중추 신경계 재생 및 수리를 조사 Drosophila 애벌레의 복부 신경 코드를 사용하여 부상 패러다임이 설명되어 있습니다. 의도적으로 개발 한 소프트웨어 및 유전학과 정량 분석과 함께 시간 경과 및 고정 표본에서 공 촛점 현미경을 스캔 레이저, 다음 찌른 곳은 CNS 재생 및 수리의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다.
실험 방법은 과일 플라이 Drosophila를 사용하여 중추 신경 시스템 (CNS) 부상에 대한 세포 반응을 조사하기 위해 개발되었습니다. 동물의 이해 수리 및 재생이 생물학에서 중요한 질문입니다. 손상된 인간의 CNS는 재생하고 재생을 촉진하는 방법을 이해하는 것은 의료 신경 과학의 주요 목표 중 하나입니다하지 않습니다. Drosophila의 강력한 유전자 툴킷은 CNS 재생의 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다.
CNS 복부 신경 코드 (VNC, 척추 척추에 해당)에 병변은 텅스텐 바늘로 수동으로 적용됩니다. VNC는 이후 시간이 지남에 따라 병변의 발전을 따라 최대 24 시간까지에 대한 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경을 사용하여 시간 경과에 촬영 할 수 있습니다. 또한,이 후 고정 및 공 촛점 현미경으로 신경 세포와 glial 세포를 시각화 할 수 immunofluorescence 사용하는 물들, 배양 할 수 있습니다. 차는 적절한 마커를 사용하여부상의 결과로 세포 형태학 및 세포 상태에서 nges는 시각화 할 수 있습니다. ImageJ를 사용하여 의도적으로 개발 된 플러그인은 양적 및 통계 분석은 시간과 세포 증식 및 세포 사망의 부상의 영향으로 상처 크기의 변화를 측정하기 위해 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 큰 샘플 크기의 분석을 할 수 있습니다. 그들은 CNS 재생 및 수리의 기초 분자 메커니즘을 조사 할 Drosophila의 강력한 유전자와 결합 할 수 있습니다.
동물의 재생은 세포가 유기체의 성장은 주문과 완벽한 때 감지하는 방법과 구조 무결성 유기체의 달성 및 유지되는 공개한다. 세포의 이러한 신비한 능력을 이해하는 것은 생물학에 큰 관심입니다. 재생을 홍보하는 의료 신경 과학에 대한 주요 목표 중 하나입니다. 인간에서 손상된 중추 신경계 (CNS)는 재생되지 않습니다. 척추 손상의 설치류 모델은 세포가 부상에 대응 방법을 이해하는 데 사용됩니다. 그러나, 윤리적 문제, 높은 비용과 동물의 느린 라이프 사이클이 진행을 제한합니다.
과일 플라이 Drosophila는 발달 생물학, 신경 과학에서 널리 사용되는 모델 생물이다. 강력한 유전자 도구와 짧은 수명주기 덕분에 Drosophila는 recurrently 인간과 질병의 이해에 대한 관련성이 유전자 기능 및 유전자 네트워크의 발견하게되었다. 진화 사기의 풍부한 증거가있어인간과 파리에서 유전자 기능의 servation.
최근 몇 년 동안, 신경계 손상에 대한 몇 가지 패러다임은 Drosophila 년에 설립되었습니다. 일부 감각 1과 모터 axons이 포함 주변 신경의 날개 axotomy 함께 실행 주변 신경을 손상 구성되어 있습니다. 그러나, 주변 장치 및 중앙 신경 시스템은 여러 측면에서 차이가 있으며, 이곳은 많은 동물에서 말초 신경계는 CNS 수 없다 반면 재생 할 수있는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 CNS로 CNS 재생, 직접 부상을 이해하는 것은 더 적합합니다. 바늘로 찔러 부상이 성공적으로 부상 3,4에 대한 응답을 조사하기 Drosophila 성인의 뇌에 적용되었습니다. 또 다른 접근 방식을 사용하여, Ayaz 외. 절단 CNS의 압전 전력 microdissector있는 교양 성인 뇌의 axons과는 4 일 5의 재생을 분석했다. 이 후 실험 세트 U의 장점PS는 큰 관심 의심 할 여지없이이 뇌에 초점을 것입니다. 단점은 뇌는 모터와 감각 컨트롤과 거래하는 VNC보다 훨씬 더 복잡 것입니다. 성인 뇌에서 일하는 것은 더 많은 시간이 소요됩니다. 이 성인 eclosion 10 일 정도 소요되며, 그 다음은 성숙에 대한 추가 오일 반면, 유충은 4 일 실험에 대한 준비가되었습니다. 이 제거하기 어려운 두꺼운 표피에 캡슐화되어 있기 때문에 성인 뇌는 처리도 더 어렵습니다. VNC는 척추 척추에 기능적으로 동등한 존재의 더 매력이 있습니다.
