Summary
आनुवंशिकी और प्रकाशिकी कि गठबंधन तंत्रिका विज्ञान उपकरणों की हाल ही में विकास, स्थानिक और अस्थायी समाधान का एक अभूतपूर्व स्तर के साथ तंत्रिका सर्किट गतिविधि पर नियंत्रण सक्षम बनाता है, "optogenetics" करार दिया. यहाँ हम प्रीफ्रंटल cortical और subicular पिरामिड न्यूरॉन्स की आनुवंशिक रूप से परिभाषित सबसेट के optogenetic हेरफेर के साथ विवो रिकॉर्डिंग में एकीकृत करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.
Abstract
Optogenetic तरीकों प्रजातियों में से एक विस्तृत रेंज में व्यवहार की एक विविध सेट अंतर्निहित तंत्रिका सर्किट गतिविधि elucidating के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरा है. माइक्रोबियल मूल के optogenetic उपकरणों (जैसे, channelrhodopsin-2, ChR2) या चुप्पी (जैसे, halorhodopsin, NpHR) behaviorally प्रासंगिक timescales पर तंत्रिका गतिविधि ingenetically से परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं को सक्रिय करने में सक्षम हैं कि प्रकाश के प्रति संवेदनशील झिल्ली प्रोटीन से मिलकर. हम पहले पृष्ठीय subiculum और चूहे में प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स के prelimbic क्षेत्र के लिए ChR2 और NpHR transgenes की एडिनो से जुड़े वायरस की मध्यस्थता वितरण के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदर्शित करता है. ChR2 और NpHR आनुवंशिक रूप से लक्षित होते हैं, क्योंकि हम उच्च अस्थायी परिशुद्धता के साथ विषम ऊतक में एम्बेडेड न्यूरॉन्स (यानी, पिरामिड न्यूरॉन्स) के विशिष्ट आबादी की बिजली की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए इस प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन. हम साथ साथ हार्डवेयर, कस्टम सॉफ्टवेयर का वर्णनविवो तैयारी में एक anesthetized में transduced पिरामिड न्यूरॉन्स से एक साथ प्रकाश वितरण और बिजली की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देते हैं कि यूजर इंटरफेस, और प्रक्रियाओं. ये प्रकाश संवेदनशील उपकरण सूचना संसाधन और व्यवहार करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के कारण योगदान की पहचान करने के लिए अवसर प्रदान करते हैं.
Introduction
एक अस्थायी सटीक फैशन में एक तंत्रिका सर्किट के भीतर एक विशेष सेल प्रकार को सक्रिय या चुप्पी करने की क्षमता तंत्रिका सर्किट भावना और अनुभूति अंतर्निहित जानकारी के विभिन्न प्रकार की प्रक्रिया को समझने के लिये महत्वपूर्ण है. बरकरार तंत्रिका गतिविधि पर प्रायोगिक नियंत्रण प्रदान नहीं करते कि loss-/gain-of-function उपकरणों (जैसे, बिजली की उत्तेजना, औषधीय मॉडुलन, घाव) कार्यरत है या तो एक अस्थायी या स्थानिक स्तर पर, न्यूरॉन्स के विशिष्ट आबादी को नियंत्रित करने के लिए चुनिंदा जरूरी है. सीधे इन तकनीकी चुनौतियों को संबोधित करने, आनुवंशिक रूप से encodable प्रकाश के प्रति संवेदनशील उपकरणों के विकास और आवेदन अच्छी तरह से परिभाषित व्यवहार की घटनाओं के दौरान चुनिंदा प्रकार की कोशिकाओं की विद्युत गतिविधि को नियंत्रित करने के neuroscientists सक्षम है. इन प्रकाश के प्रति संवेदनशील प्रोटीन के कई प्रकाश gated कटियन चैनल, channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, और प्रकाश संचालित क्लोराइड पंप, halorhodop साथ, माइक्रोबियल मूल के हैंपाप व्यापक उपयोग में (NpHR) 2,3,.
