Summary
Grafen biyomedikal implantlar için kaplama malzemesi olarak potansiyel sunmaktadır. Biz bu çalışmada grafen nanometre kalınlığında tabakalar ile kaplama nitinol alaşımları için bir yöntem göstermek ve grafen implant yanıtı etkilememektedir nasıl belirler.
Abstract
Bir yüzey kaplama olarak atomik olarak pürüzsüz grafen implant özelliklerini geliştirmek için bir potansiyele sahiptir. Bu malzeme, bir stent gibi uygulamalar için grafen nanometre kalınlığındaki tabakalar ile kaplama nitinol alaşımlar için bir yöntemi gösterir. Grafen kimyasal buhar biriktirme yoluyla bakır yüzeylerde yetiştirilen ve sonra nitinol yüzeylere transfer edildi. Grafen kaplama biyolojik yanıt nasıl değiştirebileceğini anlamak için, sıçan aort endotel hücreleri ve sıçan aorta düz kas hücrelerinin hücre canlılığı araştırıldı. Ayrıca, hücre adezyon ve morfolojisi üzerine grafen-kaplamaların etkisi floresan konfokal mikroskobu ile incelendi. Hücreler aktin ve çekirdekler için lekeli ve grafen kaplı numuneler karşılaştırıldığında bozulmamış nitinol örnekler arasında belirgin farklılıklar vardı. Sıçan aorta düz kas hücrelerinden Toplam aktin ekspresyonu western blot kullanılarak bulunmuştur. Protein adsorpsiyon karakteristikleri, potansiyel trombojenitesine için bir gösterge, were jel elektroforezi ile serum albümin ve fibrinojen için belirlenir. Ayrıca, fibrinojen dan substrat yük devri Raman spektroskopisi kullanılarak sonucuna varıldı. Bu, nitinol yüzeyler üzerinde grafen kaplama bir stent malzeme için işlevsel şartları yerine ve kaplanmamış nitinol nazaran biyolojik tepki gelişmiş olduğu bulunmuştur. Böylece, grafen-kaplamalı nitinol stent malzeme için uygun bir adaydır.
Introduction
Son üç yılda yeni malzemeler temelli tedaviler ve hastalığın tedavi ve teşhis için cihazların keşif tanık olduk. Bu tür nitinol (NiTi) ve paslanmaz çelik gibi yeni alaşımlı malzemeler genellikle üstün mekanik özellikleri nedeniyle biyomedikal implant imalatında kullanılır. 1-3 Ancak, çeşitli zorluklar ekzojen malzeme sitotoksisiteye bağlı kalır, ve biyo-hemo uyumluluğu. Bu alaşımların sonuç metalik doğa zayıf biyo-ve metal liç, hücre adezyon eksikliği, proliferasyon ve tromboz bu akan kan (örneğin kateter, kan damarı, vasküler stentler, yapay kalp kapakçıkları gibi temas nedeniyle hemokompatibilite vb.). 1, 4, 5 ya da proteinler implant yüzey ile canlı hücre etkileşim olumsuz cihaz işlevselliği etkileyebilir, güçlü bir bağışıklık tepkisi ve biyokimyasal reaksiyonların ardından gelen çağlayan yol açabilir. Bu nedenle, bir pertinbiyomedikal implantlar ve çevresindeki biyolojik çevre arasındaki etkileşimler üzerinde kontrol elde etmek için ent. Yüzey modifikasyonu sık sık implant kaynaklanan istenmeyen fizyolojik tepki azaltmak veya önlemek için kullanılır. İdeal bir yüzey kaplama, yüksek yapışma gücü, kimyasal olarak inert, yüksek pürüzsüzlük ve iyi hemo-ve biyouyumluluk sahip olması bekleniyor. Daha önce, elmas benzeri karbon (DLC), SiC, TiN, TiO 2 ve birçok polimer malzemeler de dahil olmak üzere çok sayıda malzeme biyo-uyumlu implant yüzey kaplama olarak sınanmıştır. 1, 6-23 Ancak, bu malzemelerin hala tüm karşılamak mümkün değildir Uygun bir implant yüzey kaplaması için işlevsel kriterleri.
Grafen olarak bilinen sp 2 karbon, atomu üzerinden tabaka kalınlığında bir buluş yeni fonksiyonlu malzemelerin geliştirilmesi için açılmıştır. Grafen o zamandan beri implant yüzey kaplaması için ideal bir aday olması beklenmektedir, kimyasal olarak inert atomik olarak pürüzsüz ve son derece dayanıklıdır. Bu mektupta, biz biyomedikal implantlar için bir yüzey kaplama olarak grafen canlılığı araştırıyoruz. Çalışmalarımız grafen kaplamalı nitinol (Gr-NiTi) fonksiyonel kriterlerine tamamen uygun olduğunu göstermek ve ayrıca mükemmel düz kas ve daha iyi hücre çoğalması yol açan endotelyal hücre büyümesini destekler. Biz de Gr-NiTi üzerindeki serum albümin adsorpsiyon fibrinojen daha yüksek olduğunu bulmak. Önemlisi, (i) bizim spektroskopik (ii) grafen kaplamalar doğrulayan endotelyal ve düz kas hücre hatları için in vitro toksisite açısından anlamlı bir sergi yok, implantlar tarafından trombosit aktivasyonu inhibe ettiğini grafen kaplama düşündüren grafen ve fibrinojen arasındaki yük transferi eksikliği doğruladı biyouyumlu, ve (iii) grafen kaplamaların kimyasal olarak inert, sağlam ve çevre kan akışı içinde sızdırmaz bulunmaktadır. Yüksek st birlikte bu hemo-ve biyouyumlu özellikleri,rength, kimyasal olarak inert ve dayanıklılık, ideal bir yüzey kaplaması olarak grafen kaplamalar kılıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. NiTi arasında Grafen kaplama
- Bu çalışmada kullanılan grafen örnekleri kimyasal buhar biriktirme yöntemi kullanılarak bakır (Cu) yüzeylerde yetiştirilen ve sonradan 4,5 mm 2 NiTi yüzeylere devredilmiştir.
- Cu folyo (1 cm x 1 cm) kuartz tüp fırın in bir 1 yerleştirilir ve ° C H2 50 sccm ve Ar, 450 sccm varlığında, 1.000 ısıtıldı.
- Daha sonra, metan (1 ve 4 SCCM) 20-30 dk için değişik akış hızlarında fırın içine getirilmiştir. Örnekler, son olarak 2 H, Ar ve CH 4 akan altında oda sıcaklığına kadar soğutuldu.
- Daha sonra, bakır folyo 150 ° C sıcaklıkta 5 dk için bir ısı madde ile 4,000 rpm'de PMMA (% 4 anisol ile seyreltilmiş) ile spin-kaplanmıştır PMMA tabaka bağlı Grafen 10 dakika için% 10 HCI ve de-iyonize su ile durulama Transene Inc CE-100 asitlenmesi ve daha sonraki kullanılarak bakır folyo aşındırma ile elde edilmiştir.
- Samples NiTi yüzeyler (4.5 mm 2) aktarılır ve Ar ° C (300 sccm) ve H, 2 saat boyunca 2 (700 sccm) PMMA çıkarmak için 450 tavlanmış edildi. Son olarak, alt tabakalar Gr-NiTi numune elde etmek için kalıntı PMMA çözmek için aseton ile yıkanmıştır. Bir Dilor XY üçlü ızgara monokromatör bir Ar + iyon lazer 514,5 nm uyarma ile tüm Gr-NiTisamples arasında mikro-Raman karakterizasyon (100X objektif kullanarak) kullanıldı.
Gr-NiTi 2. İn Vitro Toksisite
Sıçan aort endotel hücreleri (Hücre uygulaması Inc) bir jelatin kaplı 8 odalarına slayt üzerinde kültüre alınmıştır. Hücre büyümesi, bozulmamış test ve Gr-NiTisubstrates herhangi bir jelatin kaplama olmayan kuyularda yerleştirildi için. Taramalı elektron mikroskobu görüntüleri Hitachi S-4800 SEM kullanılarak elde edilmiştir. Buna ek olarak, sıçan aortik düz kas hücrelerinde da Du bir kontrol grubu (Corning) gibi 96 oyuklu plakalar CellBind yetiştirildilbecco Modifiye Kartal Orta (ATCC).
- Hücre yaşayabilirliği test edilmesi için, hücreler (endotel ve her ikisi de düz kas hücreleri) / kuyu belirtilen sccm kullanılan metan akış karşılık gelen saf NiTi, 1 SCCM veya 4 sccm Gr-NiTi alt tabakalar içeren kuyularda 10 5 hücrelerinde hücre ekildi grafen CVD büyüme. Hücreler 37 küvözde istenilen süre boyunca yetiştirildi ° C ve% 5 CO 2, her gün medya alışverişi.
- Son zaman noktasında, ortam çıkarılır ve 0.5 mg / ml tiazolil mavi tetrazolyum bromürde (veya Sigma elde edilen MTT) içeren taze ortam her bir kuyucuğa ilave edildi. Hücreler daha sonra ilave bir 3 saat süreyle inkübe edilmiştir. MTS tahlil, ortam son zaman noktası çıkarıldı ve MTS çalışma çözeltisi (Hücre Aşama 96 sulu, Promega) ve 3 saat boyunca inkübe edilmiş 120 ul ile değiştirilir.
