Generasjon av høy kvalitet Chromatin immunoprecipitation DNA Mal for High-throughput sekvensering (ChIP-seq)

Summary

Kombinasjonen av kromatin immunoprecipitation og ultra-high-throughput sekvensering (ChIP-seq) kan identifisere og kartlegge protein-DNA vekselvirkninger i et gitt vev eller cellelinje. Skissert er hvordan å generere en høy kvalitet ChIP mal for etterfølgende sekvensering, ved hjelp av erfaring med transkripsjonsfaktor TCF7L2 som et eksempel.

Abstract

ChIP-sekvensering (chip-seq) metoder direkte gir hel-genom dekning, hvor kombinere kromatin immunoutfelling (chip) og massivt parallelle sekvensering kan benyttes til å identifisere den repertoaret av pattedyr-DNA-sekvenser som er bundet av transkripsjonsfaktorer in vivo. "Neste generasjon" genom sekvensering teknologi gir 1-2 størrelsesordener økning i mengden av sekvensen som kan være kostnadseffektivt generert over eldre teknologier og dermed gir for ChIP-seq metoder for å direkte gi hel-genom dekning for effektiv profilering av pattedyr protein-DNA vekselvirkninger.

For vellykkede ChIP-seq nærmer seg, må man generere høy kvalitet ChIP DNA mal for å oppnå de beste sekvensering utfall. Beskrivelsen er basert rundt erfaring med proteinproduktet av genet mest sterkt implisert i patogenesen av type 2 diabetes, nemlig transkripsjonsfaktor transkripsjonsfaktor 7-lignende 2 (TCF7L2). Denne faktor har også blitt innblandet i ulike kreftformer.

Skissert er hvordan å generere høy kvalitet ChIP DNA mal avledet fra kolorektal karsinom cellelinje, HCT116, for å bygge en høy oppløsning kartet gjennom sekvensering finne de genene som er bundet av TCF7L2, noe som gir ytterligere innsikt i sin nøkkelrolle i patogenesen av komplekse egenskaper.

Introduction

I mange år har det vært et udekket behov for å identifisere sett av gener bundet og regulert av et gitt protein genom bred, særlig de i transkripsjonsfaktor klassen.

Odom et al. ^En brukt kromatin immunoprecipitation (chip) kombinert med promoter mikromatriser å systematisk identifisere genene okkupert av pre-spesifiserte transkripsjonelle regulatorer i human lever og bukspyttkjertelen holmer. Deretter utviklet Johnson et al. ² en storstilt kromatin immunoprecipitation analysen basert på direkte ultra high-throughput DNA-sekvensering (ChIP-seq) for å grundig kartlegge protein-DNA interaksjoner på tvers av hele pattedyr genomer. Som en test, kartlagt de in vivo binding av nervecellen-restriktiv lyddemper faktor (NRSF) til 1946 steder i det menneskelige genom. Dataene vises skarp oppløsning av forpliktende stilling (+ 50 basepar), som tilrettelagt både isolation av motiver og identifisering av NRSF-bindende motiver. Disse ChIP-seq data også hadde høy sensitivitet og spesifisitet og statistisk sikkerhet (P <10 ^-4), egenskaper som er viktige for dedusere nye kandidat interaksjoner.

Robertson et al. ³ også brukt ChIP-seq for å kartlegge STAT1 mål i interferon-γ (IFN-γ)-stimulert og unstimulated humane HeLa S3 celler in vivo. Av Chip-seq, bruker 15,1 og 12,9 millioner unikt kartlagt sekvens leser, og en estimert falske funnrate på mindre enn 0.001, identifiserte de 41 582 og 11 004 antatte STAT1-bindende regioner i stimulert og unstimulated celler, henholdsvis. Av de 34 loci kjent for å inneholde STAT1 interferonresponsive bindingssteder ^4-8, funnet brikkespoler seq 24 (71%). ChIP-seq målene ble beriket i sekvenser som ligner på kjente STAT1 bindende motiver. Sammenligninger med to eksisterende ChIP-PCR datasett foreslåttDen brikken-seq følsomhet var mellom 70% og 92% og spesifisiteten var minst 95%. I tillegg var det klart at ChIP-seq tilbyr både lav analytisk kompleksitet og følsomhet som øker med sekvensering dybde.

Som sådan, "neste-generasjons" genom sekvensering teknologi gir 1-2 størrelsesordener økning i mengden av sekvensen som kan være kostnadseffektivt generert over eldre teknologier ^ni. ChIP-seq metoder derfor direkte gi hel-genom dekning for effektiv profilering av pattedyr protein-DNA vekselvirkninger ^tre.

I 2006 ble en sterk sammenslutning av varianter i transkripsjonsfaktor 7-aktig 2 (TCF7L2) genet med type 2 diabetes oppdaget ^10. Andre forskere har allerede uavhengig kopiert dette funnet i ulike etnisiteter og interessant, fra de første genomet wide forening studier av type 2 diabetes publisert i Nature ^11,12 </sopp>, Science ^13-15 og ellers ^16,17, var den sterkeste foreningen faktisk med TCF7L2, og dette er nå ansett som den mest betydningsfulle genetiske funn i type 2 diabetes hittil ^18-20. I tillegg har TCF7L2 blitt knyttet til kreft risiko ^21,22, ja, denne forbindelsen ble mer tydelig når 8q24 locus avslørte av genomet wide forening studier av en rekke kreftformer, inkludert kolorektale karsinomer, ble vist å være på grunn av en ekstrem oppstrøms TCF7L2-bindende element kjøring transkripsjon av MYC ^23,24. Som sådan, det er stor interesse i å bestemme nedstrøms gener som reguleres av denne tasten transkripsjonsfaktor.

Basert på erfaring med TCF7L2 som et eksempel på metodikken, skisserer denne artikkelen hvordan å generere høy kvalitet ChIP DNA mal. Brikken ble utført i kolorektal karsinom-cellelinje, HCT116, for etterfølgende sekvensering for å bygge en høy resolution kart over genene bundet av TCF7L2 ²⁵ i en forsøke å gi ytterligere innsikt i sin nøkkelrolle i patogenesen av komplekse egenskaper.

Protocol

1. Cross-link Chromatin Vokse celler i 100x20mm cellekultur retter. Mengden av celler kan variere fra 1 til 10 millioner celler pr tallerken avhengig av celletype. Ca 2 millioner celler er tilstrekkelig for en immunoutfelling. Cross-lenke celler i 1% Formaldehyd i 10 min ved romtemperatur med sporadisk rocking. Quench tverrbinding ved tilsetning av en endelig konsentrasjon på 125 mM glysin og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Vask cellene med 1X Fosfatbufret saltvann (PBS)…

Representative Results

Når kromatin ble sonikert og har blitt behandlet med RNase og Proteinase, bør prøvene kjørt på 2% agarosegel presentere en smøre og mesteparten av DNA i den ønskede størrelse. Hvis flere forskjellige sykluser testes, bør en gradvis reduksjon i størrelse betraktes som antall sykluser øker (figur 2). Etter endt immunoprecipitation del av protokollen berikelse kan enten kontrolleres ved PCR eller real-time PCR. For PCR prøvene kjøres på en agarose gel bør det væ…

Discussion

Det er nå mulig å gjennomføre et stort genom-profil av protein-DNA-interaksjoner forening ved hjelp brikkespoler seq, som har nylig blitt demonstrert med andre transkripsjonsfaktorer ^2,3. Nøkkelen til en vellykket sekvensering utfallet er den generasjonen av høy kvalitet kromatin immunoprecipitation DNA mal.

Når DNA-malen har blitt generert og forsikret å være tilstrekkelig anriket, kan man deretter ta det i bibliotek forberedelse for etterfølgende sekvensering. For eksem…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
EZ-ChIP Kit	Millipore	17-371
GoTaq Hot Start Polymerase	Promega	M5001
Misonix Sonicator	Qsonica	XL-2000
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo-Scientific
			Positive control primer sequences (TCF7L2-1) Forward- 5′-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3′ Reverse- 5′-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3′ Negative control primer sequences (CTRL-1) Forward-5′-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3′ Reverse- 5′-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3′