasferimento di carica dal fibrinogeno al substrato è stata dedotta mediante spettroscopia Raman. Si è constatato che il rivestimento grafene nitinol substrati soddisfatto i requisiti funzionali per un materiale stent e migliorato la risposta biologica rispetto a non patinata nitinol. Così, il grafene nitinol rivestito è un valido candidato per un materiale stent.
Introduction
Negli ultimi tre decenni hanno visto la scoperta di nuovi materiali a base di terapie e dispositivi per trattamenti di malattia e la diagnostica. Nuovi materiali in lega come nitinol (NiTi) e acciaio inox sono spesso utilizzati nella produzione di impianti biomedico per le loro superiori proprietà meccaniche. 1-3, tuttavia, numerose sfide ancora a causa della citotossicità materiale esogeno, bio-e emo-compatibilità. La natura metallica di questi risultati leghe in scarsa bio-e emocompatibilità causa di lisciviazione metallo, mancanza di adesione cellulare, proliferazione, e trombosi quando entra in contatto con il sangue che scorre (ad esempio cateteri, innesti vascolari, stent vascolari, valvole cardiache artificiali ecc.). 1, 4, 5 L'interazione di proteine o cellule viventi con superficie dell'impianto può portare a una forte risposta immunologica e la conseguente cascata di reazioni biochimiche possono compromettere la funzionalità del dispositivo. Pertanto, è pertinENT per ottenere il controllo delle interazioni tra impianti biomedici e il suo ambiente circostante biologico. Modificazione superficiale è spesso impiegato per ridurre o prevenire la risposta fisiologica avversa proveniente dal materiale di impianto. Un rivestimento di superficie ideale dovrebbe avere alta resistenza di adesione, inerzia chimica, elevata scorrevolezza e buona emo-e biocompatibilità. Precedentemente, numerosi materiali compresi carbonio tipo diamante (DLC), SiC, TiN, TiO 2 e molti materiali polimerici sono stati testati come rivestimenti impianti biocompatibili superficie. 1, 6-23 Tuttavia, questi materiali sono ancora in grado di soddisfare tutte i criteri funzionali per un rivestimento adatto superficie dell'impianto.
La scoperta di strato atomo di spessore di carbonio sp 2, noto come grafene, ha aperto le porte per lo sviluppo di nuovi materiali multifunzionali. Il grafene è dovrebbe essere un candidato ideale per il rivestimento di superficie implantare in quantoè chimicamente inerte, atomicamente liscia e molto resistente. In questa lettera, si indaga la fattibilità di grafene come un rivestimento di superficie per gli impianti biomedici. I nostri studi dimostrano che il grafene nitinol rivestito (Gr-NiTi) soddisfa tutti i criteri funzionali, e supporta inoltre eccellente muscolatura liscia e la crescita delle cellule endoteliali che porta alla proliferazione cellulare meglio. Troviamo anche che il siero albumina adsorbimento su Gr-NiTi è superiore fibrinogeno. È importante sottolineare che, (i) le nostre misurazioni dettagliate spettroscopiche confermato la mancanza di trasferimento di carica tra il grafene e fibrinogeno suggerendo che il rivestimento di grafene inibisce l'attivazione piastrinica da parte di impianti, (ii) i rivestimenti di grafene non mostrano alcuna significativa tossicità in vitro per le linee endoteliali e muscolari lisce delle cellule che confermano loro biocompatibilità, e (iii) rivestimenti grafene sono chimicamente inerti, resistenti ed impermeabili in ambiente sangue scorre. Questi emo-e proprietà biocompatibili, con st altarength, inerzia chimica e resistenza, rendono rivestimenti grafene come rivestimento superficie ideale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grafene rivestimento di NiTi
- I campioni di grafene utilizzati in questo studio sono stati coltivati in rame (Cu) substrati usando la tecnica di deposizione chimica di vapore, e successivamente trasferiti a 4,5 mm 2 substrati NiTi.
- Cu lamine (1 cm x 1 cm) sono stati posti in un forno tubolare 1 in quarzo e riscaldato a 1000 ° C in presenza di 50 sccm di H 2 e 450 sccm di Ar.