Optogenetics का एक बड़ा फायदा यह विषम मस्तिष्क क्षेत्रों में आनुवंशिक रूप से लक्ष्य विशिष्ट सेल आबादी करने की क्षमता है और तकनीक को सफलतापूर्वक मॉडल जीवों की संख्या (nonhuman primates को अकशेरुकी) 4-6 के लिए लागू किया गया है. कई optogenetic ट्रांसजेनिक जानवर उत्पन्न और 7,8 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन स्थापना के ट्रांसजेनिक लाइनों श्रम गहन और लागत निषेधात्मक किया जा सकता है किया गया है. यहाँ हम एक पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरस (AAV) सदिश का उपयोग चूहा prelimbic प्रांतस्था और पृष्ठीय subiculum में CaMKIIα प्रमोटर के तहत ChR2 और NpHR जीन की virally की मध्यस्थता वितरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. अग्रमस्तिष्क के भीतर, CaMKIIα अभिव्यक्ति glutamatergic पिरामिड न्यूरॉन्स 9 के लिए विशेष है. AAV सामान्यतः के कारण उसके रिश्तेदार उत्पादन और pathogenicity की कमी की आसानी के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए बुनियादी अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है मजबूत और persiइन वैक्टर 10 से हासिल किया गया है कि स्टेंट transgene अभिव्यक्ति. इसके अलावा हम anesthetized सिर तय चूहों में एक साथ प्रकाश वितरण और रिकॉर्डिंग के लिए कदम और हार्डवेयर रूपरेखा.
Protocol
1. वायरस भंडारण और तैयारी
- कृंतक मस्तिष्क को opsin जीन पहुंचाने के लिए प्रतिकृति अक्षम AAV वैक्टर का उपयोग जैवसुरक्षा स्तर 1 (बीएसएल 1) के लिए मंजूरी दे दी है और यहां उपलब्ध है अमेरिकी सरकार ने प्रकाशन, सूक्ष्म जीव विज्ञान और जैव चिकित्सा प्रयोगशालाओं में जैव सुरक्षा, के रूप में रेखांकित उचित संरक्षण और हैंडलिंग प्रक्रियाओं की आवश्यकता है (रोग नियंत्रण की वेबसाइट के लिए केंद्र http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ).
- एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट और दुकान में छोटे काम कर aliquots में निर्माता की शीशी से दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र, पिपेट वायरस से बचने के लिए.
- पिछले stereotactic इंजेक्शन के लिए, एक विभाज्य बर्फ पर पिघलना और फिर संक्षेप में एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र साथ नीचे स्पिन करने के लिए अनुमति देते हैं.
- धीरे धीरे एक हैमिल्टन गिलास सिरिंज और सिलिकॉन या खनिज तेल की एक छोटी राशि के साथ सुई backfill.यकीन सिरिंज बैरल में नहीं दिखाई हवा बुलबुले हैं. एक microinjector पंप में सिरिंज डालें और ऊर्ध्वाधर stereotaxic हाथ (यानी stereotaxic जोड़तोड़) को सीधे पंप देते हैं.
- सुई की नोक वायरस विभाज्य ट्यूब के नीचे छू तक stereotaxic हाथ को कम करें. वायरस के वांछित मात्रा (एक 1 μl इंजेक्शन के लिए 1.5 μl) को वापस लेने का microinjector पंप के लिए नियंत्रक का प्रयोग करें.
- वायरस के संपर्क में आने वाले सभी सामग्री और सतहों ऐसे क्लोरीन ब्लीच (10%) के रूप में एक निस्संक्रामक के साथ decontaminated किया जाना चाहिए.
2. सर्जरी और वायरस इंजेक्शन
- एक ketamine के साथ पशु anesthetize (चूहा, 125 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) - xylazine (चूहा, 10 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) कॉकटेल. संज्ञाहरण के प्रभाव लाइन, एक पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए एक पलटा प्रतिक्रिया के लिए जाँच करें और यदि आवश्यक हो तो ketamine के पूरक खुराक दे. मानक सड़न रोकनेवाला शल्य चिकित्सा पद्धतियों का प्रयोग, एक stereotaxic तंत्र (डेविड Kopf में में जानवरों की जगहstruments).
- छोटे शल्य कैंची या छुरी के साथ पशु खोपड़ी के शीर्ष पर त्वचा के माध्यम से एक midline चीरा बनाओ. धीरे संयोजी ऊतक अलग है और एक छोटे से हड्डी खुरचनी के साथ खोपड़ी के ऊपर साफ.
