En skade paradigmet med Drosophila larve ventrale nerve ledningen for å undersøke sentrale nervesystemet regenerering og reparasjon er beskrevet. Knivstikking etterfulgt av laserskanning konfokalmikroskopi i time-lapse og faste prøver, kombinert med kvantitativ analyse med målrettet utviklet programvare og genetikk, brukes til å undersøke de molekylære mekanismene for CNS regenerering og reparasjon.
En eksperimentell metode er utviklet for å undersøke cellulære responser til sentralnervesystemet (CNS) skade ved hjelp av frukt-fly Drosophila. Forstå reparasjon og regenerering i dyr er et viktig spørsmål i biologi. Den skadede mennesker CNS ikke regenerere ikke, og forstå hvordan man skal fremme regenerering er en av de viktigste målene for medisinsk nevrovitenskap. Den kraftige genetiske verktøykasse av Drosophila kan brukes til å takle problemet med CNS regenerasjon.
En lesjon til CNS ventral nerve ledningen (VNC, tilsvarende virveldyr ryggmargen) brukes manuelt med en tungsten nål. VNC kan senere bli filmet i time-lapse ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi for opp til 24 timers å følge utviklingen av lesjon over tid. Alternativt kan det dyrkes, deretter fast og farget med immunfluorescens å visualisere nevroner og gliaceller med konfokal mikroskopi. Ved hjelp av egnede markører, changes i celle morfologi og celle staten som følge av skade kan visualiseres. Med ImageJ og hensikt utviklet plug-ins, kan kvantitative og statistiske analyser utføres for å måle endringer i såret størrelse over tid og effekten av skader i celleproliferasjon og celledød. Disse metodene tillater analyse av store utvalgsstørrelser. De kan kombineres med de kraftige genetikk Drosophila å undersøke de molekylære mekanismene bak CNS regenerering og reparasjon.
Regenerering i dyr viser at cellene følelse når organismevekst er bestilt og komplett, og hvor strukturell integritet av en organisme er oppnådd og opprettholdt. Forstå disse mystiske evner celler er av stor interesse for biologi. Fremme gjenfødelse er en av de viktigste målene for medisinsk nevrovitenskap. Hos mennesker, ikke skadede sentralnervesystemet (CNS) ikke forsterkes. Gnagermodeller av ryggmargsskader brukes til å forstå hvordan cellene reagerer til skade. Men etiske hensyn, høye kostnader og det langsomme livet syklus av dyrene begrense fremgang.
Frukten-fly Drosophila er en mye brukt modell organisme i utviklingsbiologi og nevrovitenskap. Takket være den kraftige genetiske verktøy og kort livssyklus, har Drosophila recurrently førte til oppdagelsen av genet funksjoner og genet nettverk med relevans for forståelsen av mennesker og sykdom. Det er rikelig dokumentasjon av evolusjonære conbevaring av gen-funksjon mot fluer til mennesker.
De siste årene har flere paradigmer for nervesystemet skade etablert i Drosophila. Noen består av skade perifere nerver som går langs vingen eller axotomy av perifere nerver, inkludert sensoriske 1 og motor aksoner 2. Imidlertid, det perifere og sentrale nervesystem skiller seg på mange måter, og det er godt kjent at i mange dyr det perifere nervesystemet kan regenerere mens CNS kan ikke. Derfor, for å forstå CNS regenerering, direkte skade til CNS er mer hensiktsmessig. Stikkende skade med en nål har blitt brukt til Drosophila voksen hjerne å undersøke responsen til skade 3,4. Bruk en annen tilnærming, analysert Ayaz et al. Avkuttede CNS axoner i dyrkede voksne hjerner med en Piezo makt microdissector, og deres regenerering for 4 dager 5. Fordelen med disse senere eksperimentelle oppsettet ups er at de fokuserer på hjernen, som er utvilsomt av stor interesse. Ulempen er at hjernen er mye mer kompleks enn den VNC, som omhandler kun med motor og sensoriske kontroll. Arbeid på den voksne hjernen er også mer tidkrevende. Larven er klar for eksperimenter i 4 dager, mens det tar ca 10 dager for voksen eclosion, og deretter ytterligere 5 dager for modning deres. Den voksne hjernen er også mer vanskelig å håndtere, fordi det er innkapslet i tykk skjellaget, som er vanskelig å fjerne. VNC har ytterligere tiltrekningen av å være funksjonelt likeverdig med det virveldyr ryggmargen.
Drosophila larve er mye brukt som modell organisme for nevrovitenskap 6-9. Selv strengt tatt larven er i en utviklingsfase, kan det også bli betraktet som en fullt funksjonell dyr. Larven har locomotion, flere sanser inkludert luktesans, smak og nociception, og læring og hukommelse. Dermed larve VNC wsom valgt som den ideelle modellen for CNS skade.
Larver og pupal VNCs kan dissekert og dyrket i parabolen, fremdeles beholder mobilnettet integritet for opp til 24 hr 10. Dette antydet at skaden kan brukes til VNC, som deretter kunne registreres i time-lapse for over denne perioden, eller kultivert og fast på en hvilken som helst ønsket tidspunkt i denne perioden.
Her presenterer vi en eksperimentell paradigme for CNS skade ved hjelp av Drosophila larve VNC. VNC er først dissekert fra larve, og knivstikking skade påføres manuelt med en tungsten nål. VNC er deretter plassert på et glass-bunn dekkglass, og filmet med time-lapse laserskanning konfokalmikroskopi. Alternativt kan VNCs dyrkes for en ønsket tidsperiode, og de cellulære effekter av skader kan bli analysert i faste prøver hjelp farging og konfokalmikroskopi. Sårområdet kan måles, og kvantitativ analyse av celle Number (celleproliferasjon og celledød) kan utføres med hensikt utviklet programvare. Store utvalgsstørrelser lett kan håndteres, som resulterer i statistisk validerte resultater. Disse metodene har blitt kombinert med den kraftige genetikk Drosophila å oppdage et gen nettverk underliggende glial regenerativ respons til CNS skade 11.