Drosophila의 유충이 널리 신경 6-9의 모델 생물로 사용됩니다. 엄격히 애벌레를 사용하는 것은 발달 단계에 있지만, 그것은 또한 모든 기능 동물로 간주 될 수 있습니다. 유충은 후각, 미각과 nociception, 그리고 학습과 기억 등의 운동, 여러 감각이 있습니다. 따라서 애벌레의 VNC w로 CNS의 부상을위한 이상적인 모델로 선택되었습니다.
애벌레의와 pupal VNCs은 여전히 최대 24 시간 10에 대한 세포의 무결성을 유지, 접시에 해부하고 배양 할 수 있습니다. 이것은 부상 후 시간이 기간 동안 시간 경과에 기록, 또는이 기간 내에 원하는 시점에서 배양하여 해결 될 수있는 VNC에 적용 할 수있는 제안했습니다.
여기, 우리는 Drosophila 애벌레의 VNC를 사용하여 CNS의 부상에 대한 실험 패러다임을 제시한다. VNC 먼저 유충 분석하던 있으며, 찔러 부상은 텅스텐 바늘로 수동으로 적용됩니다. VNC는 다음 유리 바닥 coverslip에 배치하고, 공 촛점 현미경을 스캔 시간 경과 레이저로 촬영하고 있습니다. 또는 VNCs은 시간의 목표 기간 동안 배양 될 수 있으며, 부상의 세포 효과는 immunostaining 및 공 촛점 현미경을 사용하여 고정 표본에서 분석 할 수 있습니다. 상처 지역은 측정 및 셀 뉴의 정량 분석 할 수 있습니다mber은 (세포 증식 및 세포 죽음) 의도적으로 개발 한 소프트웨어로 수행 할 수 있습니다. 대형 샘플 크기는 쉽게 통계적 검증 결과의 결과로, 처리 할 수 있습니다. 이러한 방법이 성공적으로 CNS 부상 11 glial 재생 응답을 근간 유전자 네트워크를 발견 Drosophila의 강력한 유전자와 결합되었습니다.
우리는 상해, 수리 및 재생에 세포 반응을 조사하기 Drosophila 애벌레의의 CNS에 부상을 찔러 죽이고는 사죄하기 위해 프로토콜을 구축했습니다. 애벌레의 VNCs가 해부하고이 시간 경과 현미경으로 촬영 또는 glia 뉴런, apoptosis 또는 세포 분열을 시각화하는 형광 immunostaining에 고정 된 후, 칼에 찔 있습니다. 시간이 지남에 따라 병변의 진행을 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 부상시 및 수리시 휴대폰 번호 변경 정량 및 통계 분석을 위해 의도적으로 개발 한 소프트웨어와 함께합니다.
우리는 전에 번데기 후 성인 플라이로의 전환에 96 시간 AEL의 애벌레 (및 해당이 중 고정이나 추가 개발 할 수 있었다), 발달 단계를 칼로 찔렀어요. 그들은 셋째 instar 무대의 중앙에 있으며, 따라서 아직 pupation을 진행하지 않습니다; 96 시간에서 VNCs은 자상만큼 넓으며 신경계 이미 광고의 그것과 완전히 기능과 유사합니다ult. 그것은 약간 나중에 애벌레의 자상 가능한 될 수 있으며 정확한 타이밍은 연구 문제에 맞게 선택해야합니다. 그러나, 해결 질문에 따라, 그것은 일반적으로 부상을 세포 반응을 관찰 할 시간을 문화 VNCs을 위해 필요한 것입니다. 120 시간 AEL의 pupation이 시작 후 몇 시간, 기간은 CNS는 리모델링하고 때 따라서 가장 피해야합니다. 따라서 유충에 플러스 문화를 찔러에 대한 시간 창이 오히려 제한됩니다. 애벌레를 사용하면 여전히 성인을 사용하는 동안 훌륭한 기술 장점이 있습니다 : 마찬가지로 어른까지하면서, 신경 시스템은 부상에 대한 응답을 분석, 이미 애벌레에서 상당히 빠르고 쉽게 모든 기능이다.