- पशु के सिर Z शीर्षस्थान और लैम्ब्डा के लिए निर्देशांक है कि इस तरह के बराबर हैं स्तर है की जाँच करें. ऐसे stereotaxic निर्देशांक में चूहा मस्तिष्क (जॉर्ज Paxinos और चार्ल्स वाटसन, शैक्षणिक प्रेस, 2007) या माउस ब्रेन stereotaxic निर्देशांक में (कीथ बी.जे. फ्रेंकलिन और जॉर्ज Paxinos, शैक्षणिक प्रेस के रूप में एक मस्तिष्क एटलस से लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र के लिए stereotaxic निर्देशांक निर्धारित , 2007). एक शल्य कलम के साथ इंजेक्शन का इरादा साइट निशान.
- ध्यान से पतली एक हाथ से आयोजित ड्रिल का उपयोग कर लक्ष्य क्षेत्र पर खोपड़ी और ड्रिल बिट खोपड़ी के नीचे पहुंचता है जब बंद करो. अतिरिक्त ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, ड्यूरा का पर्दाफाश करने के क्रम में पतला हड्डी हटा दें.
- लक्ष्य से अधिक सिरिंज सुई हैं स्थित करेंएक और यह ड्यूरा छू तक सुई कम और जेड समन्वय की गणना करने के लिए इस बिंदु का उपयोग करें. उचित Z स्थिति तक पहुँच जाता है जब तक बहुत धीरे धीरे मस्तिष्क में इंजेक्शन की सुई कम है. इस प्रोटोकॉल में, औसत दर्जे का prefrontal प्रांतस्था के prelimbic क्षेत्र या पृष्ठीय subiculum पर्वबिन्दु लिए (-6.0 मिमी पूर्वकाल (पर्वबिन्दु 2.7 मिमी पूर्वकाल, midline, और ड्यूरा से -2.2 मिमी पार्श्व 0.5 मिमी ±), पार्श्व 3.0 मिमी ± midline, और ड्यूरा) से -2.0 मिमी के लिए एक वयस्क Sprague Dawley पुरुष चूहा (लगभग 275 ग्राम) में लक्षित है.
- 0.1 μl / मिनट की दर से वायरस इंजेक्षन. इंजेक्शन के बाद पूरा मस्तिष्क की सतह के लिए वायरस की backflow से बचने के लिए सुई वापस लेने से पहले 10 मिनट इंतज़ार करो.
- त्वचा सील और घाव के लिए एंटीबायोटिक दवाओं को लागू करने के लिए संलग्न सुई के साथ एक सिलाई सिवनी का प्रयोग करें.
- AAV वैक्टर से ChR2 और NpHR कार्यात्मक अभिव्यक्ति की समय पाठ्यक्रम प्रयोगात्मक डिजाइन और वायरल अनुमापांक के आधार पर अलग अलग होंगे. इस प्रयोग के लिए, vivo
3. प्रकाश वितरण और ChR2 या NpHR व्यक्त न्यूरॉन्स के vivo रिकॉर्डिंग में
- सुपर गोंद का उपयोग कर एक गिलास केशिका ट्यूब (फिशर साइंटिफिक) के लिए एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड (~ 1-1.5 MΩ, microprobes) संलग्न करें.
- इथेनॉल के साथ एक बहुपद्वति ऑप्टिकल फाइबर (200 माइक्रोन व्यास कोर, Thorlabs) और स्वच्छ फाइबर टिप के नंगे अंत बेनकाब करने के लिए एक फाइबर अलग करना उपकरण (Thorlabs) का प्रयोग करें. बहुत हल्के ढंग से एक कील के आकार का हीरा चाकू (Thorlabs) के साथ फाइबर टिप स्कोर और सावधानी (ठीक संदंश के साथ उदाहरण के लिए) अतिरिक्त फाइबर हटा दें. फाइबर स्कोर पर आसानी से फोड़ना चाहिए.
- एक 200 मेगावाट एकल डायोड लेजर (के उत्पादन बंदरगाह पर पीसी कनेक्टर के लिए फाइबर की एफसी अंत कनेक्ट www.Lumiphy.com वांछित तरंग दैर्ध्य के साथ). लेज़रों के साथ कार्य करते समय उपयुक्त सुरक्षात्मक eyewear हर समय पहना जाता है कि सुनिश्चित करें.
- एल उपायएक ऑप्टिकल बिजली मीटर का प्रयोग (ऑप्टिक फाइबर की नोक पर aser तीव्रता www.Lumiphy.com ). Vivo में रिकॉर्डिंग के लिए, 20-100 मेगावाट / 2 मिमी के रूप में कम तीव्रता प्रकाश मज़बूती neuronal गतिविधि की, क्रमशः, ChR2 या NpHR की मध्यस्थता सक्रियण या मुंह बंद का आह्वान कर सकते हैं.
- केशिका ट्यूब में ऑप्टिकल फाइबर डालें. लगभग 500 माइक्रोन टंगस्टन इलेक्ट्रोड की नोक ऊपर फाइबर टिप स्थिति और इलेक्ट्रोड और फाइबर सीधे ताकि टिप के पास कुछ बिंदुओं पर दो बार एक पतली सीवन धागे टाई. इलेक्ट्रोड की नोक और निकटतम गाँठ के बीच की दूरी लक्ष्य क्षेत्र के लिए प्रविष्टि के लिए लंबे समय पर्याप्त है कि सुनिश्चित करें.
- कदम 2.1 और इसके बाद के संस्करण 2.2 में के रूप में पशु की तैयारी. Optrode (स्थिति के लिए खोपड़ी में एक नई स्वच्छ छोटी सी खिड़की बनाने के लिए एक गाइड के रूप में प्रारंभिक कपाल - उच्छेदन प्रयोग www.Lumiphy.com ). विकास पर एक छोटा सा चीराura एक ठीक सुई का उपयोग कर.
- ध्यान से एक micromanipulator (Narishige) का उपयोग transduced क्षेत्र के लिए खोपड़ी खिड़की के माध्यम से और मस्तिष्क में optrode कम है. फिर एक प्रकाश उत्तरदायी सेल के उद्भव तक 10-50 माइक्रोन चरणों में धीरे धीरे optrode अग्रिम.
- एक कस्टम सॉफ्टवेयर यूजर इंटरफेस (NeuroLux प्रो www.Lumiphy.com LabVIEW (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) में लिखा है) एक डायोड लेजर नियंत्रित करने के लिए चल रही है और तंत्रिका गतिविधि कल्पना और रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता है. संकेत दर्ज फ़िल्टर की एक examp-20K (Kation वैज्ञानिक) एम्पलीफायर बैंड पास (0.3-8 kHz), और डिजिटल बोर्ड (एनआई यूएसबी-6009) के लिए एक नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स अनुरूप के साथ कब्जा कर रहे हैं. NeuroLux प्रो यूजर इंटरफेस अनुरूप जानकारी के चुनाव और डिजिटल उत्पादन (neuronal और टीटीएल संकेत के लिए दो चैनलों का चयन) की अनुमति देता है. उपयोगकर्ता नमूना दर (20 kHz), आधारभूत अवधि (पूर्व प्रकाश), और बाद प्रकाश की अवधि को परिभाषित कर सकते हैं. उपयोगकर्ता टीटीएल लेजर stimulati परिभाषित कर सकते हैंपल्स चौड़ाई, आवृत्ति और उत्तेजना अवधि (आवृत्ति 20 हर्ट्ज और उत्तेजना की अवधि 500 मिसे है, तो परिभाषित पल्स चौड़ाई के साथ 10 लेजर दालों वितरित कर रहे हैं) पर. उपयोगकर्ता भी निरंतर प्रकाश वितरण चयन (जैसे, चित्रा 1). सकते हैं दोहराया रिकॉर्डिंग के लिए, उपयोगकर्ता को भी पल्स गाड़ियों की संख्या और ट्रेनों के बीच अंतराल को परिभाषित कर सकते हैं. डेटा के साथ या डिस्क की रिकॉर्डिंग के बिना हासिल किया जा सकता है.
- रिकॉर्डिंग के बाद, जानवरों ketamine / xylazine कॉकटेल के साथ anesthetized हैं और transcardially optrode प्लेसमेंट और opsin अभिव्यक्ति सत्यापित करने के क्रम में शारीरिक खारा और paraformaldehyde (4%) के साथ perfused.
Representative Results
चित्रा 1 neuronal गतिविधि के साथ रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया और प्रकाश नाड़ी मानकों (यानी नाड़ी आवृत्ति, नाड़ी चौड़ाई, उत्तेजना अवधि) को नियंत्रित अनुकूलित सॉफ्टवेयर LabVIEW वातावरण में विकसित (प्रो NeuroLux) (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) के एक स्क्रीनशॉट को दर्शाया गया है. सॉफ्टवेयर प्रोग्राम एक डायोड लेजर पर नियंत्रण के लिए टीटीएल दालों उत्पन्न करता है कि एक डिजिटल अधिग्रहण डिवाइस के लिए एक आदेश संकेत भेजता है. इसके अतिरिक्त सॉफ्टवेयर प्रोग्राम को प्रदर्शित करता है और दुकानों दर्ज neuronal गतिविधि और वितरित टीटीएल संकेतों. इन संकेतों को एक परिभाषित नमूना दर (जैसे, 20 kHz) में अधिग्रहण डिवाइस के माध्यम से डिजीटल हैं. संकेत दर्ज एक बाइनरी फ़ाइल में एक दो आयामी डबल सटीक सरणी के रूप में सहेज कर रहे हैं.
चित्रा 2 एक ऑप्टिकल फाइबर से जुड़ी एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड से मिलकर कस्टम optrode से पता चलता है. एक ऑप्टिकल फाइबर तीन पर पतली सीवन धागे का उपयोग कर इलेक्ट्रोड को तय हो गई हैअंक. यदि आवश्यक हो, सुपर गोंद उन्हें पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, इलेक्ट्रोड फाइबर के माध्यम से कई बार प्रकाश संचरण पुनः उपयोग किया जा सकता है, हालांकि दोहराया उपयोग के साथ नीचा दिखाना होगा और cleaved और साफ या मस्तिष्क में हर प्रविष्टि के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए क्योंकि स्थायी रूप से इलेक्ट्रोड के लिए ऑप्टिकल फाइबर फिक्सिंग से बचने.
वास्तविक ChR2 और NpHR अभिव्यक्ति का संकेत बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन का चित्रा 3 शो फ्लोरोसेंट छवियों की बाईं पैनल,. इन तस्वीरों प्रतिनिधि चूहे पृष्ठीय subiculum में NpHR अभिव्यक्ति (चित्रा 3) और prelimbic प्रांतस्था में ChR2 अभिव्यक्ति (3B चित्रा) दिखा. वायरल अभिव्यक्ति (उदाहरण के लिए कुछ प्रतिदीप्ति) छोड़ दिया, दांतेदार गाइरस में (चित्रा 3A मनाया गया) पृष्ठीय subiculum और prelimbic प्रांतस्था करने के लिए ज्यादातर प्रतिबंधित किया गया था. इलेक्ट्रोड (पतली पगडंडी, तीर सिर) और ऑप्टिकल फाइबर (मोटी ट्रैक, तीर) की पटरियों को भी मनाया गया.
चित्रा 4 एस = "jove_content"> बाएं पैनल ChR2. चित्रा -4 ए prelimbic चूहे के लिए 10 मिसे नीले प्रकाश दालों के 20 हर्ट्ज वितरण के जवाब में ChR2 ट्रिगर कार्रवाई क्षमता का एक उदाहरण ट्रेस है चूहा prelimbic प्रांतस्था में अस्थायी सटीक स्पाइकिंग प्रेरित पता चलता है कि प्रांतस्था. रेखापुंज साजिश (चित्रा 4 बी) के छह प्रतिनिधि न्यूरॉन्स में ChR2 प्रेरित सक्रियण से पता चलता है. सभी दर्ज न्यूरॉन्स सही निष्ठा के साथ प्रकाश पैदा स्पाइकिंग दिखाया. ChR2 के विपरीत, NpHR तेजी से और reversibly चूहा prelimbic प्रांतस्था (चित्रा 4 का सही पैनल) में vivo में सहज गतिविधि खामोश. चित्रा 4C दिखा एक उदाहरण ट्रेस है कि नीचे NpHR व्यक्त prelimbic प्रांतस्था की निरंतर 532 एनएम रोशनी (10 S) CaMKllα प्रमोटर विवो में सहज एकल इकाई गतिविधि समाप्त. Prelimbic पिरामिड सेल गतिविधि की पूरी मुंह बंद समय बंद 10 सेकंड निरंतर प्रकाश वितरण करने के लिए है कि ध्यान दें. निम्नएर रेखापुंज साजिश (चित्रा 4D) छह प्रतिनिधि न्यूरॉन्स में NpHR प्रेरित मुंह बंद करने से पता चलता है. दोनों में विवो रिकॉर्डिंग माइक्रोबियल opsin जीनों की AAV की मध्यस्थता वितरण 18-21 दिन पूर्व हुई जिसमें वयस्क Sprague-Dawley चूहों से प्राप्त उन लोगों के प्रतीक हैं.
चित्रा 5 एक चूहा prelimbic पिरामिड न्यूरॉन के दोहराया ChR2 उत्तेजना के परिणाम से पता चलता है. ब्लू प्रकाश नाड़ी (10 मिसे) 5 सेकंड (100 दालों कुल) के लिए 20 हर्ट्ज पर दिया गया था. प्रकाश पैदा spiking की वोल्ट निशान बार बार एक 2 घंटा रिकॉर्डिंग सत्र (61 repetitions कुल) के दौरान हर 2 मिनट हासिल किया गया. इस दोहराव उत्तेजना प्रोटोकॉल का उपयोग यहां तक कि जब ChR2 प्रकाश वितरण के जवाब में स्थिर और मजबूत स्पाइकिंग प्रेरित किया.
आंकड़े 6 और 7 NpHR प्रेरित photoinhibition और चूहा subicular न्यूरॉन गतिविधि की ChR2 संचालित photoactivation के परिणाम दिखाते हैं. मामले prelimbic प्रांतस्था में है, NpHR और ChR2 करने में सक्षम थेप्रकाश प्रेरित समय बंद निषेध और उच्च reproducibility के साथ opsin-transduced subicular न्यूरॉन्स की सक्रियता मध्यस्थता.
चित्रा 1. एक साथ प्रकाश वितरण और electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए NeuroLux प्रो सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस का स्क्रीनशॉट. चित्र ट्रेस निरंतर 532 एनएम प्रकाश प्रसव के 10 सेकंड के जवाब में चूहे prelimbic पिरामिड सेल की सहज गतिविधि का NpHR प्रेरित मुंह बंद करने से पता चलता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. कस्टम optrode की उच्च शक्ति छवि. एक ऑप्टिकल फाइबर ग्लास केशिका ट्यूब एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड से जुड़ी है और सीवन धागे का उपयोग कर इलेक्ट्रोड को तय सम्मिलित किया जाता है. betw केंद्र के लिए केंद्र की दूरीeen इलेक्ट्रोड टिप और फाइबर टिप लगभग 500 मीटर है.
चित्रा 3. वायरल अभिव्यक्ति और optrode नियुक्ति. (बाएं) फोटो प्रतिनिधि पृष्ठीय subiculum में NpHR अभिव्यक्ति (ए) और prelimbic प्रांतस्था (बी) में ChR2 अभिव्यक्ति दिखा. प्रत्येक फोटोग्राफ लिया गया था जहां स्थान का प्रतिनिधित्व करता है (सही) योजनाबद्ध. प्रत्येक तस्वीर में Arrowhead और तीर टंगस्टन इलेक्ट्रोड के स्थान और ऑप्टिकल फाइबर से संकेत मिलता है, क्रमशः. उप: subiculum महानिदेशक: दांतेदार गाइरस, पी एल:. Prelimbic प्रांतस्था बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. ChR2 या NpHR-transduced चूहा prelimb से विवो electrophysiological रिकॉर्डिंगआईसी प्रांतस्था. (ए) नीला (473 एनएम) प्रकाश दालों (10 मिसे, नीली पट्टी) का 20 हर्ट्ज वितरण के जवाब में ChR2 ट्रिगर कार्रवाई क्षमता का उदाहरण ट्रेस. (बी) के छह प्रतिनिधि न्यूरॉन्स में ChR2 प्रेरित स्पाइकिंग दिखा रेखापुंज साजिश है. प्रत्येक इकाई गतिविधि बिंदी के रूप में साजिश रची है. (सी) सतत ग्रीन (532 एनएम) प्रकाश रोशनी (10 सेकंड, हरे रंग की पट्टी) के दौरान सहज गतिविधि का NpHR प्रेरित दमन का उदाहरण ट्रेस. (डी) छह प्रतिनिधि न्यूरॉन्स में NpHR प्रेरित मुंह बंद दिखा रेखापुंज साजिश है. प्रत्येक इकाई गतिविधि बिंदी के रूप में साजिश रची है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 5. विवो में एक चूहा prelimbic पिरामिड न्यूरॉन के दोहराव 20 हर्ट्ज ChR2 संचालित spiking. (ए) प्रकाश पैदा spiking के निशान वोल्टेजसमय अंक 0, 30, 60, में हासिल 90, रिकॉर्डिंग की शुरुआत के बाद 120 मिनट. (बी) के प्रकाश प्रेरित सक्रियण के सभी 61 repetitions (2 मिनट अंतर परीक्षण अंतराल, 120 मिनट कुल) दिखा रेखापुंज साजिश है. प्रत्येक इकाई गतिविधि बिंदी के रूप में साजिश रची है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 6. NpHR-transduced चूहे पृष्ठीय subiculum से विवो electrophysiological रिकॉर्डिंग. (ए) NpHR व्यक्त पृष्ठीय subiculum के 10 सेकंड निरंतर 532 एनएम रोशनी (हरी पट्टी) सहज गतिविधि समाप्त दिखा रहा है कि उदाहरण ट्रेस. ऊपर निशान से दो दर्ज की इकाइयों (बी) औसत waveforms. आयाम सीमा दो अलग न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. (सी) पाँच पुनरावृत्ति दिखा रेखापुंज साजिशइन इकाइयों की NpHR प्रेरित मुंह बंद करने की है. प्रत्येक इकाई गतिविधि बिंदी के रूप में साजिश रची है.
चित्रा 7. विवो में एक चूहे पृष्ठीय subicular न्यूरॉन के दोहराव 20 हर्ट्ज CR2 संचालित spiking. (ए) के समय अंक 0, 30, पर हासिल spiking प्रकाश पैदा की निशान वोल्टेज 60, 90, 120 मिनट रिकॉर्डिंग की शुरुआत के बाद. इनसेट: इस सेल के विशिष्ट फोड़ गतिविधि. (बी) के प्रकाश प्रेरित सक्रियण के सभी 61 repetitions (2 मिनट अंतर परीक्षण अंतराल, 120 मिनट कुल) दिखा रेखापुंज साजिश है. प्रत्येक इकाई गतिविधि बिंदी के रूप में साजिश रची है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Discussion
तकनीक की एक विस्तृत सरणी कृन्तकों में असतत मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए माइक्रोबियल opsin जीन आनुवंशिक रूप से लक्षित करने के लिए उपलब्ध हैं. वायरल जीन वितरण सेल प्रकार विशिष्टता के साथ ChR2 और NpHR अभिव्यक्ति मध्यस्थता के लिए एक अपेक्षाकृत सस्ता और त्वरित तरीका प्रदान करता है. AAV वेक्टर सिस्टम भंडारण, pathogenicity की कमी, और लंबी अवधि के जीन अभिव्यक्ति 10 उत्पादन करने की क्षमता के दौरान स्थिर रहेगा कि उच्च उत्पादन titers के कारण optogenetic प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए एक आम पसंद हैं. सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटरों के साथ opsin निर्माणों में से कई ऐसे पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय (के रूप में वेक्टर कोर सुविधाओं से AAV सीरमप्रकारों की एक किस्म में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) या विश्वविद्यालय चैपल हिल में उत्तरी कैरोलिना ( http://genetherapy.unc.edu ). AAV प्रौद्योगिकी के लिए एक दोष यह हैसेल विशिष्ट लक्षित के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि transgene कैसेट आकार पर एक प्रतिबंध स्थानों जो सीमित पैकेजिंग क्षमता (~ 4.7 केबी),. एक विकल्प के रूप में, एक बड़े पैकेजिंग क्षमता है जो lentiviral वैक्टर,, बड़े प्रमोटर दृश्यों के नियंत्रण के तहत लक्षित कर opsin पूरा करने में सक्षम हैं.
एक optrode का उपयोग अस्थायी सटीक प्रकाश वितरण के साथ संयोजन में electrophysiological संकेतों के विश्वसनीय पता लगाने के लिए अनुमति देता है. ऊपर बताया गया है, हालांकि, पर्याप्त देखभाल इसके निर्माण में की जरूरत है. Cleaved ऑप्टिकल फाइबर नाजुक है, इसलिए भी कसकर सिवनी धागा बांधने फाइबर तोड़ने के लिए कारण हो सकता है. वितरित प्रकाश के इलेक्ट्रोड और गुणवत्ता के प्रतिबाधा नीचा दिखाना होगा क्योंकि optrode एकाधिक रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, भले ही इलेक्ट्रोड और ऑप्टिकल फाइबर से पहले प्रविष्टि को साफ किया (या मैन्युअल ऑप्टिकल फाइबर नंगे अंत के मामले में cleaved) होना चाहिए दोहराया उपयोग के साथ.
हाथी के दौरानctrophysiological रिकॉर्डिंग यह optrode धीरे से उन्नत किया है कि महत्वपूर्ण है. यहां इस्तेमाल optrode लगभग 350 माइक्रोन मोटाई है (टंगस्टन इलेक्ट्रोड: 125 मीटर, ऑप्टिक फाइबर की कोर: 200 माइक्रोन) और तेजी से इसे कम मस्तिष्क के ऊतकों के आंदोलन का नेतृत्व कर सकेगी. प्रकाश प्रेरित कलाकृतियों को भी विशेष रूप से रिकॉर्डिंग और प्रकाश वितरण सेट अप 11-12 के साथ विचार किया जा सकता है. हम अपने प्रयोगात्मक हालत में कोई प्रकाश प्रेरित विरूपण साक्ष्य पाया है, transduced मस्तिष्क क्षेत्र के बाहर रिकॉर्डिंग संभावित प्रकाश कलाकृतियों के लिए एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान एक और विचार विशेष रूप से लंबी अवधि रिकॉर्डिंग के लिए, ChR2 या NpHR व्यक्त न्यूरॉन्स में परिवर्तन के अवलोकन के लिए आवश्यक प्रकाश की तीव्रता है. मजबूत लेजर तीव्रता और लंबे लेजर रोशनी ऊतकों को नुकसान और / या बाद में वितरित प्रकाश 12-13 के लिए एक कम प्रतिक्रिया हो सकती थी. व्यवहार प्रयोग के लिए एक नियंत्रण वायरल सदिश का उपयोग eliminatin के लिए आवश्यक हैग्राम फाइबर से बचाया गर्मी की वजह से किसी भी प्रभाव. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध optogenetic निर्माणों से कई के लिए opsin जीन अनुक्रम हटा दिया गया है जिसमें पूरक नियंत्रण निर्माणों रहे हैं.
यह ChR2 कुछ प्रयोगात्मक प्रश्नों 14-15 के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है कि अन्य मुंह बंद opsins के साथ विकसित किया गया है सुधार गुण और कैनेटीक्स साथ वेरिएंट इंजीनियर ध्यान दिया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, लक्षित mutagenesis के माध्यम से स्थापित एक नया ChR2 संस्करण, "ChETA", मूल ChR2 14 के ऊपर है कि (कम से कम 200 हर्ट्ज तक) आवृत्तियों पर उच्च निष्ठा neuronal spiking ड्राइव कर सकते हैं करार दिया.
vivo में प्रकाश वितरण और neuronal प्रतिक्रियाओं के एक साथ रिकॉर्डिंग के संयोजन आनुवंशिक रूप से लक्षित सेल आबादी और इसी समय बंद व्यवहार की घटनाओं में नमूनों गतिविधि के बीच अनौपचारिक सम्बन्ध स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रक्रियाओं और हायहाँ रेखांकित rdware कृन्तकों में vivo सिर तय की रिकॉर्डिंग के लिए optogenetics को लागू करने के लिए एक स्पष्ट दृष्टिकोण प्रदान करते हैं.
Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम नशीली दवाओं के सेवन (NIDA) अनुदान R01 DA24040 (डीसीसी), विश्वविद्यालय कोलोराडो के अभिनव बीज अनुदान (डीसीसी), और Nida प्रशिक्षण अनुदान T32 DA017637 (MVB) पर राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
| Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
| Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
| Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
| Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
| Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
| Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
| Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
| Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
| Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
| Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
| Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
| Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
| Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
| Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
| Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |
References
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