- Sonra, ortam yavaşça çıkarılır ve dimetilsülfoksit ve 100 ml (Sigma) her bir kuyucuğa ilave edildi. Allo sonraçözünmesi için MTT kristalleri için kanat 10 dak, çözelti başka iyi levhaya transfer edildi. MTS tahlil için, hiçbir dimetilsülfoksit oyuklara ilave edildi. Peki içeriğinin yeni bir plaka taşındı.
- Absorbans 490 nm de okundu ve yüzde canlılığı bozulmamış NiTi numunenin ortalama absorbans için absorbans normalize ile tespit edilmiştir. En az beş tekrarlar her numune türü için yapıldı.
3. Hücre Morfolojisi Konfokal Mikroskopi Çalışmaları
- Sıçan aortik düz kas hücrelerinin konfokal görüntüleme için, yüzeyler 8-haznesi sürgüsü (Thermo Scientific) yerleştirildi. Hücreler 25,000 hücre / bölme ekildi ve 37 de 3 gün boyunca inkübe edildi ° C ve% 5 CO2.
- Hücreler 20 dakika için fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 formaldehit ile alt tabaka üzerine monte edilmiştir.
- 1 dakika süreyle% 0.1 Triton-X ile permeabilize.
- Aktin Alexa Fluor 488 phalloidin (Lif ile boyandıe Teknolojileri). Tamponlu tuzlu su, metanol içinde 200 birim / ml 'de 488 alexafluor phalloidin 100 ul fosfat ve 1.9 mL ilave edildi. Hücreler 45 dakika için 488 alexafluor phalloidin 250 ul ile boyanmış ve daha sonra fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kere yıkandı.
- Çekirdekler DAPI (Vector Laboratories) içeren VectaShield floresan montaj orta ile monte edildi. Konfokal görüntüler Nikon Konfokal TI kullanılarak toplanmıştır. Herhangi bir alt tabaka olmadan hücreler ile tohumlanan bir bölme, bir kontrol olarak kullanılmıştır.
4. Protein Adsorpsiyon Çalışmaları
- Yüzey boyutları protein adsorpsiyonu deneyleri başlamadan önce kaliperler ile ölçüldü. Üç ölçüm yaklaşık olarak kare örneklerin her iki tarafı için alınır ve uzunluk ve genişlik elde etmek için ortalamaları alınmıştır.
- Her bir numune, bozulmamış NiTi, 1sccm ve 4sccm Gr-NiTiwere salin (PBS) ya da oda t PBS içinde 1 mg / ml fibrinojen tampon, 1 mg / ml fosfat içinde albümin ile inkübe3 saat boyunca emperature.
- Benzeri numune numune tamponu azaltılması ile 200 ul bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir araya getirilmiş ve 5 dakika için kaynatılmış.
- Örnekler daha sonra bir Tris / glisin / SDS tamponu (Bio-Rad) ile seyreltilir ve 100 dakika için 90 V bir% 4-15 Tris poliakrilamid jel elektroforezi (Bio-Rad) ile işletilmiştir.
- Jeller sonra SYPRO Kırmızı ile boyandı. 7.5 v / v asetik asit içinde% 1:5,000 az SYPRO Red (Life Technologies) stok çözeltisi seyreltilir. 60 dakika için jeller Leke.
- Bir Flourchem SP (Alpha Innotech) kullanarak Görüntü jeller. Floresan yoğunluğu ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Her örnekten Floresan yoğunluğu yüzey toplam alanı ile normalize edilmiş ve fibrinojen adsorpsiyon albumin adsorpsiyonu ile karşılaştırılmıştır.
5. Batı Protein Ekspresyonu için Blotting
- Western Blot sıçan aorta düz kas hücrelerinde toplam aktin analiz yapıldı. Hücreler 96-w içinde 10,000 hücre / yüzeyde ekildiell plakası.
- Hücreler ortamını çıkarmadan önce üç gün boyunca yetiştirilmiştir. Toplam protein RIPA tampon ve bir standart BCA assay (Lamda) toplam protein miktarını belirlemek için yapıldı kullanılarak ekstre edildi.
- Numuneler RIPA aynı konsantrasyona seyreltildi ve daha sonra 5 dakika için bir indirgeyici örnek tampon içinde kaynatılmış.
- Proteinler 100 dk 90 V elektroforez yoluyla 4-15% Tris poliakrilamid jel ile ayrıldı. Bir kaleydoskop standart protein (Bio-Rad) protein molekül ağırlığı değerlendirmek için kullanılmıştır.
- Proteinler, bir PVDF zarı aktarılır ve bir% 1 yağsız kuru süt (Bio-Rad) çözeltisi ile bloke edildi.
- Toplam aktin bir tavşan anti-sıçan aktin antikoru (Sigma) ile etiketlendi. Bir dengeleme seti chemiluminescent (Roche), birincil antikor tespit etmek için kullanıldı. Membranlar FlourChem SP görüntüleme ekipmanı kullanarak ve floresan yoğunluğu ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü görüntülendi. Floresan yoğunluğu pri karşılaştırarak normaleStine NiTisample.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. 10 mikron): Şekil 1 Cu folyolar üzerine) CVD yetiştirilen polikristal grafen metal kristal taneleri (ölçek çubuğu taklit eder. b) 1 sccm (4 sccm) grafen Raman spektrumu yoğun (nispeten daha zayıf) G 'bandını gösteren tek tabaka (birkaç katman) olarak hazırlanmış grafen niteliği gösterir. c) NiTi için aktarılan grafen AFM görüntüsü ~ 5 nm pürüzlülüğü gösterir. Ölçek bar = 500 nm.
Şekil 2 a) kontrol cam slayt üzerinde yetiştirilen DKH'lerde için Konfokal optik mikroskop görüntüleri, b) bozulmamış NiTi, c) 1 sccm Gr-NiTi ve d) 4 sccm Gr-NiTi substratlar (ölçek çubuğu:. 50 mikron).
Şekil 3 a.) MTT Gr-NiTi substratları (1 ve 4 sccm) bozulmamış NiTi göreli SMC hücre canlılığını anlamlı bir fark. B) MTS test RAECs için 3 günlük hücre canlılığını anlamlı olmadığını göstermektedir sergilemek olmadığını gösterir kontrollere göre daha farklı.
Şekil 4. Grafen kaplamalar RAECs daha iyi küresel hücre morfolojisi yol açtığını)) a) bozulmamış NiTi, b yetiştirilen RAECs için 4 sccm Gr-NiTi substratlar show 1 sccm Gr-NiTi ve c elektron mikroskobu görüntü tarama. Ölçek bar = 10 mikron.
Şekil 5,Bozulmamış NiTi, Gr-NiTi (1 ve 4 sccm numunelerde). A) Fibrinojen / Albumin oranı. Fibrinojen ve Fermi seviyesi dengeleme gösteren grafen için devletlerin elektronik yoğunluk b) Enerji seviyesi diyagramı. Fibrinojen gelen Gr-NiTi An elektron transferi aynı enerji düzeyinde Gr-NiTi boş elektronik devletlerin içine fibrinojen molekülünün işgal elektronik devletler sadece mümkündür. Hem tekli hem de birkaç katmanlı grafen fibrinojen gelen grafen bir zayıf (olarak çıplak nitinol karşılaştırıldığında) yük transferi ile sonuçlanır EF devletlerin düşük yoğunluğu ile oda sıcaklığında yarı-metallerdir.
Şekil 6. Grafen plazma proteinlerinden herhangi bir yük transfer olmadığını belirten G-bant frekans lineshape ya da herhangi bir değişiklik sergilemez. Deconvolueğri uydurma elde ted zirveleri siyah olarak gösterilmektedir.
Ortaya kısmı renksiz iken Şekil 7. Cu kuruş a) Grafen kaplı bölümü 5% maruz H 2 O 2 değişmeden kalır. B) G-bant frekansı değişiklik yok yerinde Raman çalışmaları bizim gözlendi Gr- NiTi grafen kaplamaların dayanıklılığı teyit HNO 3 70% dalmış. Cu grafen membranların sızdırmazlığı belirten grafen (as Gr-NiTi) ile kaplı olduğunda c) CE 100 solvent Cu etch süresi iki katına çıkarılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biyouyumluluk ve sitotoksisite: kimyasal buhar biriktirme (CVD) yöntemi Şekil 1a gösterildiği Cu kristal taneleri, taklit polikristal grafen örnekleri vermiştir. Biz 1 sccm (4 sccm) örnekleri (Şekil 1b bakınız) tek tabaka (birkaç katmanı) grafen varlığını doğrulamak için Raman spektroskopisi kullanılmıştır. Açıkçası, 1 sccm (4 sccm) örnekleri monolayer göstergesidir yoğun (nispeten daha zayıf) G 'bant (birkaç tabaka) grafen sergilerler. Şekil 1c NiTi yüzeylerde birkaç katman grafen bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) görüntü gösterir. Bizim ayrıntılı pürüzlülük değeri vermiştir R q aktarılan grafen katmanları için = 5 nm (Gr-NiTi). Bu da nano yapılı yüzey topografisi kuvvetle endotel hücrelerinin ve düz kas hücreleri içinde hücre şekli ve sitoskeletal montaj etkilediği bilinmektedir. Bu hücre hatları kendi lipit bilayeri değiştirerek mekanik streslere yanıtolumsuz protein translokasyonu ve bu gibi hücreler içine kalsiyum gibi aktivatörler giriş etkileyebilir akışkanlık. Daha da önemlisi, hücre zarı gerilme gradyan artışı hücre yüzey reseptörlerinin konformasyon ve yoğunluğu değiştirilebilir. Hücrelerin stres eğimde grafen kaplamanın etkisini test etmek amacıyla, düz kas ve endotel mikroskopi teknikler kullanılarak hücre morfolojisi incelenmiştir.
Şekil 2, bozulmamış NiTi düz kas hücresi (SMC) morfolojisi de gösterildiği gibi küresel olmayan olduğunu. Ayrıca, hücreler seyrek bozulmamış NiTi için SMC'lerin zayıf yapışma gösteren yayılır. Aksine, SMC kontrol benzer Gr-NiTi (1 ve 4 'de sccm) yüzeyler üzerinde yoğun ve küresel vardır. Grafen daha pürüzsüz bir yüzey kaplaması (Şekil 1c'de gösterildiği gibi düşük Ar q değerleri belirgin) ve dolayısıyla daha iyi bir hücre morfolojisi halinde sonuçları sağlayarak hücrelerinde stres gradyanlar azaltır.Hücre canlılığı ve çoğalma ölçmek için, biz 3 de bozulmamış ve Gr-NiTisubstrates yetişen DKH'lere ve 7 günlük süre noktaları esas MTT gerçekleştirilir. Bu denemede, boya MTT (sarı renk) aktif redüktaz enzimlerinin formazan boya (mor renk) içine düşer ve bu nedenle sağlıklı ve çoğalan hücreleri (ya da malzemenin sitotoksisite) kolorimetrik ölçümler ile belirtilebilir. Şekil 3a gösterildiği gibi, 3 ve 7 gün sonra Gr-NiTi yüzeyler için toksisite önemli bir değişiklik gözlenmedi. Bu sonuçlar grafen kaplamalar bozulmamış NiTi yüzeylerde kendilerini kıyasla aşırı toksisite neden olmadığını onaylayın.
Grafen kaplama etkilerini teyit etmek için, biz sıçan aort endotel hücreleri (bkz. Şekil 4) ile ilgili ayrıntılı elektron mikroskobu görüntüleme deneyleri yapılmaktadır. Onlar elipsoidal ve d ise bozulmamış NiTi yüzeylerde hücreleri seyrek ve uzundurGr-NiTi yüzeylerde ense. Böyle bir geliştirilmiş ve hücre morfolojisi yoğunluk grafen kaplama ile gerilme gradyanlar bölgesindeki azalma teyit DKH'lerde benzer olduğu bulunmuştur. Bundan başka, MTS 3 kullanılarak RAEC üzerinde grafen kaplama sitotoksisite ölçülen - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5 - (3-karboksimetoksifenil) -2 - (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolyum testi ile ölçüldü. MTS assay (yerine MTT) kullanımı için gerekçe RAEC büyüme ortamı ve koşulları ile daha iyi uyumluluk yatıyor. Şekil 3b'de de görüldüğü gibi, endotel hücre üzerindeki MTS tahlil bile RAEC için grafen kaplamalar herhangi aşırı toksisite teyit çok iyi hücre canlılığı ve proliferasyonu sergiledi. Önemlisi, 1 ve 4 sccm Gr-NiTi grafen tabakalarının sayısına bağlı hücre morfolojisi hiçbir bağımlılığı düşündüren hücre çoğalmasında önemli bir değişiklik sergiledi.
Protein adsorpsiyon ve hemokompatibilite: implant ha çevresinde içindeki kan pıhtılaşmasıs 2003 yılından beri implant teknolojisindeki büyük engellerden biri olmuştur. Kan ile temas ettiğinde önce de belirtildiği gibi, implant malzeme pıhtılaşmayı tetikler. Biyomedikal implant ve kan arasındaki etkileşim yüzeyinde plazma proteinlerinin adsorpsiyon (serum albümin, fibrinojen, vs.) Ile başlar. İlk olarak, örneğin, serum albümin, flbrinogen, ve flbronectin gibi son derece verimli proteinleri adsorbe edilir, ancak daha sonra faktör XII ve yüksek moleküler ağırlıklı kininogen ile değiştirilir. Adsorbe flbrinogen ve albümin oranı biyomalzeme hemokompatibilite belirlenmesinde önemlidir. Daha önce, düşük bir oranı fibrinojen / a biyomedikal implant yüzey üzerinde adsorbe albümin 1, Şekil 5a gösterilmiştir. Düşük trombosit yapışması ve trombüs oluşumu ile ilişkili ortaya çıkan iyi hemokompatibilite düşündüren tertemiz NiTi göreli Gr-NiTi sergi düşük fibrinojen / albümin oranı olmuştur grafen gelen. Fib / alb orao grafen hemokompatibilite katman bağımsız olduğunu gösteren 1 ve 4 hem sccm Gr-NiTi anlamlı düşüklük saptanmıştır.
Bu, fibrinojen molekül dan implant için elektron transferi trombüs büyüme için bir ilk adım olarak fibrin oluşumu için sorumlu olduğu bilinmektedir. Şekil 5b gösterildiği, fibrinojen 1.8 eV bir enerji açığı ile elektronik devletler veya DOS yoğunluğu (p (E) ile gösterilir) gibi yarı-iletken sergiler. Fibrinojen ve Gr-NiTi ve Fermi düzeyleri (EF) kendi arayüzünde muvazene. Fibrinojen başına bir elektronun bir yük transfer bozulmamış NiTi fibrin oluşumu ve Gr-NiTi içine fibrinojen molekülden elektron transferi için gereklidir Gr-NiTi boş elektronik devletlerin içine fibrinojen molekülünün işgal elektronik devletler sadece mümkündür Aynı enerji düzeyinde. Hem tek-ve çok az katmanlı grafen düşük bir P (E) ile oda sıcaklığında yarı-metaller E, F çevresinde. 24 Böylece, grafen fibrine akımı yük değişimi p düşük değerlere (E) 'ye bağlı olarak (Nitinol olarak çıplak ile karşılaştırıldığında) önemsizdir. Grafen kaplamaların Bu içsel bir özelliği fibrinojen engelleyecek herhangi bir yük transferi (ve sonraki kan pıhtılaşması) için çok önemlidir.
Biz fibrinojen ve Gr-NiTi arasındaki yük transfer dinamikleri gerçekten önemsiz olduğunu onaylamak için mikro-Raman spektroskopisi kullanılmıştır. Grafen Raman spektrumu rezonans etkileri nedeniyle birkaç keskin özellikler sergiler. Özellikle, teğetsel bant (G-bandı) karbon atomlarının düzlemsel titreşim ortaya çıkar ve daha önce aktarma şarj etmek için son derece duyarlı olduğu tespit edilmiştir., Herhangi bir akseptör (donör) türünün 25 G-bant frekans (vites küçültme) vites büyütme için bilinmektedir delik (elektron) havalesiyle grafen ile etkileşim. Önemlisi, G-bandında dev lineshapeBeklendiği gibi aktarım ücreti nedeniyle asimetrik Breit-Wigner-Fano (BWF) lineshape için bir simetrik Lorentz gelen iates. 25, biz yük transfer yokluğunda teyit fibrinojen adsorpsiyonu üzerine grafen G-bant frekansı bir değişim gözlenmedi Gr-NiTi ve fibrinojen (Şekil 6) arasındadır. Yük transferi ve düşük fib / alb oranı Böyle inhibisyonu grafen kaplamaların iyi hemokompatibilite göstermektedir.
Grafen Kaplama kimyasal inertlik: Grafen eşsiz fiziksel ve kimyasal özelliklerine bağlı olarak bir koruma tabakası olarak hareket bilinmektedir. Onun sp 2 petek örgü doğal bir bariyer sağlar ve bu nedenle implant malzeme metal iyonu liç önler. Son zamanlarda, grafen Cu / Ni açısından mikroskopik hava geçirmez bir balon 26 ve koruyucu kaplama olarak kullanılır olmuştur. 27. grafen istikrar ve sızdırmazlığı iyi litrelik belgelenen rağmendüs ük, biz implant kaplamalar gibi grafen yararlılığını ve canlılığı yinelemek için Şekil 7'de bir Cu sikke dağlama ile ilgili bizim veri sunmak. Şekil 7a gösterildiği gibi madalyonun çıplak bölgeye% 5 H 2 O 2 (bkz. temas halinde renksiz olurken H 2 O 2 maruz kaldığında, sikke (~% 95 Cu) grafen kaplamalı kısmı oksidasyon karşı korumalıdır kalır Şekil 7a büyütülmüş optik mikroskop görüntüsü).
NiTi kısmen uzak kazınmış kadar grafen kaplamaların dayanıklılığı test etmek için,% 70 nitrik asit Gr-NiTi yüzeylerde maruz. Bizim HNO 3 batırılır Gr-NiTi yerinde Raman spektroskopi grafen kaplama (Şekil 7b) son derece dayanıklı olduğunu ima grafen D ve G-bandında bir değişiklik gösterdi. Ayrıca, Gr-NiTi içinde grafen kaplama, temel Coppe bir etch oranını azalttığır olarak Şekil 7c de gösterilmiştir.
Sonuç olarak, bizim spektroskopik ölçümler grafen ve grafen kaplama implantları trombosit aktivasyonu inhibe ettiğini düşündüren fibrinojen arasındaki yük transferi eksikliği doğruladı. Ayrıca, grafen kaplamalar biyouyumlu teyit endotelyal ve düz kas hücre hatları için in vitro toksisite herhangi bir anlamlı göstermezler. Ayrıca, kaplama grafen kan akan ortam içinde kimyasal olarak atıl ve dayanıklı sızdırmaz olarak tespit edilmiştir. Onun kimyasal olarak inert birlikte grafen kaplamaların biyo-ve hemokompatibilite, dayanıklılık ve sızdırmazlık kaplama biyomedikal implantlar için grafen eşsiz bir malzeme haline getirmektedir. Son olarak, biz grafen kaplı hasır imal edilebilir hangi kullanarak, bireysel NiTi lifler üzerine grafen yaprak transfer başarılı unutmayın. Ayrıca doğrudan kaplı ont dönmeye edilebilir kimyasal eksfolyatif grafen yaprak geliştirmişlerdirörgü benzeri stentler o. Buna ek olarak, ön deneyler, doğrudan NiTi alaşım üzerinde grafen büyümek için gerçekten mümkün olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ATCC | 30-2002 | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| CellTiter 96 Aqueous One solution cell proliferation assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 36.5% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexafluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Human fibrinogen | |||
| Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1158 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 45726 | |
| SYPRO Red | Life Technologies | S-6653 | |
| Protein low BCA assay | Lamda Biotech | G1003 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standard | Bio-Rad | 161-0375 | |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Blotting grade blocker non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Anti-actin antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting kit (mouse/rabbit) | Roche Applied Science | 11520709001 | |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| NiTi (51% Ni, 49% Ti) | Alfa-Aesar | 44953 | |
| Equipment | |||
| Horiba JobinYvon | Raman spectrometer | Dilor XY 98 | |
| Nikon | Confocal microscope | Eclipse TI microscope | |
| Thermoscientific | Plate reader | ||
| Bio-Rad | Power supply | 164-5050 | PowerPac basic power supply |
| Bio-Rad | Electrophoresis cell | 165-8004 | Mini-PROTEAN tetra cell |
| Bio-Rad | Gel holder cassette | 170-3931 | Mini gel holder cassette |
References
- Roy, R. K., Lee, K. -R. Biomedical applications of diamond-like carbon coatings: A review. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 83 B (1), 72-84 (2007).
- Shah, A. K., Sinha, R. K., Hickok, N. J., Tuan, R. S. High-resolution morphometric analysis of human osteoblastic cell adhesion on clinically relevant orthopedic alloys. Bone. 24 (5), 499-506 (1999).
- Huang, N., Yang, P., Leng, Y. X., Chen, J. Y., Sun, H., Wang, J., Wang, G. J., Ding, P. D., Xi, T. F., Leng, Y.
- Gutensohn, K., Beythien, C., Bau, J., Fenner, T., Grewe, P., Koester, R., Padmanaban, K., Kuehnl, P. In vitro analyses of diamond-like carbon coated stents: Reduction of metal ion release, platelet activation, and thrombogenicity. Thrombosis Research. 99 (6), 577-585 (2000).
- Gillespie, W. J., Frampton, C. M. A., Henderson, R. J., Ryan, P. M. The Incidence of Cancer Following Total Hip-Replacement. Journal of Bone and Joint Surgery-British Volume. 70 (4), 539-542 (1988).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26 (33), 6547-6557 (2005).
- Mikhalovska, L. I., Santin, M., Denyer, S. P., Lloyd, A. W., Teer, D. G., Field, S., Mikhalovsky, S. Fibrinogen adsorption and platelet adhesion to metal and carbon coatings. Thrombosis and Haemostasis. 92 (5), 1032-1039 (2004).
- Airoldi, F., Colombo, A., Tavano, D., Stankovic, G., Klugmann, S., Paolillo, V., Bonizzoni, E., Briguori, C., Carlino, M., Montorfano, M., Liistro, F., Castelli, A., Ferrari, A., Sgura, F., Mario, C. D. i Comparison of diamond-like carbon-coated stents versus uncoated stainless steel stents in coronary artery disease. American Journal of Cardiology. 93 (4), 474-477 (2004).
- Allen, M., Myer, B., Rushton, N. In vitro and in vivo investigations into the biocompatibility of diamond-like carbon (DLC) coatings for orthopedic applications. Journal of Biomedical Materials Research. 58 (3), 319-328 (2001).
- Butter, R., Allen, M., Chandra, L., Lettington, A. H., Rushton, N. In-vitro Studies of DLC Coatings with Silicon Intermediate Layer. Diamond and Related Materials. 4 (5-6), 857-861 (1995).
- Dearnaley, G., Arps, J. H. Biomedical applications of diamond-like carbon (DLC) coatings: A review. Surface & Coatings Technology. 200 (7), 2518-2524 (2005).
- Dorner-Reisel, A., Schurer, C., Nischan, C., Seidel, O., Muller, E. Diamond-like carbon: alteration of the biological acceptance due to Ca-O incorporation. Thin Solid Films. 420, 263-268 (2002).
- Dowling, D. P., Kola, P. V., Donnelly, K., Kelly, T. C., Brumitt, K., Lloyd, L., Eloy, R., Therin, M., Weill, N. Evaluation of diamond-like carbon-coated orthopaedic implants. Diamond and Related Materials. 6 (2-4), 390-393 (1997).
- Grill, A. Diamond-like carbon coatings as biocompatible materials - an overview. Diamond and Related Materials. 12 (2), 166-170 (2003).
- Hauert, R. A review of modified DLC coatings for biological applications. Diamond and Related Materials. 12 (3-7), 583-589 (2003).
- Windecker, S., Mayer, I., De Pasquale, G., Maier, W., Dirsch, O., De Groot, P., Wu, Y. P., Noll, G., Leskosek, B., Meier, B., Hess, O. M. Working Grp Novel Surface, C., Stent coating with titanium-nitride-oxide for reduction of neointimal hyperplasia. Circulation. 104 (8), 928-933 (2001).
- Zhang, F., Zheng, Z. H., Chen, Y., Liu, X. G., Chen, A. Q., Jiang, Z. B. In vivo investigation of blood compatibility of titanium oxide films. Journal of Biomedical Materials Research. 42 (1), 128-133 (1998).
- Bolz, A., Schaldach, M. Artificial-Heart Valves - Improved Blood Compatibility By PECVD a-SiC-H COATING. Artificial Organs. 14 (4), 260-269 (1990).
- Haude, M., Konorza, T. F. M., Kalnins, U., Erglis, A., Saunamaki, K., Glogar, H. D., Grube, E., Gil, R., Serra, A., Richardt, H. G., Sick, P., Erbel, R., Invest, C. T. Heparin-coated stent placement for the treatment of stenoses in small coronary arteries of symptomatic patients. Circulation. 107 (9), 1265-1270 (2003).
- Suggs, L. J., Shive, M. S., Garcia, C. A., Anderson, J. M., Mikos, A. G. In vitro cytotoxicity and in vivo biocompatibility of poly(propylene fumarate-co-ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 46 (1), 22-32 (1999).
- Clarotti, G., Schue, F., Sledz, J., Benaoumar, A. A., Geckeler, K. E., Orsetti, A., Paleirac, G. Modification of the biocompatible and haemocompatible properties of polymer substrates by plasma-deposited fluorocarbon coatings. Biomaterials. 13 (12), 832-840 (1992).
- Gombotz, W. R., Guanghui, W., Horbett, T. A., Hoffman, A. S. Protein adsorption to poly(ethylene oxide) surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (12), 1547-1562 (1991).
- Ishihara, K., Fukumoto, K., Iwasaki, Y., Nakabayashi, N. Modification of polysulfone with phospholipid polymer for improvement of the blood compatibility. Part 2. Protein adsorption and platelet adhesion. Biomaterials. 20 (17), 1553-1559 (1999).
- Jung, N., Kim, B., Crowther, A. C., Kim, N., Nuckolls, C., Brus, L. Optical Reflectivity and Raman Scattering in Few-Layer-Thick Graphene Highly Doped by K and Rb. ACS Nano. 5 (7), 5708-5716 (2011).
- Rao, A. M., Eklund, P. C., Bandow, S., Thess, A., Smalley, R. E. Evidence for charge transfer in doped carbon nanotube bundles from Raman scattering. Nature. 388 (6639), 257-259 (1997).
- Bunch, J. S., Verbridge, S. S., Alden, J. S., vander Zande, A. M., Parpia, J. M., Craighead, H. G., McEuen, P. L. Impermeable atomic membranes from graphene sheets. Nano Letters. 8 (8), 2458-2462 (2008).
- Chen, S., Brown, L., Levendorf, M., Cai, W., Ju, S. -Y., Edgeworth, J., Li, X., Magnuson, C. W., Velamakanni, A., Piner, R. D., Kang, J., Park, J., Ruoff, R. S. Oxidation Resistance of Graphene-Coated Cu and Cu/Ni Alloy. Acs Nano. 5 (2), 1321-1327 (2011).
