Summary
중추 신경계 재생 및 수리를 조사 Drosophila 애벌레의 복부 신경 코드를 사용하여 부상 패러다임이 설명되어 있습니다. 의도적으로 개발 한 소프트웨어 및 유전학과 정량 분석과 함께 시간 경과 및 고정 표본에서 공 촛점 현미경을 스캔 레이저, 다음 찌른 곳은 CNS 재생 및 수리의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다.
Abstract
실험 방법은 과일 플라이 Drosophila를 사용하여 중추 신경 시스템 (CNS) 부상에 대한 세포 반응을 조사하기 위해 개발되었습니다. 동물의 이해 수리 및 재생이 생물학에서 중요한 질문입니다. 손상된 인간의 CNS는 재생하고 재생을 촉진하는 방법을 이해하는 것은 의료 신경 과학의 주요 목표 중 하나입니다하지 않습니다. Drosophila의 강력한 유전자 툴킷은 CNS 재생의 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다.
CNS 복부 신경 코드 (VNC, 척추 척추에 해당)에 병변은 텅스텐 바늘로 수동으로 적용됩니다. VNC는 이후 시간이 지남에 따라 병변의 발전을 따라 최대 24 시간까지에 대한 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경을 사용하여 시간 경과에 촬영 할 수 있습니다. 또한,이 후 고정 및 공 촛점 현미경으로 신경 세포와 glial 세포를 시각화 할 수 immunofluorescence 사용하는 물들, 배양 할 수 있습니다. 차는 적절한 마커를 사용하여부상의 결과로 세포 형태학 및 세포 상태에서 nges는 시각화 할 수 있습니다. ImageJ를 사용하여 의도적으로 개발 된 플러그인은 양적 및 통계 분석은 시간과 세포 증식 및 세포 사망의 부상의 영향으로 상처 크기의 변화를 측정하기 위해 수행 할 수 있습니다. 이 방법은 큰 샘플 크기의 분석을 할 수 있습니다. 그들은 CNS 재생 및 수리의 기초 분자 메커니즘을 조사 할 Drosophila의 강력한 유전자와 결합 할 수 있습니다.
Introduction
동물의 재생은 세포가 유기체의 성장은 주문과 완벽한 때 감지하는 방법과 구조 무결성 유기체의 달성 및 유지되는 공개한다. 세포의 이러한 신비한 능력을 이해하는 것은 생물학에 큰 관심입니다. 재생을 홍보하는 의료 신경 과학에 대한 주요 목표 중 하나입니다. 인간에서 손상된 중추 신경계 (CNS)는 재생되지 않습니다. 척추 손상의 설치류 모델은 세포가 부상에 대응 방법을 이해하는 데 사용됩니다. 그러나, 윤리적 문제, 높은 비용과 동물의 느린 라이프 사이클이 진행을 제한합니다.
과일 플라이 Drosophila는 발달 생물학, 신경 과학에서 널리 사용되는 모델 생물이다. 강력한 유전자 도구와 짧은 수명주기 덕분에 Drosophila는 recurrently 인간과 질병의 이해에 대한 관련성이 유전자 기능 및 유전자 네트워크의 발견하게되었다. 진화 사기의 풍부한 증거가있어인간과 파리에서 유전자 기능의 servation.
최근 몇 년 동안, 신경계 손상에 대한 몇 가지 패러다임은 Drosophila 년에 설립되었습니다. 일부 감각 1과 모터 axons이 포함 주변 신경의 날개 axotomy 함께 실행 주변 신경을 손상 구성되어 있습니다. 그러나, 주변 장치 및 중앙 신경 시스템은 여러 측면에서 차이가 있으며, 이곳은 많은 동물에서 말초 신경계는 CNS 수 없다 반면 재생 할 수있는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 CNS로 CNS 재생, 직접 부상을 이해하는 것은 더 적합합니다. 바늘로 찔러 부상이 성공적으로 부상 3,4에 대한 응답을 조사하기 Drosophila 성인의 뇌에 적용되었습니다. 또 다른 접근 방식을 사용하여, Ayaz 외. 절단 CNS의 압전 전력 microdissector있는 교양 성인 뇌의 axons과는 4 일 5의 재생을 분석했다. 이 후 실험 세트 U의 장점PS는 큰 관심 의심 할 여지없이이 뇌에 초점을 것입니다. 단점은 뇌는 모터와 감각 컨트롤과 거래하는 VNC보다 훨씬 더 복잡 것입니다. 성인 뇌에서 일하는 것은 더 많은 시간이 소요됩니다. 이 성인 eclosion 10 일 정도 소요되며, 그 다음은 성숙에 대한 추가 오일 반면, 유충은 4 일 실험에 대한 준비가되었습니다. 이 제거하기 어려운 두꺼운 표피에 캡슐화되어 있기 때문에 성인 뇌는 처리도 더 어렵습니다. VNC는 척추 척추에 기능적으로 동등한 존재의 더 매력이 있습니다.
Drosophila의 유충이 널리 신경 6-9의 모델 생물로 사용됩니다. 엄격히 애벌레를 사용하는 것은 발달 단계에 있지만, 그것은 또한 모든 기능 동물로 간주 될 수 있습니다. 유충은 후각, 미각과 nociception, 그리고 학습과 기억 등의 운동, 여러 감각이 있습니다. 따라서 애벌레의 VNC w로 CNS의 부상을위한 이상적인 모델로 선택되었습니다.
애벌레의와 pupal VNCs은 여전히 최대 24 시간 10에 대한 세포의 무결성을 유지, 접시에 해부하고 배양 할 수 있습니다. 이것은 부상 후 시간이 기간 동안 시간 경과에 기록, 또는이 기간 내에 원하는 시점에서 배양하여 해결 될 수있는 VNC에 적용 할 수있는 제안했습니다.
여기, 우리는 Drosophila 애벌레의 VNC를 사용하여 CNS의 부상에 대한 실험 패러다임을 제시한다. VNC 먼저 유충 분석하던 있으며, 찔러 부상은 텅스텐 바늘로 수동으로 적용됩니다. VNC는 다음 유리 바닥 coverslip에 배치하고, 공 촛점 현미경을 스캔 시간 경과 레이저로 촬영하고 있습니다. 또는 VNCs은 시간의 목표 기간 동안 배양 될 수 있으며, 부상의 세포 효과는 immunostaining 및 공 촛점 현미경을 사용하여 고정 표본에서 분석 할 수 있습니다. 상처 지역은 측정 및 셀 뉴의 정량 분석 할 수 있습니다mber은 (세포 증식 및 세포 죽음) 의도적으로 개발 한 소프트웨어로 수행 할 수 있습니다. 대형 샘플 크기는 쉽게 통계적 검증 결과의 결과로, 처리 할 수 있습니다. 이러한 방법이 성공적으로 CNS 부상 11 glial 재생 응답을 근간 유전자 네트워크를 발견 Drosophila의 강력한 유전자와 결합되었습니다.
Protocol
1. 의 컬렉션은 애벌레를 꾸 몄던
- 장소 15 여성과 원통형 Perspex 케이지 15 남성 성인 파리는 25에서 3 시간에 붙여 넣으 효모의 작은 주걱 ° C.와 보충 한천과 포도 주스를 페트리 접시에 알을 낳기 위해 하루 플레이트에게 3-4 회를 변경하고, 첫 번째 판을 (O / N 계란 레이에서 IE) 폐기합니다. 또한 첫 날부터 접시를 폐기하십시오. 두 번째 날부터 25 계란 ° C.로 접시를 유지 달걀을 수집 후 7 일 후, 새로운 부모 파리의 설정으로 시작합니다.
- 후 약 24 시간, 알에서 유충이 부화. 얇게 붓이나 포셉 한 쌍의와 애벌레에 훅을 넣었으로 포도 한천에서 표준 플라이 음식 (10 ml) 쇼핑 (그림 1A)를 포함하는 유리 병에 35 애벌레를 전송할 수 있습니다.
