Geração de alta Chromatin Template DNA Immunoprecipitation Qualidade para seqüenciamento de alto rendimento (CHIP-seq)

Summary

A combinação de cromatina imunoprecipitação e sequenciamento ultra-high-throughput (CHIP-seq) pode identificar e mapear as interações DNA-proteína em uma determinada linha de tecido ou célula. Delineado é como gerar um modelo de alta chip de qualidade para o seqüenciamento posterior, utilizando a experiência com o fator de transcrição TCF7L2 como um exemplo.

Abstract

Microplaqueta-seqüenciamento (Chip-seq) métodos diretamente oferecer cobertura de todo o genoma, onde a combinação de cromatina imunoprecipitação (CHIP) e sequenciamento massivamente paralelo pode ser utilizado para identificar o repertório de sequências de DNA de mamíferos vinculados por fatores de transcrição in vivo. "Próxima geração" tecnologias de seqüenciamento do genoma fornecer 1-2 ordens de magnitude aumento na quantidade de seqüência que pode ser rentável gerou mais de tecnologias mais antigas permitindo métodos ChIP-seq para fornecer diretamente a cobertura de todo o genoma para profiling eficaz de mamíferos interacções proteína-ADN.

Para o sucesso abordagens ChIP-seq, deve-se gerar modelo de DNA chip de alta qualidade para obter os melhores resultados de sequenciamento. A descrição é baseada em experiência com o produto de proteína do gene mais fortemente implicado na patogénese da diabetes de tipo 2, a saber, o factor de transcrição do factor de transcrição 7-like 2 (TCF7L2). Este factor também tem sido implicado em vários cancros.

Descritos é como ADN molde para gerar chip de alta qualidade derivada da linha celular de carcinoma colo-rectal, HCT116, a fim de construir um mapa de alta resolução através de sequenciação para determinar os genes ligados por TCF7L2, dando uma visão mais para o seu papel chave na patogénese de características complexas.

Introduction

Durante muitos anos, tem havido uma necessidade não satisfeita para identificar o grupo de genes ligados e regulada por um genoma proteína dada largura, em particular os da classe factor de transcrição.

Odom et al. ¹ usado cromatina imunoprecipitação (CHIP), combinado com o promotor de microarrays para identificar sistematicamente os genes ocupados por órgãos reguladores de transcrição pré-especificados em ilhotas pancreáticas fígado humano e. Subsequentemente, Johnson et ai. ^Dois desenvolveram um ensaio de imunoprecipitação da cromatina em larga escala com base em ultra-sequenciação de DNA de alto rendimento directo (ChIP seguintes), a fim de mapear de maneira abrangente interacções proteína-ADN em toda genomas de mamíferos. Tal como um caso de teste, eles mapearam in vivo a ligação do factor de silenciador neurónio restritiva (NRSF) para 1946 locais no genoma humano. Os dados exibidos sharp resolução da posição de ligação (+ 50 pares de bases), o que facilitou tanto o isolation de motivos ea identificação dos motivos NRSF vinculativas. Estes dados do chip-seq também teve alta sensibilidade e especificidade e confiança estatística (P <10 ^-4), propriedades que são importantes para inferir novas interações candidatos.

Robertson et al. ³ também usado ChIP seq para mapear STAT1 alvos no interferão-γ (IFN-γ)-estimuladas e não estimuladas As células HeLa S3 humanas in vivo. Por Chip-seq, com 15,1 e 12,9 milhões seqüência mapeada unicamente lê, e uma taxa de falsa descoberta estimada em menos de 0.001, eles identificaram 41.582 e 11.004 STAT1 regiões de ligação putativos em células estimuladas e não estimuladas, respectivamente. Dos 34 loci conhecidos para conter STAT1 interferon-responsive ligação ^4-8 locais, Chip-seq encontrados 24 (71%). Alvos ChIP-seq foram enriquecidos em sequências semelhantes aos conhecidos STAT1 motivos de ligação. Comparações com dois dados do chip-PCR existentes define sugeridoque a sensibilidade ChIP seq situou-se entre 70% e 92% e especificidade de, pelo menos, 95%. Além disso, ficou claro que o chip-seq oferece baixa complexidade analítica e sensibilidade que aumenta com a profundidade de seqüenciamento.