- Successivo, metano (1 e 4 sccm) è stato introdotto nel forno a portate diverse per 20-30 min. I campioni sono stati infine raffreddato a temperatura ambiente sotto flusso H 2, Ar e CH 4.
- Successivamente, le lamine Cu erano spin-rivestito con PMMA (diluito con 4% anisolo) a 4.000 giri seguita da un trattamento termico per 5 minuti a 150 ° C. Grafene attaccato al PMMA strato stata ottenuta incidendo il foglio Cu utilizzando Transene Inc., CE-100 mordenzante, e successivo risciacquo in HCl 10% e acqua deionizzata per 10 min.
- La samples stati trasferiti NiTi substrati (4,5 mm 2) e ricotto a 450 ° C in Ar (300 sccm) e H 2 (700 sccm) per 2 h per rimuovere il PMMA. Infine, i substrati sono stati lavati con acetone per sciogliere il residuo PMMA per ottenere il Gr-NiTi campione. Un reticolo monocromatore XY Dilor tripla stato utilizzato per la caratterizzazione micro-Raman (con obiettivo 100X) di tutti i GR-NiTisamples con l'eccitazione 514,5 nm da un laser a ioni Ar +.
2. Tossicità in vitro di Gr-NiTi
Cellule endoteliali aortiche Rat (cellulare applicazione Inc.) sono state coltivate in un gelatina rivestito 8 Far scorrere camere. Per testare la crescita cellulare, incontaminata e Gr-NiTisubstrates sono stati posti in pozzetti senza rivestimento di gelatina. Scansione di immagini di microscopia elettronica sono stati ottenuti usando un S-4800 Hitachi SEM. Inoltre, ratto cellule muscolari lisce aortiche sono stati coltivati in Cellbind piastre a 96 pozzetti come gruppo di controllo (Corning) in Dulbecco Eagle modificato Medio (ATCC).
- Per testare la vitalità cellulare, cellule (cellule muscolari lisce ed endoteliali sia) sono state seminate a 10 5 cellule / pozzetto in pozzetti contenenti incontaminata NiTi, 1 sccm o 4 sccm Gr-NiTi substrati, dove il sccm indicato corrisponde al flusso di metano utilizzato nella crescita CVD di grafene. Le cellule sono state coltivate per il periodo di tempo desiderato in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2, scambiando supporti ogni altro giorno.
- Al punto di fine, mezzo è stato rimosso e mezzi freschi contenenti 0,5 mg / ml tiazolil blu tetrazolio bromuro (MTT o ottenuti da Sigma) è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Le cellule sono state poi incubate per ulteriori 3 ore. Per il saggio MTS, mezzo è stato rimosso al punto finale di tempo e sostituito con 120 microlitri di soluzione MTS lavoro (Cell 96 Tier acquosa, Promega) e incubate per 3 ore.
- Successivo, supporti stato rimosso delicatamente e 100 ml di dimetilsolfossido (Sigma) è stato aggiunto a ciascun pozzetto. Dopo alloala 10 min per i cristalli MTT per sciogliere, la soluzione è stata trasferita ad un'altra piastra bene. Per il saggio MTS, non dimetilsolfossido è stato aggiunto ai pozzetti. Contenuto dei pozzetti sono stati spostati in una nuova piastra.
- Assorbanza è stata letta a 490 nm e la redditività percentuale è stata determinata normalizzando assorbanza alla assorbanza media del campione NiTi incontaminata. Almeno cinque ripetizioni erano fatte per ogni tipo di campione.
3. Studi microscopia confocale della morfologia cellulare
- Per confocale di ratto cellule muscolari lisce aortiche, substrati erano poste in una camera di scorrimento 8-(Thermo Scientific). Le cellule sono state seminate a 25.000 cellule / camera e incubate per 3 giorni a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Cellule sono state fissate sul substrato con 4% di formaldeide in PBS per 20 min.
- Permeabilizzate con 0.1% Triton-X per 1 min.
- Actina è stato colorato con Alexa Fluor 488 falloidina (LifTecnologie e). 100 pl di alexafluor falloidina 488 a 200 unità / ml in metanolo è stata aggiunta a 1,9 ml di tampone fosfato. Le cellule sono state colorate con 250 microlitri di alexafluor 488 phalloidin per 45 min e poi lavate due volte con tampone fosfato.
- I nuclei sono stati montati con il mezzo Vectashield fluorescente di montaggio contenente DAPI (Vector Laboratories). Immagini confocali sono stati raccolti usando un Nikon confocale TI. Una camera seminati con cellule senza substrato è stato utilizzato come controllo.
4. Adsorbimento di proteine Studi
- Dimensioni del substrato sono state misurate con pinze prima di iniziare gli esperimenti di proteine di adsorbimento. Tre misurazioni sono state effettuate per ciascun lato dei campioni approssimativamente quadrata e mediati per ottenere la lunghezza e larghezza.
- Ogni campione, incontaminata NiTi, e 1sccm 4sccm Gr-NiTiwere incubate con 1 mg / ml di albumina in tampone fosfato salino (PBS) o 1 mg / ml in PBS fibrinogeno in camera temperatura per 3 ore.
- Alike campioni sono stati combinati in una provetta per microcentrifuga con 200 microlitri di tampone campione riduzione e bollito per 5 min.
- I campioni sono stati quindi diluiti in un tampone Tris / Glicina / SDS buffer (Bio-Rad) e passare per un 4-15% gel elettroforesi di poliacrilammide Tris (Bio-Rad) a 90 V per 100 min.
- I gel sono stati colorati con SYPRO Rosso. Diluire SYPRO Rosso (Life Technologies) soluzione madre a 1:5.000 in 7.5 v / v% di acido acetico. Macchia gel per 60 min.
- Immagine utilizzando un gel SP Flourchem (Alpha Innotech). Intensità fluorescente è stata quantificata utilizzando il software ImageJ. Intensità di fluorescenza per ciascun campione è stata normalizzata per la superficie totale di substrato e fibrinogeno adsorbimento è stato confrontato con albumina adsorbimento.
5. Western Blotting per l'espressione proteica
- Western blot è stata eseguita per analizzare actina totale nel ratto cellule muscolari lisce aortiche. Le cellule sono state seminate a 10.000 cellule / substrato in un 96-well piastra.
- Le cellule sono state coltivate per tre giorni prima di rimuovere i media. Proteina totale è stato estratto utilizzando tampone RIPA e uno standard saggio BCA (Lamda) è stata eseguita per quantificare proteine totali.
- Campioni sono stati diluiti alla stessa concentrazione in RIPA e poi bolliti in un tampone riducente per 5 min.
- Proteine sono state separate da un gel di poliacrilammide al 4-15% Tris tramite elettroforesi a 90 V per 100 min. Un caleidoscopio proteina standard (Bio-Rad) è stato utilizzato per valutare il peso molecolare della proteina.
- Le proteine sono state trasferite su una membrana PVDF e bloccato con un 1% secco non grasso del latte (Bio-Rad) soluzione.
- Actina totale è stato etichettato con un anticorpo di coniglio anti-topo actina (Sigma). Un BM chemiluminescenza kit (Roche) è stato utilizzato per rilevare l'anticorpo primario. Le membrane sono state ripreso utilizzando FlourChem SP immagini attrezzature e intensità di fluorescenza è stata misurata utilizzando il software ImageJ. L'intensità della fluorescenza è stata normalizzata confrontando il pristine NiTisample.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. Figura 1 a) grafene policristallino CVD coltivate su Cu lamine imita i grani di metallo di cristallo (barra di scala: 10 micron). b) spettro Raman di 1 sccm (4 sccm) mostra grafene monostrato banda che indica intensa (relativamente più debole) G '(strato pochi) la natura di come preparati grafene. c) immagine AFM di grafene trasferite sulle NiTi presenta una rugosità ~ 5 nm. Barra di scala = 500 nm.
Figura 2 immagini al microscopio confocale ottici per SMC coltivate su a) vetrino di controllo in vetro, b), c incontaminata NiTi) 1 sccm Gr-NiTi e d) 4 sccm Gr-NiTi substrati (scala bar:. 50 micron).
Figura 3. A) saggio MTT mostra che Gr-NiTi substrati (1 e 4 sccm) non mostrano una differenza significativa nella vitalità cellulare SMC rispetto incontaminata NiTi. B) saggio MTS mostra che la vitalità cellulare per 3 giorni RAECs non era significativamente diverso rispetto ai controlli.
Figura 4. Acquisizione di immagini di microscopia elettronica per RAECs coltivati a) incontaminata NiTi, b) 1 sccm Gr-NiTi e c) 4 sccm Gr-NiTi substrati mostrano che i rivestimenti grafene portare ad una migliore morfologia cellulare sferica di RAECs. Barra della scala = 10 micron.
Figura 5A.) Fibrinogeno / albumina rapporto per incontaminata NiTi, Gr-NiTi (1 e 4 campioni SCCM). B) Diagramma livello di energia per il fibrinogeno e la densità elettronica degli stati per grafene mostra la equilibrio del livello di Fermi. Un trasferimento di elettroni da fibrinogeno a Gr-NiTi è possibile solo dagli stati occupati elettronica della molecola di fibrinogeno in stati elettronici vuoti di Gr-NiTi a livello stessa energia. Sia grafene singolo e pochi strati sono semi-metalli a temperatura ambiente con bassa densità di stati in EF che si traduce in una debole (rispetto a nudo nitinol) trasferimento di carica dal fibrinogeno al grafene.
Figura 6. Grafene non mostra le variazioni di G-band forma di riga o di frequenza che indica l'assenza di qualsiasi trasferimento di carica dalle proteine plasmatiche. Il deconvolupicchi ted ottenuti da curve fitting sono mostrati in nero.
Figura 7.) Una parte grafene rivestito di un centesimo Cu esposto al 5% H 2 O 2 rimane invariata mentre la parte scoperta è scolorita. B) Nessuna variazione in G-banda di frequenza è stato osservato nei nostri studi Raman in situ di Gr- NiTi immersa nel 70% HNO 3 che conferma la durabilità dei rivestimenti grafene. c) Il tempo etch Cu in CE 100 solvente viene raddoppiata quando Cu è rivestito di grafene (come in Gr-NiTi) che indica l'impermeabilità delle membrane di grafene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biocompatibilità e citotossicità: La deposizione chimica da fase vapore (CVD) metodo ha prodotto campioni policristallini grafene riproducenti grani di cristallo Cu, come illustrato in Figura 1A. Abbiamo utilizzato la spettroscopia Raman per confermare la presenza di monostrato (strato di pochi) di grafene su 1 sccm (4 sccm) campioni (cfr. figura 1b). Chiaramente, 1 sccm (4 sccm) campioni mostrano fascia indicativa di monostrato intenso (relativamente più debole) G '(strato di pochi) di grafene. Figura 1c mostra un microscopio a forza atomica (AFM) immagine di grafene strato di pochi sulla NiTi substrati. Le nostre misurazioni dettagliate prodotto un valore di rugosità superficiale R q = 5 nm per strati di grafene trasferiti (Gr-NiTi). E 'noto che la topografia della superficie nanostrutturati influenza fortemente la forma delle cellule e assemblaggio del citoscheletro in cellule endoteliali e cellule muscolari lisce. Queste linee cellulari rispondere alle sollecitazioni meccaniche modificando la loro lipidi bilayerfluidità, che possono influenzare negativamente la traslocazione di proteine e l'entrata di attivatori come il calcio nelle cellule. Ancora più importante, l'aumento del gradiente di stress cellulare membrana può cambiare conformazione e la densità dei recettori di superficie cellulare. Al fine di testare l'influenza di rivestimento grafene su gradienti di stress delle cellule, è stata studiata la muscolatura liscia e la morfologia delle cellule endoteliali mediante tecniche di microscopia.
Come mostrato in figura 2, di cellule muscolari lisce (SMC) sulla morfologia incontaminata NiTi è non sferica. Inoltre, le cellule sono scarsamente diffuse indicando debole adesione del SMCs al NiTi incontaminato. Al contrario, SMCs sono dense e sferica sulla Gr-NiTi (sia 1 e 4 sccm) superfici simile al controllo. Rivestimento di grafene riduce i gradienti di stress nelle cellule, fornendo superfici più regolari (evidente da bassi valori di R q mostrato nella Figura 1c) e quindi si traduce in una migliore morfologia cellulare.Per misurare la vitalità cellulare e proliferazione, abbiamo eseguito test MTT sui SMCs cresciuti su incontaminato e Gr-NiTisubstrates a 3 e 7 giorni punti temporali. In questo test, il colorante MTT (colore giallo) viene ridotto in formazan dye (colore viola) dagli enzimi reduttasi attivi e quindi le cellule sane e proliferanti (o citotossicità del materiale) può essere quantificato eseguendo misure colorimetriche. Come mostrato in figura 3a, non abbiamo osservato cambiamenti significativi di tossicità per GR-NiTi substrati dopo 3 e 7 giorni. Questi risultati confermano che i rivestimenti grafene non indurre tossicità in eccesso rispetto alla originaria NiTi stessi substrati.
Per riconfermare gli effetti di rivestimento grafene, abbiamo effettuato esperimenti di imaging dettagliate elettroni microscopia sulle cellule endoteliali di ratto-aortici (vedi Figura 4). Le cellule su substrati incontaminate NiTi sono scarsi e di forma allungata, mentre sono ellissoidale e dEnse sul Gr-NiTi substrati. Tale morfologia cellulare e densità maggiore è risultato simile a SMCs confermano la riduzione gradienti di tensioni fornite dal rivestimento grafene. Inoltre, abbiamo misurato citotossicità grafene rivestimento RAEC utilizzando MTS 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-solfofenil)-2H-tetrazolio dosaggio. Il razionale per l'utilizzo MTS assay (invece di MTT) risiede nella sua migliore compatibilità con i mezzi di crescita RAEC e condizioni. Come mostrato in figura 3b, la nostra analisi MTS in cellule endoteliali esposte vitalità cellulare molto buona e proliferazione confermando nessuna tossicità eccesso dai rivestimenti grafene anche per RAEC. Importante, sia 1 e 4 sccm Gr-NiTi non presentavano variazioni significative proliferazione cellulare suggerendo alcuna dipendenza della morfologia cellulare sul numero di strati di grafene.
Proteine e emocompatibilità: coagulazione del sangue in prossimità del materiale di impianto has stato uno degli ostacoli principali nella tecnologia degli impianti a partire dal 2003. Come accennato in precedenza, il materiale di impianto innesca coagulazione quando entra in contatto con il sangue. L'interazione tra impianto biomedica e sangue inizia con l'adsorbimento di proteine plasmatiche (albumina, fibrinogeno, ecc.) Sulla sua superficie. Inizialmente, proteine altamente abbondanti, quali albumina sierica, flbrinogen e flbronectin vengono adsorbiti ma sono poi sostituito da fattori XII e chininogeno ad alto peso molecolare. Il rapporto di flbrinogen adsorbito e albumina è cruciale nella determinazione emocompatibilità del biomateriale. Precedentemente, un basso rapporto di fibrinogeno / albumina adsorbito su una superficie di un impianto biomedico è stata correlata con bassa adesione piastrinica e la formazione di trombi. 1 Come mostrato in figura 5a, Gr-NiTi mostra partire fibrinogeno / albumina rapporto relativo al NiTi incontaminata suggerendo meglio emocompatibilità derivanti dal grafene. Il fib / alb Ratio era significativamente più basso per entrambi 1 e 4 sccm Gr-NiTi che indica che il grafene è emocompatibilità di livello indipendente.
È noto che il trasferimento di elettroni dalla molecola fibrinogeno all'impianto è responsabile della formazione di fibrina, come primo passo alla crescita trombo. Come mostrato nella figura 5b, fibrinogeno esibisce semiconduttore come densità degli stati elettronici o DOS (indicata con p (E)) con un gap di energia di 1,8 eV. I livelli di Fermi (EF) di fibrinogeno e di Gr-NiTi equilibrare a loro interfaccia. Un trasferimento di carica di un elettrone per fibrinogeno è necessario per la formazione della fibrina in NiTi incontaminata, e il trasferimento di elettroni dalla molecola di fibrinogeno in Gr-NiTi è possibile solo dagli stati occupati elettronici della molecola di fibrinogeno in vuoti stati elettronici di Gr-NiTi a livello di energia stesso. Sia grafene singolo strato e pochi sono semi-metalli a temperatura ambiente con un basso p (E) F E. 24 Così, la corrente di carica di cambio da fibrinogeno al grafene è insignificante (rispetto a nudo nitinol) per bassi valori di p (E). Questa proprietà intrinseca di rivestimenti grafene è fondamentale per inibire qualsiasi trasferimento di carica dal fibrinogeno (e sangue conseguente coagulazione).