- 25 3 일간 애벌레 (달걀 부설 후 96 시간, AEL)이있는 튜브를 유지 ° C.
2. 문화 애벌레의 복부 신경 코드의 해부
- 수를 청소70 %의 에탄올과 nch과 손. 4 착색 블록, 2 포셉 쌍과 70 % 에탄올로 바늘을 만끽하고, 공기가 건조 보자.
- 다음 미디어 넷 착색 블록을 준비 : 청소하고하는 증류수 (DW)과 하나가 수영장 청소 애벌레로, 1퍼센트 페니실린과 스트렙토 마이신, Ecdysone - 무료 (M3 PS 수있는 2 개의 방패의 ML과 상 M3 곤충 매체가 두 번째 애벌레를 해부하는 매체), 수영장 해부 복부 신경 코드 (VNCs을)에 M3 PS 매체 2 ML과 삼분의 일, 그리고 찔러 VNCs을에 M3 PS 매체 2 ML과 사분의 일. 시약의 모든 RT를 미리 따뜻하게해야합니다.
- 96 시간 AEL의 애벌레가 들어있는 유리 병에 물을 추가합니다. 그런 다음 주걱을 사용하여, 부드럽게 젖은 종이 타월에 유리 병에서 애벌레로 음식을 확산. 음식을 손을 씻어 DW를 포함하는 착색 블록에 10 애벌레를 전송합니다. DW 6 배를 교체하십시오. 그런 다음 M3 PS 매체를 교체하십시오.
- M3 PS 매체 2 ML을 포함하는 얼룩 블록에 애벌레 중 하나를 전송합니다.
- 해부 현미경 아래, 디표준 방법 12을 사용하여 조심스럽게 애벌레의 뇌를 ssect하지만, 조직의 손상을 최소화하기 위해, 다음과 같은 방법으로 진행하여 특별한주의를. 유충 등쪽면을 놓고 포셉 2 쌍 앞쪽 끝 (각 손에 하나)에서 삼분의 일에서 등쪽면을 누르고 있습니다. 앞 섹션을 개최하는 동안, 포셉과 뒤쪽 끝을 떠난, 그리고 표피를 찢어. 뇌와 VNC는 앞쪽 반은 뒤쪽 가장자리에서 볼 수 있어야합니다. 조심스럽게 지방 몸, 내장 및 표피를 제거하여 뇌와 VNC 단지를 분리. VNCs가 너무 많이 손상되면 VNCs이 부상을 찔러 없이도 완전히 또는 부분적으로 타락한 것입니다. 계정으로 다음과 같은 점을 가져 가세요 :
- 당기거나이 VNC를 손상시킬 수로 가슴 VNC에서 imaginal 디스크와 주변 신경을 찢어하지 마십시오. 주변 신경을 잘라 가까이 서로를 배치 포셉, 두 쌍 주변 신경을 누른 상태에있는 신경을 뽑아ceps. Imaginal 디스크와 입 부분은 VNC에 부착 남길 수 있습니다.
- 뇌에 부착 된 링 글 랜드 및 림프절 선 둡니다.
- 얼마되지도 않는데 음식 포함되어있는 뇌에 가장 가까운 지점에 용기를 내서 자른다.
- 끝이 잘라 약간의 확대와 P20 pipetman를 사용하여, 신선한 M3 PS 매체를 포함하는 착색 블록에 VNC를 전송합니다. 팁 고집에서 VNC를 방지하기 위해 절개에 사용되는 유일한 매체를 VNC 먼저의 피펫을 전송하고 전에.
3. Drosophila 애벌레의 VNC로 부상을 찔러
이 섹션은 VNCs 칼에 찔린 부상을 수행하고, 시간 경과 분석 및 immunostaining에 찔-VNCs을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 포스트 찔러 문화 조건과 기간은 섹션 5 (시간 경과 분석 용)과 제 6 항 (immunostaining 용)에 설명되어 있습니다.
- 시간 경과에 (4-5을 충분히 VNCs을 풀링 한 후및 전송 한 VNC) immunostaining 24여 M3 PS를 포함하는 깨끗한 착색 블록합니다.
- 동양 VNC 그래서 등쪽의 neuropile은 해부 현미경 (그림 1B)에서보기에 있는지 확인합니다. 이 광 엽 (叶)에 부착 할 때 거짓말을 할 VNCs에 대한 가장 자연스러운 방향이다.
- 찌르 수동으로 직각 거의 등쪽의 측면에서 해부 현미경 아래에서 텅스텐 바늘을 사용하고 VNC의 복부 절반 (그림 1b)에 목표를두고 있습니다.
다음에 특히 관심을 가지고 :
- 한 번 찔러.
- 바늘까지 찌르 유리의 하단에 도달. 그러나 바늘 끝을 손상하지 않도록주의하십시오.
- 바늘 소유자의 줄기은 자상 동안 매체를 만지지해야합니다.
- 상처가 해부 현미경 아래에 표시되지 않습니다.
참고 : 스탭 - 상해 관련이없는 퇴행
절차찔러 병변에서 VNC 구분 내에서 세포의 변성 될 수 있습니다. neuropile에 구멍의 변성 결과 및 경우에 따라 구멍이 아닌 칼에 찔 표본의 피질에서 관찰되었습니다. 영향을 neuropile 또는 광범위한 변성에 영향을 미치는 변성과 표본은 또한 VNC의 표면은 폐기해야합니다. 변성은 다음과 같이 식별 할 수 있습니다 :
- 특히 칼에 찔린 22 시간에서 가슴의 복부 / 측면 지역에서 거칠게 표면. 극단적 인 경우에는 VNC가 돌출 네요.
- 형광 immunostaining와 배경 신호에 구멍으로 표시 할 수 있습니다 가슴 neuropile에 구멍이나 액포.
4. 니들과 집게의 유지 보수
- 정기적으로 바늘 끝이 충분히 날카로운 여부를 확인합니다. 바늘 팁은 몇 가지 실험을 위해 사용 후 구부러진 또는 무딘 수 있습니다. 이 경우, 아칸소 돌 또는 이와 동등한를 사용하여 팁을 선명하게.
- 포셉의 팁해야완벽하게 충족합니다. 팁 사용과 손상받을 수 있습니다. 이 경우, 아칸소 돌 또는 동급를 사용하여 팁을 조정합니다.
5. 칼을 맞아 VNCs의 문화 및 시간 경과 기록
G9 13 - - 생활 VNC, 모든 axons 레이블 GFP 단백질 트랩 라인에 axonal neuropile 시각화하는 데 사용할 수를, 그리고 glial 드라이버 repoGAL4가 UASdsRed을 표현하는 데 사용할 수있는 모든 glial 세포를 (중간 선 glia 제외) 시각화하는 S197Y 14 기자. 교차로 G9으로 UASdsRedS197Y로 이동합니다; repoGAL4 파리는 자손의 애벌레에서 VNCs은 조직 생활에 기록 할 수 있습니다 녹색 axons과 붉은 glia를 얻을 수 있습니다.
- 풀링 4-5의 VNCs 후, 2 M3 PS의 ML, 그리고 찔러 VNC의 복부 절반을 포함하는 깨끗한 착색 블록으로 전송 한 VNC는 제 3 항에 표시된.
- M3의 1 ML를 포함하는 폴리-L-lysin 코팅 3.5 mm 유리 바닥 페트리 접시에 찔 VNC를 전송PS. 아래 VNCs 등쪽면을 넣습니다. 부드럽게 VNC는 요리에 충실 할 수 있도록 집게의 쌍의 평면 측면을 사용하여 VNC를 누르십시오.
- 부드럽게 7.5 %에 FBS의 최종 농도를 렌더링 M3 PS 15% FBS의 1 ML를 추가합니다.
- 공 촛점 현미경을 스캔 레이저를 사용하여 이미지를 획득. 전체 두께에 걸쳐 Z-섹션 시리즈를 수집, VNC를 검사합니다. 우리는 온도 제어 환경 챔버와 Leica SP2 역 공 촛점 현미경을 사용했습니다. 이와 동등한 공 촛점 현미경이 작동해야하지만 그것은 스캔에 대한 설정을 최적화해야 할 수 있습니다. 다음과 같이 우리의 시간 경과 공 촛점 현미경에 대한 설정이 있었다 : 환경 챔버의 온도 : 25 ° C, 4 배 줌과 20X 목적, 512x512 픽셀 해상도 스캔 모드 xyzt, Z = 1 μm 단계 1 시간 또는 2 - 시간 간격.
- Leica SP2 공 촛점 현미경 스캔에 대한 파일 크기 제한이 있습니다. 이러한 설정을 통해, 8-9 timepoints을 검사 할 수 있습니다. 과다른 공 촛점 현미경, 그건 즉, 최대 24 시간까지의 기간 동안 긴 시간 포인트에 대한 이미지 스택을 취득 할 수 있어야한다고.
6. 칼에 찔 해결 VNCs의 문화와 Immunostaining
- 물론 당 M3 PS 7.5 % FBS 500 μl를 포함하는 24 잘 조직 배양 플레이트를 준비합니다.
- 24 잘 조직 배양 접시 이상의 24 VNCs의 절개를 반복합니다.
- 팁 컷 - 오프와 P20 pipetman을 사용하여 잘 당 1 VNC를 사용하여 배양 접시에 수영장에서 12이 아닌 칼에 찔 VNCs를 전송할 수 있습니다.
- 제 3 절에 설명 된대로 수영장에서 VNCs의 자상 나머지. 잘 각 각 찌른 VNC를 전송합니다.
- 실험에 따라 원하는 기간 동안 25 ° C 배양기에서 24 잘 접시를 놓습니다. 셀 무결성은 최소 24 시간에 그대로 있습니다.
- 문화 후, 팁 컷 - 오프와 P20 pipetman를 사용하여 1.5 ML 튜브에 4 % 포름 알데히드 PEM 250 μl의 12 VNCs를 전송할 수 있습니다. 그런 다음 fixatiVE는 신중하게 VNCs을 손상하지 돌보는, 나가 pipetted 있습니다. 샘플을 충당 할 충분한 고정력있는 소량의 각 튜브에 남아 있어야합니다. 그 후, 신선한 정착액을 추가하고 부드럽게 RT에서 50 분을 위해 활발히 논의.
- 0.3 % 트리톤 X PBS로 2 번 씻어 후 RT에서 0.3 % 트리톤 X PBS로 10 분 동안 2 번 씻는다.
- RT에서 1 시간에 0.3 % 트리톤 X PBS에서 10 % 정상 염소 혈청 잠복기에 의해 차단 VNCs. 샘플은 적어도 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 4에서 20여 시간에 차 항체와 VNCs을 품다 ° C.
- RT에서 0.3 % 트리톤 X PBS로 10 분 동안 3 번 씻어 후, 0.3 % 트리톤 X PBS로 2 번 씻어.
- 4 개 이상의 16 시간을위한 차 항체와 VNCs을 품다 ° C.
- 객실 RT에서 0.3 % 트리톤 X PBS로 10 분 (형광 보조 항체를 사용하는 경우 어둠 속에서)에 대해 3 번 씻어 후, 0.3 % 트리톤 X PBS로 2 번 씻어.
- 적어도 50 % PBS : 50 % 글리세롤과 PBS 교체시간.
- 그런 다음 80 % 글리세롤로 교체 : 20 % PBS를 최소 시간.
