Summary
הפיתוח האחרון של כלים מדעי המוח המשלבים גנטיקה ואופטיקה, המכונה "optogenetics", מאפשר שליטה על פעילות מעגלים עצבית ברמה חסרת תקדים של רזולוציה מרחב ובזמן. כאן אנו מספקים פרוטוקול לשילוב בהקלטה vivo עם המניפולציה optogenetic של תת קבוצות גנטית מוגדרות של תאי עצב בקליפת המוח פירמידה וsubicular הקדם חזיתית.
Abstract
שיטות optogenetic צמחו ככלי רב עוצמה להבהרת פעילות מעגלים עצבית שבבסיס קבוצה מגוונת של התנהגויות במגוון רחב של מינים. כלים optogenetic ממוצא חיידקים מורכבים מחלבוני קרום רגישים לאור, כי הם מסוגלים להפעיל (למשל, channelrhodopsin-2, ChR2) או שתיקה (למשל, halorhodopsin, NpHR) סוגי תאי ingenetically מוגדרי פעילות עצבית על לוחות זמני התנהגותית רלוונטיים. אנחנו הראשונים להפגין גישה פשוטה למסירה בתיווך הווירוס adeno הקשורים של transgenes ChR2 וNpHR לsubiculum הגבי ואזור prelimbic של קליפת המוח הקדם חזיתית בחולדה. בגלל ChR2 וNpHR מבחינה גנטי להכוונה, אנו מתארים את השימוש בטכנולוגיה זו כדי לשלוט בפעילות החשמלית של אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים (כלומר, תאי עצב פירמידלי) משובצות ברקמה הטרוגנית עם דיוק גבוה זמני. אנו מתארים בזאת חומרה, תוכנה מותאמת אישיתממשק משתמש, ונהלים שיאפשר למסירה בו זמנית אור ורישום חשמלי מתאי עצב פירמידלי transduced בהרדימו בהכנת vivo. כלים אור מגיב אלה מספקים ההזדמנות לזיהוי התרומות סיבתי של סוגי תאים שונים לעיבוד מידע והתנהגות.
Introduction
היכולת להפעיל או להשתיק את סוג תא מסוים בתוך מעגלים עצביים באופנת temporally מדויקת היא קריטית להבנת מעגלים עצביים לעבד סוגים שונים של מידע שבבסיס רגש וקוגניציה. שליטה ניסויית על פעילות עצבית שלמה העסיקה כלים loss-/gain-of-function (למשל, גירוי חשמלי, אפנון תרופתי, נגע) שאינו מספקים את הנדרש באופן סלקטיבי לשליטה באוכלוסיות ספציפיות של תאי עצב, או על היקף זמן או בחלל. ישירות מענה לאתגרים הטכנולוגיים אלה, הפיתוח והיישום של כלים רגישים לאור גנטי encodable אפשר מדעני מוח כדי לשלוט בפעילות החשמלית של סוגים בחרו תא במהלך אירועים התנהגותיים מוגדרים היטב. רבים מחלבונים רגישים לאור אלה הם ממוצא חיידקים, עם הערוץ מגודרת אור קטיון, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, ואת משאבת כלוריד מונחה האור, halorhodopחטא (NpHR) 2,3, בשימוש נרחב.
יתרון עיקרי של optogenetics הוא יכולת אוכלוסיות תאים גנטי יעד ספציפי באזורי המוח הטרוגנית והטכניקה יושמה בהצלחה למספר אורגניזמים מודל (חסרי חוליות לפרימטים לא אנושיים) 4-6. בעלי חיים מהונדסים optogenetic רבים כבר נוצרו וזמינים 7,8 מסחרי, קווים מהונדסים זאת הקמת יכולים להיות עבודה אינטנסיבית ועלות אוסרני. כאן אנו מתארים פרוטוקול למסירה באופן ויראלי בתיווך של גנים ChR2 וNpHR תחת אמרגן CaMKIIα בקליפת מוח עכברוש prelimbic וsubiculum גב באמצעות וירוס adeno הקשורים רקומביננטי וקטור (AAV). בתוך המוח הקדמי, ביטוי CaMKIIα הוא בלעדית לנוירונים פירמידליים glutamatergic 9. AAV משמש בדרך כלל למחקר בסיסי בשל קלותו היחסית של ייצור וחוסר פתוגניות, כמו גם החזק וPersiביטוי transgene סטנט שהושג עם הווקטורים האלה 10. בנוסף אנו מתארים את הצעדים וחומרה למסירה בו זמנית אור והקלטה בחולדות קבוע בראש בהרדמה.
Protocol
1. חפצים וירוס והכנה
- השימוש בוקטורי AAV שכפול פסול להעברת גנים opsin למוח מכרסם מאושר לרמת בטיחות ביולוגית 1 (BSL-1) ודורשים הגנה נאותה ונהלי טיפול כפי שמתואר בפרסום ממשלת ארה"ב, בטיחות ביולוגית במיקרוביולוגיה ומעבדות ביו רפואית, זמין ב המרכז לבקרת מחלות באתר הבית של ב( http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm).
- על מנת להימנע ממחזורים חוזרים ונשנים להקפיא להפשיר, וירוס פיפטה מהבקבוקון של היצרן לaliquots עבודה קטנים יותר בבטיחות ביולוגית קבינט וחנות Class II במקפיא -80 מעלות צלזיוס.
- לפני זריקת stereotactic, לאפשר aliquot להפשיר על קרח ואז ספין למטה בקצרה עם צנטריפוגה ספסל העליון.
- לאט לגבות את מזרק זכוכית המילטון ומחט עם כמות קטנה של סיליקון או שמן מינרלים.ודא שאין בועות אוויר נראות לעין בחבית המזרק. הכנס את המזרק לתוך משאבת microinjector ולצרף את המשאבה ישירות לזרוע האנכית stereotaxic (מניפולטור כלומר stereotaxic).
- מנמיכים את זרוע stereotaxic עד קצה המחט נוגע בחלק התחתון של צינור aliquot הווירוס. להשתמש בבקר למשאבת microinjector למשוך את הנפח הרצוי של וירוס (1.5 μl להזרקת μl 1).
- כל החומר ובמשטחים שבאים במגע עם וירוס יש לחטא עם חומר חיטוי כגון כלור אקונומיקה (10%).
2. הזרקת ניתוח והווירוס
- הרדימי חיה עם קטמין (עכברוש; 125 מ"ג / קילוגרם, ip) - xylazine (עכברוש; 10 מ"ג / קילוגרם, ip) קוקטייל. כדי לאמוד את האפקטיביות של הרדמה, לבדוק לתגובת רפלקס לקמצוץ הבוהן ולתת מינונים משלימים של קטמין במידת הצורך. שימוש בשיטות ניתוחיות אספטיים סטנדרטיות, למקם את בעל חיים לתוך מנגנון stereotaxic (דוד קופף בstruments).
- ביצוע חתך קו האמצע דרך העור בחלק העליון של גולגולת החיה עם מספריים כירורגיות קטנים או אזמל. בעדינות להפריד בין רקמות חיבור ולנקות את החלק העליון של הגולגולת עם מגרד עצם קטן.
- ודא שהראש של החיה הוא ברמה כזו שz קואורדינטות עבור גבחת ומבדה שווה. לקבוע את קואורדינטות stereotaxic לאזור במוח היעד מאטלס מוח כגון מוח החולדה בStereotaxic קואורדינטות (ג'ורג' Paxinos וצ'רלס ווטסון, Academic Press, 2007) או מוח העכבר בStereotaxic קואורדינטות (קית' "ג פרנקלין וג'ורג' Paxinos, Academic Press 2007). לסמן את האתר המיועד של הזרקה עם עט כירורגית.
- דקה בזהירות את הגולגולת מעל אזור היעד באמצעות מקדח שנערך ביד ולעצור כאשר המקדח מגיע לתחתית של הגולגולת. בעזרת זוג מלקחיים בסדר נוספים, להסיר את העצם דליל במטרה לחשוף את הדורה.
- מקם את מחט המזרק מעל היעד הןולהוריד את המחט עד שהוא נוגע דורה ולהשתמש בנקודה זו כדי לחשב את z לתאם. להוריד לאט לאט את מחט הזריקה לתוך המוח עד שתגיע לעמדת z הנכונה. בפרוטוקול זה, באזור prelimbic של קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלי (2.7 מ"מ הקדמי לגבחת, ± 0.5 מ"מ לרוחב קו האמצע, ו-2.2 מ"מ מדורה) או subiculum הגבי (קדמי -6.0 מ"מ לגבחת, ± 3.0 מ"מ לרוחב לקו האמצע, ו-2.0 מ"מ מדורה) הוא ממוקד במבוגרי עכברוש ספראג Dawley זכר (כ 275 ז).
- הזרק וירוס בשיעור של 0.1 μl / min. לאחר ההזרקה הושלמה לחכות 10 דקות לפני משיכת המחט, כדי למנוע זרימה חוזרת של הנגיף אל פני השטח במוח.
- השתמש תפר תפירה עם מחט מחוברת לאטום את העור ולהחיל אנטיביוטיקה לפצע.
- כמובן ביטוי התפקודי ChR2 וNpHR מוקטורי AAV הזמן ישתנה בהתאם לעיצוב ניסיוני וכייל נגיף. לצורך ניסוי זה, in vivo
3. משלוח אור ובהקלטת vivo של ChR2 או נוירונים NpHR-להביע
- צרף אלקטרודה טונגסטן (~ 1-1.5 MΩ, MicroProbes) לצינור זכוכית נימים (פישר סיינטיפיק) באמצעות דבק סופר.
- השתמש בכלי סיבי הפשטה (Thorlabs) כדי לחשוף את הקצה החשוף של סיבים אופטיים multimode (200 ליבת מיקרומטר קוטר, Thorlabs) וקצה סיב נקי עם אתנול. מאוד קל להבקיע קצה סיב עם סכין בצורת טריז יהלומים (Thorlabs) ולהסיר בזהירות את הסיבים העודפים (למשל עם מלקחיים בסדר). הסיבים צריכים לדבוק בקלות בציון.
- חבר את קצה FC של הסיבים למחבר למחשב ביציאת הפלט של לייזר 200 mW בודד דיודה (www.Lumiphy.com) עם אורך הגל הרצוי. ודא כי במשקפי מגן מתאים משוחק בכל העת בעבודה עם לייזרים.
- מדוד את lעוצמת aser בקצה הסיב האופטי באמצעות מד כוח אופטי (www.Lumiphy.com). לin vivo הקלטות, עוצמת אור קטנה כמו 20-100 mW / 2 מ"מ יכולה אמינה לעורר ChR2-או הפעלה או השתקה בתיווך NpHR, בהתאמה, של פעילות עצבית.
- הכנס את הסיב האופטי לתוך צינור הנימים. מקם את קצה הסיב כ 500 מיקרומטר מעל הקצה של אלקטרודה טונגסטן ולקשור חוט תפר דק פעמיים בכמה נקודות ליד הקצה כך שהאלקטרודה והסיבים ישרות. ודא שהמרחק בין קצה האלקטרודה ואת הקשר הקרוב ביותר הוא מספיק זמן לכניסה לאזור היעד.
- הכן את החיה כמו בשלבים 2.1 ו2.2 לעיל. השתמש craniotomy הראשונית כמדריך כדי להפוך את חלון קטן חדש ונקי בגולגולת למיצוב optrode (www.Lumiphy.com). לעשות חתך קטן בדura באמצעות מחט עדינה.
- זהירות להוריד את optrode דרך חלון הגולגולת ולתוך המוח לאזור transduced באמצעות micromanipulator (Narishige). לאחר מכן לקדם את optrode לאט ב10-50 מיקרומטר צעדים עד להופעתה של תא אור מגיב.
- ממשק משתמש של תוכנה מותאמת אישית (NeuroLux Pro www.Lumiphy.com) נכתב בLabVIEW (National Instruments) משמש לשליטה לייזר דיודה בודדת ולדמיין ולהקליט את פעילות עצבית מתמשכת. אותות הקלטות שנתפסו עם להקה עובר ExAmp-20K (Kation מדעי) מגבר מסונן (0.3-8 קילוהרץ), ואנלוגי מכשירים לאומיים ללוח דיגיטלי (USB-6009 NI). ממשק משתמש Pro NeuroLux מאפשר הבחירה של כניסות אנלוגיות (לבחור שני ערוצים לעצביים ואות TTL) ויציאה דיגיטלית. המשתמש יכול להגדיר את קצב הדגימה (20 קילוהרץ), תקופת הבסיס (טרום אור), ותקופה שלאחר אור. המשתמש יכול להגדיר את stimulati לייזר TTLעל רוחב פולס, תדירות ותקופת גירוי (אם התדר הוא 20 תקופה הרץ והגירוי היא 500 msec, 10 פעימות לייזר עם רוחב פולס מוגדר מועברות). המשתמש יכול גם לבחור אספקת אור רציפה (לדוגמא, איור 1). להקלטות חוזרות ונשנות, המשתמש יכול גם להגדיר את מספר רכבות דופק ואת המרווח בין רכבות. ניתן לרכוש נתונים עם או בלי הקלטה בדיסק.
- בעקבות הקלטה, בעלי חיים מורדמים עם קוקטייל קטמין / xylazine וtranscardially perfused עם מי מלח פיסיולוגי וparaformaldehyde (4%) על מנת לוודא מיקום optrode וביטוי opsin.
Representative Results
איור 1 מציג צילום מסך של התוכנה המותאמת אישית (NeuroLux Pro) שפותח בסביבת LabVIEW (National Instruments) המשמשת להקלטה בו זמנית של פעילות עצבית והשליטה פרמטרים דופק אור (כלומר תדירות דופק, רוחב פולס, תקופת גירוי). התוכנה שולחת אות פקודה למכשיר רכישה דיגיטלי שיוצר פולסים TTL לשליטה על לייזר דיודה אחת. בנוסף מציג תוכנה וחנויות פעילות העצבית שנרשמה ואותות TTL נמסרו. אותות אלה דיגיטציה דרך מכשיר הרכישה בשיעור מוגדר מדגם (למשל, 20 קילוהרץ). אותות הקלטות נשמרים כמערך דיוק כפול דו ממדים בקובץ בינארי.
איור 2 מראה את optrode המותאם אישית בהיקף של אלקטרודת טונגסטן מחוברת לסיב אופטי. סיב אופטי הוא קבוע לאלקטרודה באמצעות חוט תפר דק בשלוש נקודות. במידת הצורך, דבק סופר ניתן להשתמש כדי להדביק אותם. עם זאת, יש להימנע באופן קבוע לתקן את הסיב האופטי לאלקטרודה, כי למרות שהאלקטרודה יכולה לעשות שימוש חוזרת מספר פעמים, העברת אור באמצעות הסיב יהיה לבזות עם שימוש חוזר וצריך להיות ביקע וניקה או להחלפה עם כל כניסה לתוך המוח.
פנלים שמאליים של איור תמונות ניאון 3 מופע של חלבון פלואורסצנטי צהוב משופר, מה שמעידים ChR2 בפועל וביטוי NpHR. צילומים אלו מראים ביטוי נציג NpHR בsubiculum הגבי חולדה (איור 3 א) וביטוי ChR2 בprelimbic קליפת המוח (איור 3 ב). ביטוי ויראלי היה מוגבל בעיקר לsubiculum הגבי וprelimbic קליפת המוח (למשל כמה הקרינה נצפתה בgyrus משוננת (איור 3 א, משמאל)). המסלולים של האלקטרודה (דק מסלול, ראש החץ) וסיבים אופטיים (מסלול עבה, חץ) גם נצפו.