Vi har etablert en protokoll for knivstikking skade på Drosophila larve CNS å undersøke cellulære responser til skade, reparasjon og regenerering. Larve VNCs er dissekert og knivstukket, etter som de er filmet med time-lapse mikroskopi eller fast for fluorescens farging å visualisere gliaceller og nevroner, apoptose eller celledeling. Progresjonen av lesjonen over tid kan måles. Denne metoden er ledsaget av hensikt utviklet programvare for kvantitativ og statistisk analyse av celle nummer endres ved skader og under reparasjon.
Vi stakk 96-timers AEL larver (og disse ble enten fast eller lov til å utvikle seg videre), en utviklingsstadiet før overgangen til puppe og deretter voksen flue. Ved 96 timers, VNCs er store nok for knivstikking, de er i midten av tredje instar stadiet, og dermed er ikke gjennomgår forpupping enda; og nervesystemet er allerede fullt funksjonell lik som annonsenult. Det kan være mulig å stikke litt senere i larver og presis timing må velges for å passe på problemstillingen. Imidlertid, avhengig av behandlet spørsmål, vil det generelt være nødvendig å kultur skiller VNCs i noen tid å observere cellulære responser til skade. En tid etter 120 timers AEL forpupping starter, en periode da CNS er remodeled og er dermed best unngås. Således tidsvinduet for knivstikking pluss kultur i larven er ganske begrenset. Bruke larver har fortsatt en stor teknisk fremfor å bruke voksne: mens, på samme måte som den voksne, er nervesystemet allerede fullt funksjonell, analyserer svaret til skade betydelig enklere og raskere i larver.
Når man sammenligner størrelsen og morfologien til hjerner og VNCs dissekert og dyrket i en rett til VNCs som dissekeres ved en tilsvarende senere tidspunkt uten dyrking i et fat, synes det som utvikling er tregere i kultur enn in vivo. I andre henseender,utvikling utøver normalt i kultur, er vevet integritet bevares og celler er i live viser flere svar. Wound ekspansjon, neuropile reparasjon og glial spredning skje innen 22 timer etter knivstikking. Dette viser at cellulære responser til skade skje i kultur, og det er mest sannsynlig ikke nødvendig å opprettholde eksplanter lenger enn en dag. Hvis lengre sikt kultur ble ønsket kan protokollen kreve ytterligere optimalisering som bruker en dyrkingsplate innsats 5.
Det er viktig å identifisere gode eksempler fra degenereres seg. Optimalisere denne protokollen tar litt dyktighet og uunngåelig degenerasjon vil skje i noen eksemplarer. VNC kan kjøpe en "blomkål" utseende som reflekterer et sammenbrudd av vev integritet (figur 5B). Degenerasjon er også anerkjent av vacuolization av VNC uavhengig av stikkende, som kan være til stede i intakte, ikke-knivstukket prøver (figur 5C </strong>). Disse prøvene må kasseres. Degenerasjon er mest sannsynlig forårsaket av grov disseksjon, som kan rive nerver og den beskyttende lag av overflaten gliaceller. Dermed stor forsiktighet må tas for å dissekere forsiktig. Andre påvirkende faktorer er kultur medium, som må holdes rent og med antibiotika, følger strengt til vasker og timing som angitt i protokollen. Endelig, lengden av nålen og nålholderen, størrelse og skarphet av nålen er meget viktig. Nålholderen kan forurense dyrkningsmediet og en stump nål kan føre til en stor skade som ikke kan reparere seg selv og vil føre til degenerasjon. Det er viktig å opprettholde rutinemessig nålen skarp.
I denne protokollen, tok vi fordel av et protein felle linje av fluer å visualisere neuropile parallelt med visualisering av glial prosesser ved hjelp av den tradisjonelle GAL4-UAS systemet. Disse verktøyene kan også kombineres med andre binære ekspresjonssystemer som LexA 19 og Q-system 20, som er uavhengige av GAL4. Dette ville muliggjøre analysen av interaksjoner for eksempel mellom axoner og glial prosesser, i respons på skade. Ved ytterligere kombinere det med andre genetiske verktøy som reportere for dendritter 21 eller kalsium tilstrømningen 22, gir denne metoden en flott mulighet til å analysere cellebiologi bak skaden respons gliacellene, nevrale aksoner og dendritter i CNS. Endelig, kan denne metoden kombineres med standard genetikk, mutasjoner og over-ekspresjon av gener, for å teste genfunksjon i responser på skade og regenerering.
Denne protokollen har stor suksess ledet til oppdagelsen av et gen nettverk underliggende regenerativ glial respons på CNS skade 11. Gitt den evolusjonære bevaring av gen-funksjon, unraveling disse cellulære hendelser og genfunksjoner i frukt-fluer er sannsynlig å gi betydelige innsikt i forståelsen av mammalian CNS respons på skade og regenerering.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Mei Ann Lim for kritisk lesning av manuskriptet og andre medlemmer av vår lab for sine diskusjoner i løpet av dette arbeidet. Dette arbeidet ble finansiert av Yamada Science Foundation og Royal Society kort besøk Fellowships og EU Marie Curie International Incoming Fellowship GRR til KK, og BBSRC Project Grant (BB/H002278/1) og Wellcome Trust Equipment Grant (073228/Z/03/Z) til AH
Equipment | |||
Staining block | Brunel Microscope | ||
Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
Reagent | |||
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
FBS | Sigma | F7524 | |
Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |