एक चोट ड्रोसोफिला लार्वा वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड का उपयोग करने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के उत्थान और मरम्मत की जांच प्रतिमान वर्णित है. समय चूक और निश्चित नमूनों में confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग लेजर, उद्देश्यपूर्ण विकसित सॉफ्टवेयर और आनुवंशिकी के साथ मात्रात्मक विश्लेषण के साथ संयुक्त, छुरा CNS उत्थान और मरम्मत के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए किया जाता है.
एक प्रयोगात्मक विधि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) प्रणाली चोट फल मक्खी ड्रोसोफिला का उपयोग करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच करने के लिए विकसित किया गया है. समझ और पशुओं में मरम्मत के उत्थान के जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण सवाल है. क्षतिग्रस्त मानव सीएनएस को पुनर्जीवित नहीं है, और समझ कैसे पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए एक चिकित्सा तंत्रिका विज्ञान के मुख्य लक्ष्यों में से एक है. ड्रोसोफिला की शक्तिशाली आनुवंशिक टूलकिट CNS उत्थान की समस्या से निपटने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
CNS उदरीय तंत्रिका कॉर्ड (VNC, हड्डीवाला रीढ़ की हड्डी के बराबर) के लिए एक घाव स्वयं एक टंगस्टन सुई के साथ लागू किया जाता है. VNC बाद में समय चूक में फिल्माया जा सकता है और 24 घंटे के लिए स्कैनिंग लेजर confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए समय पर घाव के विकास का पालन करें. वैकल्पिक रूप से, यह संवर्धित किया जा सकता है तो तय है और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ न्यूरॉन और glial कोशिकाओं कल्पना immunofluorescence का उपयोग दाग. उपयुक्त मार्कर का उपयोग, चाचोट का एक परिणाम के रूप में सेल आकारिकी और सेल राज्य में nges देखे जा सकते हैं. ImageJ और जानबूझकर विकसित प्लग इन, मात्रात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है समय और सेल प्रसार और कोशिका मृत्यु में चोट के प्रभाव पर घाव के आकार में परिवर्तन को मापने के. बड़े नमूना आकार के इन तरीकों विश्लेषण की अनुमति देते हैं. वे ड्रोसोफिला की शक्तिशाली आनुवंशिकी के आणविक CNS उत्थान और मरम्मत अंतर्निहित तंत्र की जांच के साथ जोड़ा जा सकता है.
पशुओं में पुनर्जनन यह पता चलता है कि जब जीव विकास का आदेश दिया है और पूरा कोशिकाओं भावना, और कैसे एक जीव की संरचनात्मक अखंडता हासिल की है और बनाए रखा है. कोशिकाओं के इन रहस्यमय क्षमताओं को समझना जीव विज्ञान में बहुत रुचि है. पुनर्जनन को बढ़ावा देने चिकित्सा तंत्रिका विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्यों में से एक है. मनुष्यों में क्षतिग्रस्त केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) पुनर्जीवित नहीं करता है. रीढ़ की हड्डी में चोट के कृंतक मॉडल समझने के लिए कैसे कोशिकाओं को चोट करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, नैतिक चिंताओं, उच्च लागत और धीमी गति से पशुओं के जीवन चक्र प्रगति विवश.
फल मक्खी ड्रोसोफिला विकासात्मक जीव विज्ञान और तंत्रिका विज्ञान में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल जीव है. अपने शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरणों और कम जीवन चक्र के लिए धन्यवाद, ड्रोसोफिला recurrently जीन मानव और रोग की समझ के लिए प्रासंगिकता के साथ और कार्यों जीन नेटवर्क की खोज करने के लिए प्रेरित किया है. विकासवादी चुनाव के प्रचुर मात्रा में सबूत हैमनुष्य के लिए मक्खियों से जीन समारोह की servation.
हाल के वर्षों में, तंत्रिका तंत्र की चोट के लिए कई मानदंड ड्रोसोफिला में स्थापित किया गया है. कुछ हानिकारक परिधीय नसों है कि विंग या एक संवेदी और मोटर axons 2 सहित परिधीय नसों के axotomy साथ चलाने के मिलकर बनता है. हालांकि, परिधीय और केंद्रीय तंत्रिका प्रणाली को कई मायनों में अलग है, और यह सर्वविदित है कि कई जानवरों में परिधीय तंत्रिका तंत्र CNS नहीं कर सकते हैं जबकि पुनर्जीवित कर सकते हैं. इस प्रकार, CNS के लिए CNS उत्थान, प्रत्यक्ष चोट को समझने के लिए अधिक उपयुक्त है. एक सुई के साथ छुरा चोट सफलतापूर्वक ड्रोसोफिला वयस्क मस्तिष्क के लिए लागू किया गया है 3,4 चोट के जवाब की जांच की. एक और दृष्टिकोण का प्रयोग, अयाज एट अल कटे सुसंस्कृत वयस्क दिमाग में एक Piezo शक्ति microdissector के साथ CNS axons, और 4 5 दिनों के लिए उनके उत्थान का विश्लेषण किया. बाद में इन प्रयोगात्मक सेट यू के लाभps है कि वे दिमाग है, जो बेशक महान ब्याज की है पर ध्यान केंद्रित है. नुकसान यह है कि मस्तिष्क VNC, जो मोटर और संवेदी नियंत्रण के साथ ही सौदों की तुलना में एक बहुत अधिक जटिल है. वयस्क दिमाग पर कार्य करना भी अधिक समय लगता है. लार्वा 4 दिनों में प्रयोगों के लिए तैयार है, जबकि यह वयस्क eclosion के लिए 10 दिनों के बारे में लेता है, और फिर उनकी परिपक्वता के लिए अतिरिक्त 5 दिनों. वयस्क मस्तिष्क भी अधिक संभालना मुश्किल है, क्योंकि यह मोटी छल्ली, जो को दूर करने के लिए मुश्किल है में समझाया है. VNC कार्यात्मक हड्डीवाला रीढ़ की हड्डी के बराबर किया जा रहा है की आगे आकर्षण है.
ड्रोसोफिला लार्वा व्यापक रूप से 6-9 तंत्रिका विज्ञान के लिए एक मॉडल जीव के रूप में प्रयोग किया जाता है. हालांकि सख्ती से लार्वा बोल एक विकास के चरण में है, यह भी एक पूरी तरह कार्यात्मक जानवर माना जा सकता है. लार्वा हरकत, स्वाद, गंध और nociception, और सीखने और स्मृति सहित कई होश है. इस प्रकार, लार्वा VNC wCNS चोट के लिए आदर्श मॉडल के रूप में चुना है.
लारवल और पोटा संबंधी VNCs और dissected किया जा सकता है सुसंस्कृत डिश में अभी भी 24 10 घंटा के लिए सेलुलर अखंडता को बनाए रखना है. यह सुझाव दिया है कि चोट VNC, जो तब के लिए समय व्यतीत हो जाने में समय की इस अवधि से अधिक दर्ज किया जा सकता, या सभ्य और किसी भी इस अवधि के भीतर वांछित समय बिंदु पर तय करने के लिए लागू किया जा सकता है.
यहाँ, हम CNS चोट ड्रोसोफिला लार्वा VNC के प्रयोग के लिए एक प्रयोगात्मक प्रतिमान उपस्थित थे. VNC 1 लार्वा से dissected है, और छुरा चोट स्वयं एक टंगस्टन सुई के साथ लागू किया जाता है. VNC तो एक गिलास नीचे coverslip पर रखा जाता है, और समय चूक स्कैनिंग लेजर confocal माइक्रोस्कोपी के साथ फिल्माया. वैकल्पिक रूप से, VNCs समय का एक वांछित अवधि के लिए संवर्धित किया जा सकता है, और चोट के सेलुलर प्रभाव निश्चित immunostaining और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग नमूनों में विश्लेषण किया जा सकता है. घाव क्षेत्र, मापा जा सकता है और सेल परमाणु के मात्रात्मक विश्लेषणmber (सेल प्रसार और कोशिका मृत्यु) जानबूझकर विकसित सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है. बड़े नमूना आकार को आसानी से संभाला जा सकता है सांख्यिकीय मान्य परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप. इन तरीकों में सफलतापूर्वक किया गया है ड्रोसोफिला की शक्तिशाली आनुवंशिकी के साथ संयुक्त करने के लिए एक जीन glial CNS 11 चोट पुनर्योजी प्रतिक्रिया अंतर्निहित नेटवर्क खोज.