פנל של = "jove_content"> שמאל של איור 4 מראה כי ChR2 מושרה spiking temporally המדויק בחולדת prelimbic קליפת המוח. איור 4A הוא עקבות דוגמא לפוטנציאל פעולה מופעל-ChR2 בתגובה ל20 משלוח הרץ של 10 msec הבזקי אור הכחול להלשין prelimbic קליפת המוח. עלילת סריקה (איור 4) מראה-Induced הפעלת ChR2 בשישה נוירונים נציג. כל הנוירונים נרשמו הראו יוצרות עלייה חדות של אור עורר בנאמנות מושלמת. בניגוד לChR2, NpHR במהירות והפיך השתיקו פעילות ספונטנית in vivo בקליפת מוח עכברוש prelimbic (פנל ימני של איור 4). איור 4C הוא עקבות דוגמא המראות כי תאורה רציפה 532 ננומטר (10 ים) של קליפת המוח prelimbic להביע NpHR תחת אמרגן CaMKllα מבטל פעילות יחידה אחת ספונטנית in vivo. שים לב שההשתקה של פעילות תא פירמידלי prelimbic המלאה למשלוח האור הרציף 10 שניות זמן נעול. נמוךעלילת סריקה אה (איור 4D) מראה השתקה מושרה NpHR בשישה נוירונים נציג. גם in vivo הקלטותיהם אופייניות לאלו שהתקבלו מחולדות ספראג-Dawley מבוגר שבמשלוח בתיווך AAV של גנים opsin חיידקים התרחש 18-21 ימים לפני.
איור 5 מראה את התוצאה של גירוי ChR2 חוזר ונשנה של נוירון פירמידלי prelimbic חולדה. דופק בצבע תכלת (10 אלפיות שנייה) נמסר ב20 הרץ למשך 5 שניות (בסך הכל 100 קטניות). עקבות מתח של יוצרות העלייה החדה של האור עורר נרכשו שוב ושוב כל 2 דקות במהלך 2 שעות הקלטה (61 חזרות בסך הכל). אפילו בעת השימוש בפרוטוקול גירוי חוזר על עצמו זה, ChR2 מושרה spiking היציב וחזק בתגובה למשלוח האור.
איורים 6 ו -7 להראות את התוצאות של photoinhibition-Induced NpHR וphotoactivation מונע ChR2 פעילות הנוירון subicular חולדה. כמו במקרה בprelimbic קליפה, NpHR וChR2 הצליחולתווך את עיכוב הזמן נעול מושרה אור והפעלה של נוירונים subicular-transduced opsin עם שחזור גבוה.
איור 1. צילום מסך של ממשק תוכנת Pro NeuroLux למסירת אור בו זמנית והקלטת אלקטרו. עקבות בתמונה מראה השתקת NpHR מושרה של פעילות הספונטנית של תא פירמידלי prelimbic חולדה בתגובה ל10 שניות של רציף משלוח ננומטר אור 532. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 2. כוח תמונה גבוהה של optrode המותאם אישית. סיב אופטי מוכנס לתוך צינור נימי זכוכית מחובר לאלקטרודת טונגסטן וקבוע לאלקטרודה באמצעות חוט תפר. מרחק המרכז אל מרכז between הקצה האלקטרודה ואת קצה הסיב הוא כ 500 מיקרומטר.