Abbiamo utilizzato micro-spettroscopia Raman per confermare che le dinamiche di trasferimento di carica tra fibrinogeno e Gr-NiTi è davvero insignificante. Lo spettro Raman di grafene presenta diverse caratteristiche taglienti a causa di effetti di risonanza. In particolare, la banda tangenziale (G-band) nasce dalla vibrazione planare di atomi di carbonio ed è stato precedentemente trovato per essere altamente sensibile per caricare trasferimento. 25 Il G-banda di frequenza è nota upshift (downshift) quando qualsiasi accettori (donatore) specie interagisce con il grafene con foro (elettroni) di trasferimento. È importante sottolineare che la forma di riga del G-band deviates da un Lorentziana simmetrica ad una asimmetrica Breit-Wigner-Fano (BWF) LineShape a causa di trasferimento di carica. 25 Come previsto, non abbiamo osservato un cambiamento nel G-banda di frequenza di grafene su adsorbimento di fibrinogeno confermando l'assenza di trasferimento di carica tra Gr-NiTi e fibrinogeno (Figura 6). Tale inibizione di trasferimento di carica e bassa fib / alb rapporto indicano emocompatibilità buona di rivestimenti grafene.
Inerzia chimica dei rivestimenti grafene: Il grafene è noto per agire come uno strato di protezione per le sue proprietà fisico-chimiche uniche. Il suo reticolo a nido d'ape sp 2 fornisce una barriera naturale di diffusione e quindi impedisce agli ioni di lisciviazione dei metalli dal materiale di impianto. Recentemente, grafene è stato usato come un palloncino microscopica ermetico 26 e rivestimento protettivo per Cu / Ni. 27 Sebbene la stabilità e la tenuta ermetica grafene sono ben documentati nella litroperatura, presentiamo i nostri dati relativi all'attacco di una moneta Cu nella figura 7 per ribadire l'utilità e la fattibilità di grafene come rivestimenti impianti. Come mostrato in figura 7a, la porzione grafene rivestita della moneta (~ 95% Cu) rimane protetto dall'ossidazione quando esposti ad H 2 O 2, mentre la regione nudo della moneta divenne scolorito a contatto con il 5% di H 2 O 2 (vedi l'immagine ingrandita microscopio ottico in figura 7a).
Per verificare la durata dei rivestimenti grafene, abbiamo esposto Gr-NiTi substrati di acido nitrico al 70% fino al NiTi è stata parzialmente incisa via. Nostra in situ spettroscopia Raman di Gr-NiTi immerso in HNO 3 non ha mostrato alcun cambiamento nella D e G-banda di grafene implicando che il rivestimento grafene è estremamente resistente (figura 7b). Inoltre, abbiamo trovato che il rivestimento in grafene Gr-NiTi riduce la velocità di incisione di coppe sottostanter come mostrato in figura 7c.