접시에 배양없이 동등한 나중에 지점에서 해부하는 아르 VNCs에 접시에 해부 및 배양 두뇌와 VNCs의 크기와 형태를 비교했을 때, 그 개발은 생체에 비해 문화 느립니다 나타납니다. 다른면에서,개발은 정상적으로 문화, 조직 무결성이 보존되어 있으며 세포가 살아 여러 답변을 게재를 수행합니다. 상처 확장, neuropile 수리와 glial 확산은 22 시간이 포스트 찔러에서 열립니다. 이 부상 세포 응답이 문화에서 개최하고 하루 이상의 explants을 유지하기 위해 필요없이 가장 가능성이 있다는 것을 보여줍니다. 장기적 문화 원하는 된 경우, 프로토콜은 문화 판 삽입 5를 사용 등의 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
이 degenerating의 부분에서 양질의 샘플을 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 최적화하는 몇 가지 기술을 소요 필연적으로 변성 일부 표본에 발생합니다. VNC는 조직의 무결성의 세부 (그림 5B)를 반영하는 '콜리 플라워'모양을 취득 할 수 있습니다. 변성도의 독립적 VNC의 vacuolization 인정되는 (그림 5C 그대로가 아닌 칼에 찔 표본에 존재 할 수있는 찔러 </str긴 사연>). 이러한 샘플은 폐기해야합니다. 변성은 대부분 신경과 표면 glia의 보호 층을 찢어 놓을 수도 있고 거친 절개에 의해 발생합니다. 따라서 큰주의를 부드럽게 해부로 이동합니다. 다른 영향을 미치는 요소는 프로토콜에 나와있는 세차와 타이밍에 엄격하게 준수 깨끗한 보관하고 항생제로해야 문화 매체를 포함. 마지막으로, 바늘의 바늘과 바늘 홀더, 크기 및 선명도의 길이는 매우 중요합니다. 바늘 홀더 (Holder)는 문화 매체를 오염시킬 수 있으며 무딘 바늘 자체를 복구 할 수 있으며 퇴행으로 이어질 큰 부상을 입을 수 있습니다. 그것은 정기적으로 바늘 날카로운 유지하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 기존의 GAL4-UAS 시스템을 사용 glial 프로세스의 시각화에 병렬로 neuropile을 시각화하기 위해 파리의 단백질 트랩 라인을 이용했다. 이 도구는 또한 르와 같은 다른 바이너리 표현 시스템과 결합 될 수GAL4 무관 XA 19 Q-시스템 (20). 이 부상에 대한 응답으로, axons와 glial 프로세스간에 예를 들어 상호 작용의 분석을 활성화합니다. 추가로 이러한 수석 21 칼슘 유입 22 기자와 같은 다른 유전 도구와 함께 결합하여,이 방법은 glial 세포, neuronal axons과 CNS의 수석의 부상 응답 뒤에 세포 생물학을 분석 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 마지막으로,이 방법은 부상과 재생에 대한 답변에 유전자 기능을 테스트하기 위해, 표준 유전학, 돌연변이와 유전자의 이상 표현과 결합 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 성공적으로 CNS의 부상 11 재생 glial 응답을 근간 유전자 네트워크의 발견하게되었다. 이러한 셀룰러 이벤트와 과일 파리의 유전자 기능을 분열 유전자 기능의 진화 보존 주어진 것은 mA의 이해에 중요한 통찰력을 제공 할 가능성이부상 및 재생 속도 mmalian CNS는 반응.
The authors have nothing to disclose.
우리는 원고의 중요한 읽기와이 작품의 과정에 걸쳐 자신의 토론에 대한 실험실의 다른 회원들에게 메이 앤 임 감사드립니다. 이 작품은 야마다 과학 재단 (NSF)과 로얄 학회 단기 방문 휄로 십과 KK에 대한 EU 마리 퀴리 국제 수신 휄로 십 그래, 난 및 BBSRC 프로젝트 기금 (BB/H002278/1)와 웰컴 트러스트 장비 기금 (073228/Z/03/Z)에 의해 재정 지원되었다 AH로
Equipment | |||
Staining block | Brunel Microscope | ||
Forceps No. 5 | e.g. Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
Reagent | |||
Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
FBS | Sigma | F7524 | |
Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 |