איור 3. ביטוי ויראלי ומיקום optrode. התמונה (משמאל) מראה ביטוי נציג NpHR בsubiculum הגבי () וביטוי ChR2 בקליפת prelimbic (ב '). (מימין) סכמטי המייצג את המיקום שבו כל תמונה צולמה. ראש החץ והחץ בכל צילום מציינים את מיקומו של אלקטרודת טונגסטן וסיבים אופטיים, בהתאמה. SUB: subiculum, דייב: gyrus משוננת, PL:. Prelimbic קליפה לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 4. בvivo קלטות אלקטרו מChR2 או prelimb החולדה transduced-NpHRקליפת ic. () עקבות דוגמא לפוטנציאל פעולה מופעל-ChR2 בתגובה ל20 משלוח הרץ של כחול (473 ננומטר) הבזקי אור (10 msec, פס כחול). (ב) עלילת סריקה מראה spiking-Induced ChR2 בשישה נוירונים נציג. כל פעילות יחידה היא להתוות כנקודה. (ג) עקבות דוגמא לדיכוי מושרה NpHR של פעילות ספונטנית במהלך ירוק רציף (532 ננומטר) תאורת אור (10 שניות, פס ירוק). (ד) עלילת סריקה מראה השתקה מושרה NpHR בשישה נוירונים נציג. כל פעילות יחידה היא להתוות כנקודה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 5. spiking מונע ChR2 20 הרץ חוזר ונשנה של נוירון פירמידלי prelimbic עכברוש in vivo. () מתח עקבות של יוצרות העלייה החדה של האור עורררכש בנקודות הזמן 0, 30, 60, 90 120 דקות לאחר תחילת ההקלטות. (ב) עלילת סריקה המציגה את כל 61 החזרות (מרווח 2 דקות בין משפט, 120 סך הכל דקות) של-Induced הפעלת האור. כל פעילות יחידה היא להתוות כנקודה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
איור 6. בvivo קלטות אלקטרו מsubiculum הגבי החולדה transduced-NpHR. () עקבות דוגמא המראות כי תאורת 10 שניות רצופה 532 ננומטר (פס ירוק) של subiculum הגבי להביע NpHR מבטלת פעילות ספונטנית. גל ממוצע (B) של שתי יחידות שנרשמו מהזכר לעיל. הסף משרעת שימש לזיהוי שני תאי עצב שונים. (C) עלילת סריקה מראה חמש חזרותים של השתקה מושרה NpHR של יחידות אלה. כל פעילות יחידה היא להתוות כנקודה.
איור 7. spiking חוזר 20 הרץ מונע CR2 של נוירון subicular הגבי עכברוש in vivo. () מתח עקבות של עוררו אור יוצרות עלייה חדה שנרכשו בנקודות הזמן 0, 30, 60, 90 120 דקות לאחר תחילת ההקלטות. הבלעה: פעילות מתפרצת אופיינית לתא זה. (ב) עלילת סריקה המציגה את כל 61 החזרות (מרווח 2 דקות בין משפט, 120 סך הכל דקות) של-Induced הפעלת האור. כל פעילות יחידה היא להתוות כנקודה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.
Discussion
מגוון רחב של טכניקות זמינים עבור גנטי מיקוד גנים opsin חיידקים לאזורים במוח בדיד במכרסמים. משלוח גנטי נגיפי מספק גישה זולה יחסית ומהירה לתיווך ביטוי ChR2 וNpHR עם סגוליות סוג התא. מערכות וקטור AAV הן בחירה נפוצה לשימוש בניסויי optogenetic בשל כותרות ייצור גבוהות שתישארנה יציב במהלך אחסון, חוסר פתוגניות שלה, ויכולתה לייצר ביטוי גנים לטווח ארוך 10. רבים ממבני opsin עם יזמים תאים מסוג מסוימים זמינים באופן מסחרי במגוון רחב של קפסיד AAV ממתקני גרעין וקטור כגון אוניברסיטת פנסילבניה (http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore) או האוניברסיטה צפון קרוליינה בצ'אפל היל (http://genetherapy.unc.edu). חסרון אחד לטכנולוגיית AAV הואקיבולת מוגבלת אריזה (~ 4.7 kb), אשר מציבה מגבלה על גודל קלטת transgene שיכול לשמש למיקוד ספציפי בתא. כחלופה, וקטורי lentiviral, שיש להם יכולת אריזה גדולה יותר, מסוגלים להכיל opsin מיקוד בשליטה של רצפי אמרגן גדולים יותר.
השימוש בoptrode מאפשר זיהוי אמין של אותות אלקטרו בשילוב עם משלוח אור temporally המדויק. כפי שתואר לעיל, עם זאת, יש צורך בטיפול מספיק בבנייתו. מאז הסיבים אופטיים ביקע הוא שברירית, קשירת חוט התפר חזקה מדי עלולה לגרום לסיבים לשבור. למרות optrode יכול לשמש להקלטות מרובות, את האלקטרודה וסיבים אופטיים יש לנקות (או באופן ידני ביקע במקרה של הסוף החשוף הסיבים אופטיים) לקראת כניסה בגלל העכבה של האלקטרודה ואיכות האור נמסר תהיה לבזות עם שימוש חוזר.
במהלך eleהקלטות ctrophysiological חשובה שoptrode להיות מתקדמת לאט. יש optrode משמש כאן כ 350 עובי מיקרומטר (אלקטרודה טונגסטן: 125 מיקרומטר; ליבה של סיבים אופטיים: 200 מיקרומטר) והוריד אותו במהירות יכולה להוביל לתנועה של רקמת המוח. חפצי אור מושרה גם עשויים להיחשב עם הקלטה מסוימת ולהגדיר קופצים משלוח אור 11-12. למרות שאנחנו לא מצאנו שום חפץ מושרה אור בתנאי הניסוי שלנו, הקלטות מחוץ לאזור המוח transduced עלולים לשמש כביקורת לחפצים קלים. שיקול נוסף בתהליך ההקלטה הוא עוצמת אור הנדרשת להתבוננות שינויים בנוירונים ChR2 או NpHR-להביע, במיוחד עבור הקלטות משך זמן רב. עוצמת לייזר חזקה ותאורת לייזר ארוכה עלולות לגרום לניזק לרקמות ו / או תגובת ירד לאור נמסר שלאחר מכן 12-13. לניסויים התנהגותיים השימוש בוקטור ויראלי בקרה נדרש לeliminatinגרם כל השפעה עקב חום מועבר מהסיבים. עבור רבים ממבני optogenetic הזמינים המסחרית יש מבני שליטה משלימים שבהוסר רצף גן opsin.
יש לציין כי מהונדס ChR2 גרסאות עם מאפיינים וקינטיקה השתפרו פותחו יחד עם opsins השתקה אחר שעשויה להיות מתאים יותר לשאלות ניסיוניות מסוימות 14-15. לדוגמא, גרסת ChR2 חדשה שהוקמה באמצעות mutagenesis הממוקד, המכונה "ChETA", יכול לנהוג spiking העצבי באיכות גבוהה בתדרים (עד לפחות 200 הרץ) מעל זה של ChR2 המקורי 14.
השילוב של in vivo משלוח אור והקלטה בו זמנית של תגובות עצביות הוא שלב קריטי בהקמת מערכות יחסים סיבתי בין פעילות בדוגמת באוכלוסיות תאים גנטית ממוקדים ואירועים התנהגותיים זמן נעול מקביל. הנהלים וחהrdware המתואר כאן מספק גישה פשוטה ליישום optogenetics לin vivo הקלטות קבוע בראש במכרסמים.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים (NIDA) המענק R01 DA24040 (DCC), גרנט זרע חדשני אוניברסיטת קולורדו (DCC), ומענק הכשרת NIDA T32 DA017637 (MVB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
| Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
| Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
| Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
| Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
| Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
| Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
| Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
| Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
| Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
| Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
| Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299 (2007).
- Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
- Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
- Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
- Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
- Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
- McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
- Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
- Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
- Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
- Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).