In conclusione, le nostre misure spettroscopiche dettagliate confermato la mancanza di trasferimento di carica tra il grafene e fibrinogeno suggerendo che il rivestimento di grafene inibisce l'attivazione piastrinica da parte di impianti. Inoltre, i rivestimenti grafene non mostrano alcuna significativa tossicità in vitro di linee endoteliali e muscolari lisce cellule confermano la loro biocompatibilità. Inoltre, rivestimenti grafene sono risultate essere chimicamente inerte, resistenti ed impermeabili in ambiente sangue scorre. Il bio-e emocompatibilità di rivestimenti grafene insieme con la sua inerzia chimica, impermeabilità e durabilità fare grafene un materiale unico per gli impianti di rivestimento biomediche. Infine, notiamo che siamo riusciti a trasferire fogli di grafene su singole fibre NiTi, tramite il quale il grafene rivestita maglia può essere prodotto. Abbiamo anche sviluppato fogli di grafene chimicamente esfoliate che possono essere direttamente filare ont rivestitoo le mesh come stent. Inoltre, i nostri esperimenti preliminari indicano che è davvero possibile coltivare grafene direttamente sulla lega NiTi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ATCC | 30-2002 | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| CellTiter 96 Aqueous One solution cell proliferation assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 36.5% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexafluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Human fibrinogen | |||
| Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1158 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 45726 | |
| SYPRO Red | Life Technologies | S-6653 | |
| Protein low BCA assay | Lamda Biotech | G1003 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standard | Bio-Rad | 161-0375 | |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Blotting grade blocker non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Anti-actin antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting kit (mouse/rabbit) | Roche Applied Science | 11520709001 | |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| NiTi (51% Ni, 49% Ti) | Alfa-Aesar | 44953 | |
| Equipment | |||
| Horiba JobinYvon | Raman spectrometer | Dilor XY 98 | |
| Nikon | Confocal microscope | Eclipse TI microscope | |
| Thermoscientific | Plate reader | ||
| Bio-Rad | Power supply | 164-5050 | PowerPac basic power supply |
| Bio-Rad | Electrophoresis cell | 165-8004 | Mini-PROTEAN tetra cell |
| Bio-Rad | Gel holder cassette | 170-3931 | Mini gel holder cassette |
References
- Roy, R. K., Lee, K. -R. Biomedical applications of diamond-like carbon coatings: A review. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 83 B (1), 72-84 (2007).
- Shah, A. K., Sinha, R. K., Hickok, N. J., Tuan, R. S. High-resolution morphometric analysis of human osteoblastic cell adhesion on clinically relevant orthopedic alloys. Bone. 24 (5), 499-506 (1999).
- Huang, N., Yang, P., Leng, Y. X., Chen, J. Y., Sun, H., Wang, J., Wang, G. J., Ding, P. D., Xi, T. F., Leng, Y.
- Gutensohn, K., Beythien, C., Bau, J., Fenner, T., Grewe, P., Koester, R., Padmanaban, K., Kuehnl, P. In vitro analyses of diamond-like carbon coated stents: Reduction of metal ion release, platelet activation, and thrombogenicity. Thrombosis Research. 99 (6), 577-585 (2000).
- Gillespie, W. J., Frampton, C. M. A., Henderson, R. J., Ryan, P. M. The Incidence of Cancer Following Total Hip-Replacement. Journal of Bone and Joint Surgery-British Volume. 70 (4), 539-542 (1988).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26 (33), 6547-6557 (2005).
- Mikhalovska, L. I., Santin, M., Denyer, S. P., Lloyd, A. W., Teer, D. G., Field, S., Mikhalovsky, S. Fibrinogen adsorption and platelet adhesion to metal and carbon coatings. Thrombosis and Haemostasis. 92 (5), 1032-1039 (2004).
- Airoldi, F., Colombo, A., Tavano, D., Stankovic, G., Klugmann, S., Paolillo, V., Bonizzoni, E., Briguori, C., Carlino, M., Montorfano, M., Liistro, F., Castelli, A., Ferrari, A., Sgura, F., Mario, C. D. i Comparison of diamond-like carbon-coated stents versus uncoated stainless steel stents in coronary artery disease. American Journal of Cardiology. 93 (4), 474-477 (2004).
- Allen, M., Myer, B., Rushton, N. In vitro and in vivo investigations into the biocompatibility of diamond-like carbon (DLC) coatings for orthopedic applications. Journal of Biomedical Materials Research. 58 (3), 319-328 (2001).
- Butter, R., Allen, M., Chandra, L., Lettington, A. H., Rushton, N. In-vitro Studies of DLC Coatings with Silicon Intermediate Layer. Diamond and Related Materials. 4 (5-6), 857-861 (1995).
- Dearnaley, G., Arps, J. H. Biomedical applications of diamond-like carbon (DLC) coatings: A review. Surface & Coatings Technology. 200 (7), 2518-2524 (2005).
- Dorner-Reisel, A., Schurer, C., Nischan, C., Seidel, O., Muller, E. Diamond-like carbon: alteration of the biological acceptance due to Ca-O incorporation. Thin Solid Films. 420, 263-268 (2002).
- Dowling, D. P., Kola, P. V., Donnelly, K., Kelly, T. C., Brumitt, K., Lloyd, L., Eloy, R., Therin, M., Weill, N. Evaluation of diamond-like carbon-coated orthopaedic implants. Diamond and Related Materials. 6 (2-4), 390-393 (1997).
- Grill, A. Diamond-like carbon coatings as biocompatible materials - an overview. Diamond and Related Materials. 12 (2), 166-170 (2003).
- Hauert, R. A review of modified DLC coatings for biological applications. Diamond and Related Materials. 12 (3-7), 583-589 (2003).
- Windecker, S., Mayer, I., De Pasquale, G., Maier, W., Dirsch, O., De Groot, P., Wu, Y. P., Noll, G., Leskosek, B., Meier, B., Hess, O. M. Working Grp Novel Surface, C., Stent coating with titanium-nitride-oxide for reduction of neointimal hyperplasia. Circulation. 104 (8), 928-933 (2001).
- Zhang, F., Zheng, Z. H., Chen, Y., Liu, X. G., Chen, A. Q., Jiang, Z. B. In vivo investigation of blood compatibility of titanium oxide films. Journal of Biomedical Materials Research. 42 (1), 128-133 (1998).
- Bolz, A., Schaldach, M. Artificial-Heart Valves - Improved Blood Compatibility By PECVD a-SiC-H COATING. Artificial Organs. 14 (4), 260-269 (1990).
- Haude, M., Konorza, T. F. M., Kalnins, U., Erglis, A., Saunamaki, K., Glogar, H. D., Grube, E., Gil, R., Serra, A., Richardt, H. G., Sick, P., Erbel, R., Invest, C. T. Heparin-coated stent placement for the treatment of stenoses in small coronary arteries of symptomatic patients. Circulation. 107 (9), 1265-1270 (2003).
- Suggs, L. J., Shive, M. S., Garcia, C. A., Anderson, J. M., Mikos, A. G. In vitro cytotoxicity and in vivo biocompatibility of poly(propylene fumarate-co-ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 46 (1), 22-32 (1999).
- Clarotti, G., Schue, F., Sledz, J., Benaoumar, A. A., Geckeler, K. E., Orsetti, A., Paleirac, G. Modification of the biocompatible and haemocompatible properties of polymer substrates by plasma-deposited fluorocarbon coatings. Biomaterials. 13 (12), 832-840 (1992).
- Gombotz, W. R., Guanghui, W., Horbett, T. A., Hoffman, A. S. Protein adsorption to poly(ethylene oxide) surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (12), 1547-1562 (1991).
- Ishihara, K., Fukumoto, K., Iwasaki, Y., Nakabayashi, N. Modification of polysulfone with phospholipid polymer for improvement of the blood compatibility. Part 2. Protein adsorption and platelet adhesion. Biomaterials. 20 (17), 1553-1559 (1999).
- Jung, N., Kim, B., Crowther, A. C., Kim, N., Nuckolls, C., Brus, L. Optical Reflectivity and Raman Scattering in Few-Layer-Thick Graphene Highly Doped by K and Rb. ACS Nano. 5 (7), 5708-5716 (2011).
- Rao, A. M., Eklund, P. C., Bandow, S., Thess, A., Smalley, R. E. Evidence for charge transfer in doped carbon nanotube bundles from Raman scattering. Nature. 388 (6639), 257-259 (1997).
- Bunch, J. S., Verbridge, S. S., Alden, J. S., vander Zande, A. M., Parpia, J. M., Craighead, H. G., McEuen, P. L. Impermeable atomic membranes from graphene sheets. Nano Letters. 8 (8), 2458-2462 (2008).
- Chen, S., Brown, L., Levendorf, M., Cai, W., Ju, S. -Y., Edgeworth, J., Li, X., Magnuson, C. W., Velamakanni, A., Piner, R. D., Kang, J., Park, J., Ruoff, R. S. Oxidation Resistance of Graphene-Coated Cu and Cu/Ni Alloy. Acs Nano. 5 (2), 1321-1327 (2011).