हम ड्रोसोफिला लार्वा CNS चोट छुरा चोट, मरम्मत और उत्थान के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है. लारवल VNCs dissected और वार, जिसके बाद वे समय चूक माइक्रोस्कोपी के साथ फिल्माए गए हैं या प्रतिदीप्ति immunostaining के लिए तय glia और न्यूरॉन्स, apoptosis या कोशिका विभाजन की कल्पना कर रहे हैं. समय पर घाव की प्रगति को मापा जा सकता है. इस विधि जानबूझकर चोट पर और मरम्मत के दौरान सेल नंबर में परिवर्तन की मात्रात्मक और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए विकसित सॉफ्टवेयर के साथ है.
हम 96 घंटे AEL (और इन या तय किया गया और आगे विकसित करने की अनुमति दी है) लार्वा, और फिर वयस्क मक्खी प्यूपा संक्रमण के लिए पहले एक विकास मंच के छुरा घोंपा. 96 घंटा, VNCs छुरा के लिए काफी बड़ी हैं, वे 3 instar मंच के बीच में हैं, और इस तरह के दौर से गुजर रहे हैं अभी तक नहीं प्यूपीकरण, और तंत्रिका तंत्र पहले से ही पूरी तरह से विज्ञापन के लिए कार्यात्मक इसी तरहult. यह थोड़ा बाद लार्वा में वार करने के लिए संभव हो सकता है और सटीक समय अनुसंधान प्रश्न के अनुरूप करने के लिए चुना जाना चाहिए. हालांकि, संबोधित प्रश्नों पर निर्भर करता है, यह आम तौर पर कुछ समय के लिए चोट करने के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पालन VNCs संस्कृति के लिए आवश्यक हो जाएगा. 120 घंटा AEL प्यूपीकरण के बाद शुरू होता है कुछ समय, एक समय था जब CNS remodeled है और इस तरह सबसे अच्छा बचा है. इस प्रकार लार्वा में प्लस संस्कृति छुरा के लिए समय खिड़की बल्कि प्रतिबंधित है. लार्वा का प्रयोग अभी भी वयस्कों का उपयोग करने पर एक महान तकनीकी लाभ: इसी तरह वयस्क के लिए whilst, तंत्रिका तंत्र पहले से ही पूरी तरह कार्यात्मक, चोट के जवाब का विश्लेषण करने में काफी आसान है और लार्वा में तेजी है.
जब और दिमाग और विच्छेदित और एक बराबर संवर्धन के बिना एक थाली में बाद के समय बिंदु पर dissected VNCs एक डिश में संवर्धित VNCs के आकार आकारिकी की तुलना, यह प्रतीत होता है कि विकास संस्कृति में vivo में की तुलना में धीमी है. अन्य मामलों में,विकास संस्कृति में आम तौर पर, ऊतक अखंडता संरक्षित है और कोशिकाओं को जीवित कई प्रतिक्रियाएं दिखा रहे हैं पर किया जाता है. घाव विस्तार, neuropile मरम्मत और glial प्रसार 22 घंटा के बाद छुरा के भीतर जगह ले लो. इससे पता चलता है कि चोट के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं संस्कृति में जगह लेने के लिए और सबसे अधिक संभावना नहीं करने के लिए एक दिन से अधिक समय के लिए explants को बनाए रखने की जरूरत है. अगर लंबी अवधि के संस्कृति वांछित थे, प्रोटोकॉल आगे एक संस्कृति प्लेट 5 डालने का उपयोग कर के रूप में अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
यह degenerating लोगों से अच्छी गुणवत्ता के नमूनों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल का अनुकूलन कुछ कौशल लेता है और अनिवार्य रूप से कुछ नमूनों में अध: पतन हो जाएगा. VNC एक 'फूलगोभी' उपस्थिति है कि ऊतक अखंडता (चित्रा 5 ब) की एक टूटने को दर्शाता है प्राप्त कर सकते हैं. छुरा, अध: पतन भी VNC के vacuolization की स्वतंत्र रूप से मान्यता प्राप्त है जो बरकरार, गैर छुरा घोंपा नमूनों में मौजूद हो सकता है (चित्रा 5C कर सकते हैं </strong>). इन नमूनों को खारिज कर दिया जाना चाहिए. अध: पतन सबसे अधिक संभावना मोटा विच्छेदन, जो नसों और सतह glia की सुरक्षात्मक परत फाड़ कर सकते हैं की वजह से है. इस प्रकार महान देखभाल करने के लिए धीरे टुकड़े करना करने के लिए लिया जाना चाहिए. अन्य कारकों को प्रभावित संस्कृति के माध्यम है, जो स्वच्छ रखा जाना चाहिए और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ washes और समय के रूप में प्रोटोकॉल में संकेत करने के लिए सख्ती से पालन शामिल हैं. अंत में, सुई और सुई धारक, सुई का आकार और तीखेपन की लंबाई बहुत महत्वपूर्ण हैं. सुई धारक मध्यम संस्कृति को दूषित और एक कुंद सुई एक बड़ी चोट है कि खुद की मरम्मत नहीं कर सकते हैं और अध: पतन के लिए नेतृत्व करेंगे कारण हो सकती है. यह महत्वपूर्ण है के लिए नियमित रूप सुई तेज बनाए रखने के.
इस प्रोटोकॉल में, हम मक्खियों के एक प्रोटीन ट्रापलाइन glial पारंपरिक प्रणाली GAL4 यूएएस का उपयोग करने की प्रक्रिया के दृश्य करने के लिए समानांतर में neuropile कल्पना का फायदा उठाया. ये उपकरण भी अन्य बाइनरी ऐसे Le रूप में अभिव्यक्ति प्रणालियों के साथ संयुक्त किया जा सकता हैXa 19 और 20 क्यू – प्रणाली, जो GAL4 से स्वतंत्र हैं. इस चोट के जवाब में axons और glial प्रक्रियाओं के बीच उदाहरण के लिए बातचीत का विश्लेषण, सक्षम होगा. आगे यह 21 dendrites या कैल्शियम 22 आमद के लिए पत्रकारों के रूप में अन्य आनुवंशिक उपकरण के साथ संयोजन के द्वारा, इस विधि glial कोशिकाओं, neuronal axons और CNS में dendrites की चोट की प्रतिक्रिया के पीछे कोशिका जीव विज्ञान के विश्लेषण के लिए एक महान अवसर प्रदान करता है. अंत में, इस विधि के मानक आनुवंशिकी, परिवर्तन और जीन की अभिव्यक्ति के साथ संयुक्त किया जा सकता है, चोट और उत्थान के लिए प्रतिक्रिया में जीन समारोह का परीक्षण करने के लिए.
इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक एक जीन पुनर्योजी CNS 11 चोट glial प्रतिक्रिया अंतर्निहित नेटवर्क की खोज करने के लिए प्रेरित किया है. जीन समारोह की विकासवादी संरक्षण को देखते हुए, इन सेलुलर घटनाओं और फल मक्खियों में जीन कार्य unraveling माँ की समझ में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की संभावना हैmmalian CNS चोट और उत्थान के लिए प्रतिक्रिया.
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और इस काम के पाठ्यक्रम में उनके विचार – विमर्श के लिए हमारी प्रयोगशाला के अन्य सदस्यों के लिए मेई एन लिम धन्यवाद. यह काम यामादा विज्ञान फाउंडेशन और रॉयल सोसाइटी छोटी यात्रा फैलोशिप और यूरोपीय संघ मैरी क्यूरी इंटरनेशनल इनकमिंग फैलोशिप के.के. GRR, और बीबीएसआरसी परियोजना अनुदान (BB/H002278/1) और वेलकम ट्रस्ट उपकरण अनुदान (073228/Z/03/Z) द्वारा वित्त पोषित किया गया था आह
Equipment | |||
Staining block | Brunel Microscope | ||
Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
Reagent | |||
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
FBS | Sigma | F7524 | |
Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |