Summary

Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

Published: April 19, 2013
doi:

Summary

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Abstract

Microplaqueta-seqüenciamento (Chip-seq) métodos diretamente oferecer cobertura de todo o genoma, onde a combinação de cromatina imunoprecipitação (CHIP) e sequenciamento massivamente paralelo pode ser utilizado para identificar o repertório de sequências de DNA de mamíferos vinculados por fatores de transcrição in vivo. "Próxima geração" tecnologias de seqüenciamento do genoma fornecer 1-2 ordens de magnitude aumento na quantidade de seqüência que pode ser rentável gerou mais de tecnologias mais antigas permitindo métodos ChIP-seq para fornecer diretamente a cobertura de todo o genoma para profiling eficaz de mamíferos interacções proteína-ADN.

Para o sucesso abordagens ChIP-seq, deve-se gerar modelo de DNA chip de alta qualidade para obter os melhores resultados de sequenciamento. A descrição é baseada em experiência com o produto de proteína do gene mais fortemente implicado na patogénese da diabetes de tipo 2, a saber, o factor de transcrição do factor de transcrição 7-like 2 (TCF7L2). Este factor também tem sido implicado em vários cancros.

Descritos é como ADN molde para gerar chip de alta qualidade derivada da linha celular de carcinoma colo-rectal, HCT116, a fim de construir um mapa de alta resolução através de sequenciação para determinar os genes ligados por TCF7L2, dando uma visão mais para o seu papel chave na patogénese de características complexas.

Introduction

Durante muitos anos, tem havido uma necessidade não satisfeita para identificar o grupo de genes ligados e regulada por um genoma proteína dada largura, em particular os da classe factor de transcrição.

Odom et al. 1 usado cromatina imunoprecipitação (CHIP), combinado com o promotor de microarrays para identificar sistematicamente os genes ocupados por órgãos reguladores de transcrição pré-especificados em ilhotas pancreáticas fígado humano e. Subsequentemente, Johnson et ai. Dois desenvolveram um ensaio de imunoprecipitação da cromatina em larga escala com base em ultra-sequenciação de DNA de alto rendimento directo (ChIP seguintes), a fim de mapear de maneira abrangente interacções proteína-ADN em toda genomas de mamíferos. Tal como um caso de teste, eles mapearam in vivo a ligação do factor de silenciador neurónio restritiva (NRSF) para 1946 locais no genoma humano. Os dados exibidos sharp resolução da posição de ligação (+ 50 pares de bases), o que facilitou tanto o isolation de motivos ea identificação dos motivos NRSF vinculativas. Estes dados do chip-seq também teve alta sensibilidade e especificidade e confiança estatística (P <10 -4), propriedades que são importantes para inferir novas interações candidatos.

Robertson et al. 3 também usado ChIP seq para mapear STAT1 alvos no interferão-γ (IFN-γ)-estimuladas e não estimuladas As células HeLa S3 humanas in vivo. Por Chip-seq, com 15,1 e 12,9 milhões seqüência mapeada unicamente lê, e uma taxa de falsa descoberta estimada em menos de 0.001, eles identificaram 41.582 e 11.004 STAT1 regiões de ligação putativos em células estimuladas e não estimuladas, respectivamente. Dos 34 loci conhecidos para conter STAT1 interferon-responsive ligação 4-8 locais, Chip-seq encontrados 24 (71%). Alvos ChIP-seq foram enriquecidos em sequências semelhantes aos conhecidos STAT1 motivos de ligação. Comparações com dois dados do chip-PCR existentes define sugeridoque a sensibilidade ChIP seq situou-se entre 70% e 92% e especificidade de, pelo menos, 95%. Além disso, ficou claro que o chip-seq oferece baixa complexidade analítica e sensibilidade que aumenta com a profundidade de seqüenciamento.

Como as tecnologias de seqüenciamento tal, genoma "next-generation" fornecer 1-2 ordens de magnitude aumento na quantidade de seqüência que pode ser custo-benefício gerado sobre as tecnologias mais velhos 9. Métodos ChIP-seq, portanto, fornecer diretamente a cobertura de todo o genoma para profiling eficaz de mamíferos interações DNA-proteína 3.

Em 2006, uma forte associação de variantes do fator de transcrição 7-like 2 (TCF7L2) gene com diabetes tipo 2 foi descoberto 10. Outros pesquisadores já replicado de forma independente este achado em diferentes etnias e, curiosamente, desde os primeiros estudos de associação ampla do genoma de diabetes tipo 2 publicados na revista Nature 11,12 </saté>, Ciência 13-15 e em outros lugares 16,17, a associação mais forte foi de fato com TCF7L2, o que é agora considerado o mais importante descoberta genética na diabetes tipo 2 até à data 18-20. Além disso, TCF7L2 tem sido associada a risco de cancro 21,22; facto, esta ligação tornou-se mais evidente quando o locus 8q24 revelado pelos estudos genoma amplo associação de um certo número de cancros, incluindo os carcinomas colorrectais, foi demonstrado ser devido a um extremo a montante TCF7L2 elemento de ligação dirigir a transcrição de MYC 23,24. Como tal, há um grande interesse em determinar os genes a jusante regulados por este factor de transcrição chave.

Com base na experiência com TCF7L2 como um exemplo do método, este documento descreve como gerar o molde de ADN de chip de alta qualidade. Chip foi realizada na linha celular de carcinoma colo-rectal, HCT116, para sequenciação subsequente, a fim construir uma alta resolmapa buição dos genes vinculados por TCF7L2 25 em um esforço para produzir mais conhecimento para o seu papel fundamental na patogênese de características complexas.

Protocol

1. Cruz-link Chromatin Cultivar células em placas de cultura de 100x20mm celulares. A quantidade de células pode variar de 1 a 10 milhões de células por placa, dependendo do tipo de célula. Aproximadamente 2 milhões de células é suficiente para uma imunoprecipitação. Células de ligação cruzada em formaldeído a 1% durante 10 min à temperatura ambiente com agitação ocasional. Quench de reticulação por adição de uma concentração final de glicina 125 mM e incubar durante…

Representative Results

Uma vez que a cromatina foi sonicada e foram tratados com RNase e Proteinase, as amostras são executados em gel de agarose a 2%, devem apresentar um esfregaço com a maior parte do ADN com o tamanho desejado. Se vários ciclos diferentes são testadas, uma redução gradual no tamanho deve ser visto como aumentar o número de ciclos (Figura 2). Depois de completar a porção de imunoprecipitação do protocolo do enriquecimento pode ser verificada por PCR, ou PCR em tempo r…

Discussion

É agora possível realizar um perfil de todo o genoma de ADN-proteína utilizando as interacções associação ChIP seq, como foi recentemente demonstrado com outros factores de transcrição de 2,3. A chave para um resultado bem sucedido de sequenciação é a geração de um modelo de alta qualidade de ADN de cromatina imunoprecipitação.

Uma vez que o molde de ADN foi gerado e verificado ser adequadamente enriquecida, pode-se, em seguida, levá-lo na preparação de bibliote…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho é apoiado por uma concessão do Instituto de Desenvolvimento do Hospital Infantil da Filadélfia.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
EZ-ChIP Kit Millipore 17-371
GoTaq Hot Start Polymerase Promega M5001
Misonix Sonicator Qsonica XL-2000
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo-Scientific
Positive control primer sequences (TCF7L2-1)
Forward- 5′-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3′
Reverse- 5′-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3′
Negative control primer sequences (CTRL-1)
Forward-5′-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3′
Reverse- 5′-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3′

References

  1. Odom, D. T., et al. Control of pancreas and liver gene expression by HNF transcription factors. Science. 303, 1378-1381 (2004).
  2. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316, 1497-1502 (2007).
  3. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4, 651-657 (2007).
  4. Reich, N. C., Liu, L. Tracking STAT nuclear traffic. Nat. Rev. Immunol. 6, 602-612 (2006).
  5. Lodige, I., et al. Nuclear export determines the cytokine sensitivity of STAT transcription factors. The Journal of Biological Chemistry. 280, 43087-43099 (2005).
  6. Schroder, K., Sweet, M. J., Hume, D. A. Signal integration between IFNgamma and TLR signalling pathways in macrophages. Immunobiology. 211, 511-524 (2006).
  7. Vinkemeier, U. Getting the message across, STAT! Design principles of a molecular signaling circuit. The Journal of Cell Biology. 167, 197-201 (2004).
  8. Brierley, M. M., Fish, E. N. Stats: multifaceted regulators of transcription. J. Interferon Cytokine Res. 25, 733-744 (2005).
  9. Bentley, D. R. Whole-genome re-sequencing. Current Opinion in Genetics & Development. 16, 545-552 (2006).
  10. Grant, S. F., et al. Variant of transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) gene confers risk of type 2 diabetes. Nature Genetics. 38, 320-323 (2006).
  11. Sladek, R., et al. A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes. Nature. 445, 881-885 (2007).
  12. . Wellcome Trust Case Control Consortium. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and 3,000 shared controls. Nature. 447, 661-678 (2007).
  13. Saxena, R., et al. Genome-wide association analysis identifies loci for type 2 diabetes and triglyceride levels. Science. 316, 1331-1336 (2007).
  14. Zeggini, E., et al. Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type 2 diabetes. Science. 316, 1336-1341 (2007).
  15. Scott, L. J., et al. A genome-wide association study of type 2 diabetes in Finns detects multiple susceptibility variants. Science. 316, 1341-1345 (2007).
  16. Steinthorsdottir, V., et al. A variant in CDKAL1 influences insulin response and risk of type 2 diabetes. Nature Genetics. 39, 770-775 (2007).
  17. Salonen, J. T., et al. Type 2 Diabetes Whole-Genome Association Study in Four Populations: The DiaGen Consortium. American Journal of Human Genetics. 81, 338-345 (2007).
  18. Zeggini, E., McCarthy, M. I. TCF7L2: the biggest story in diabetes genetics since HLA. Diabetologia. 50, 1-4 (2007).
  19. Weedon, M. N. The importance of TCF7L2. Diabet. Med. 24, 1062-1066 (2007).
  20. Hattersley, A. T. Prime suspect: the TCF7L2 gene and type 2 diabetes risk. The Journal of Clinical Investigation. 117, 2077-2079 (2007).
  21. Yochum, G. S., et al. Serial analysis of chromatin occupancy identifies beta-catenin target genes in colorectal carcinoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3324-3329 (2007).
  22. Duval, A., Busson-Leconiat, M., Berger, R., Hamelin, R. Assignment of the TCF-4 gene (TCF7L2) to human chromosome band 10q25.3. Cytogenet. Cell Genet. 88, 264-265 (2000).
  23. Pomerantz, M. M., et al. The 8q24 cancer risk variant rs6983267 shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer. Nature Genetics. 41, 882-884 (2009).
  24. Tuupanen, S., et al. The common colorectal cancer predisposition SNP rs6983267 at chromosome 8q24 confers potential to enhanced Wnt signaling. Nature Genetics. 41, 885-890 (2009).
  25. Zhao, J., Schug, J., Li, M., Kaestner, K. H., Grant, S. F. Disease-associated loci are significantly over-represented among genes bound by transcription factor 7-like 2 (TCF7L2) in vivo. Diabetologia. 53, 2340-2346 (2010).
  26. Benjamini, Y., Yekutieli, D. Quantitative trait Loci analysis using the false discovery rate. Genetics. 171, 783-790 (2005).

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Cite This Article
Deliard, S., Zhao, J., Xia, Q., Grant, S. F. Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq). J. Vis. Exp. (74), e50286, doi:10.3791/50286 (2013).

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