Como as tecnologias de seqüenciamento tal, genoma "next-generation" fornecer 1-2 ordens de magnitude aumento na quantidade de seqüência que pode ser custo-benefício gerado sobre as tecnologias mais velhos ^9. Métodos ChIP-seq, portanto, fornecer diretamente a cobertura de todo o genoma para profiling eficaz de mamíferos interações DNA-proteína ^3.

Em 2006, uma forte associação de variantes do fator de transcrição 7-like 2 (TCF7L2) gene com diabetes tipo 2 foi descoberto ^10. Outros pesquisadores já replicado de forma independente este achado em diferentes etnias e, curiosamente, desde os primeiros estudos de associação ampla do genoma de diabetes tipo 2 publicados na revista Nature ^11,12 </saté>, Ciência ^13-15 e em outros lugares ^16,17, a associação mais forte foi de fato com TCF7L2, o que é agora considerado o mais importante descoberta genética na diabetes tipo 2 até à data ^18-20. Além disso, TCF7L2 tem sido associada a risco de cancro ^21,22; facto, esta ligação tornou-se mais evidente quando o locus 8q24 revelado pelos estudos genoma amplo associação de um certo número de cancros, incluindo os carcinomas colorrectais, foi demonstrado ser devido a um extremo a montante TCF7L2 elemento de ligação dirigir a transcrição de MYC ^23,24. Como tal, há um grande interesse em determinar os genes a jusante regulados por este factor de transcrição chave.

Com base na experiência com TCF7L2 como um exemplo do método, este documento descreve como gerar o molde de ADN de chip de alta qualidade. Chip foi realizada na linha celular de carcinoma colo-rectal, HCT116, para sequenciação subsequente, a fim construir uma alta resolmapa buição dos genes vinculados por TCF7L2 ²⁵ em um esforço para produzir mais conhecimento para o seu papel fundamental na patogênese de características complexas.

Protocol

1. Cruz-link Chromatin Cultivar células em placas de cultura de 100x20mm celulares. A quantidade de células pode variar de 1 a 10 milhões de células por placa, dependendo do tipo de célula. Aproximadamente 2 milhões de células é suficiente para uma imunoprecipitação. Células de ligação cruzada em formaldeído a 1% durante 10 min à temperatura ambiente com agitação ocasional. Quench de reticulação por adição de uma concentração final de glicina 125 mM e incubar durante…

Representative Results

Uma vez que a cromatina foi sonicada e foram tratados com RNase e Proteinase, as amostras são executados em gel de agarose a 2%, devem apresentar um esfregaço com a maior parte do ADN com o tamanho desejado. Se vários ciclos diferentes são testadas, uma redução gradual no tamanho deve ser visto como aumentar o número de ciclos (Figura 2). Depois de completar a porção de imunoprecipitação do protocolo do enriquecimento pode ser verificada por PCR, ou PCR em tempo r…

Discussion

É agora possível realizar um perfil de todo o genoma de ADN-proteína utilizando as interacções associação ChIP seq, como foi recentemente demonstrado com outros factores de transcrição de ^2,3. A chave para um resultado bem sucedido de sequenciação é a geração de um modelo de alta qualidade de ADN de cromatina imunoprecipitação.

Uma vez que o molde de ADN foi gerado e verificado ser adequadamente enriquecida, pode-se, em seguida, levá-lo na preparação de bibliote…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
EZ-ChIP Kit	Millipore	17-371
GoTaq Hot Start Polymerase	Promega	M5001
Misonix Sonicator	Qsonica	XL-2000
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo-Scientific
			Positive control primer sequences (TCF7L2-1) Forward- 5′-TCGCCCTGTCAATAATCTCC-3′ Reverse- 5′-GCTCACCTCCTGTATCTTCG-3′ Negative control primer sequences (CTRL-1) Forward-5′-ATGTGGTGTGGCTGTGATGGGAAC-3′ Reverse- 5′-CGAGCAATCGGTAAATAGGTCTGG-3′