- 현미경 유리 슬라이드에 첼로 테이프 2 층 (약 0.06 mm)에 만든 창에서 VNC를 탑재합니다. 방향을 조정하고 창을 통해 coverslip (18x18 mm)를 넣습니다. 두 VNCs이 방법을 사용하여 슬라이드에 장착 할 수 있습니다.
다른 세포 반응은 (셀 번호와 셀 모양의 예를 들어 변경) 분석 할 수 있으며, 기본 항체의 다양한 부상을 사용합니다.
7. ImageJ와 플러그인의 범위를 사용하여 데이터를 분석
VNC는 관련없는 변성을 찔러하지 않는 경우, 샘플에 관계없이 병변 크기의 분석에서 계산해야합니다. 칼에 찔린를 수동으로 수행됩니다 때, 병변 크기마다 다릅니다. 따라서 통계적으로 가능한 한, 자상의 효과를 분석하는 것이 중요합니다.
- 크기 측정을 나갔습니다. 상처의 크기는 수리 15 지표입니다.찔러 괴로움은 GFP 표현이없는 등 볼 수 있습니다. 다음과 같이 병변 지역은 무료로 이용할 수 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 촬영 데이터를 측정 할 수 있습니다 :
- ImageJ 사용하여 "파일"메뉴에서 공 촛점 이미지의 스택을 열고 "가져 오기"여기에서 "이미지 시퀀스"를 선택을 선택합니다. 이 스택에 개별 이미지의 컬렉션을 설정합니다.
- 다음 '이미지'메뉴로 이동하여 "Hyperstack"로 "스택"을 변경, "Hyperstack"을 선택한 다음 "Hyperstack에 스택"을 선택하십시오.
- '이미지'메뉴에서 "등록 정보"를 사용하여 voxel 크기를 설정합니다. 데이터에 Leica SP2 공 촛점 현미경을 사용하여 인수 voxel 크기는 스캔 - 소프트웨어에서 얻은, 그리고 메타 데이터 텍스트 파일에서 이미지와 함께 저장할 수 있습니다. 로 제 3에 설명 된 우리의 설정으로, 픽셀 크기가 XY = 0.366211 μm 및 z = 0.99709 μm 있습니다.
- 한 번 지점에있는 모든 조각을 조사하여 도구 막대에서 다각형 선택 도구를 사용하여 병변 지역의 최대 윤곽을 그린다. 입니다관심 지역 (ROI).
- "분석"메뉴로 이동하여 투자 수익 (ROI) 관리자로 투자 수익 (ROI)을 추가 아래로 스크롤하고 "도구"다음 "투자 수익 (ROI) 관리자가"다음 "추가"를 선택합니다.
- 모든 시간 지점에이 과정을 반복합니다.
- 각 투자 수익 (ROI)의 영역 크기를 얻기 위해 투자 수익 (ROI) 관리자에서 "측정"버튼을 클릭하십시오.
- 시간 경과 녹음 중에 VNC 운동의 수정. "Stackreg"와 "Turboreg"플러그인 16 일 (ImageJ 웹 사이트에서 http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) : 이러한 플러그인은 시간이 경과하는 동안 작은 샘플 움직임을 수정 할 수 있습니다. 모든 시간 지점으로 동등한 대표 광학 섹션 스택을 구축하고 플러그인을 적용 할 수 있습니다. 그것은 시간이 지남에 따라 어떻게 병변 변경 사항을 시각화하는 데 도움이됩니다. 이러한 방법과 사용 설명서에 대한 자세한 내용은이 플러그인을 개발 한 연구 그룹에서 사용할 수 있습니다. ( http://bigwww.epfl.cH / thevenaz / stackreg /).
- glial 세포의 자동 계산. "DeadEasy glia"플러그인 ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html ) :이은 Drosophila 애벌레의 VNC에 REPO - 긍정적 인 glial 세포의 수를 계산하고 glial의 변화를 검사하기 위해 개발되었습니다 숫자는 부상 17 찔러으로 인한. 플러그인 0.1 % 탐지 및 4.3 % 거짓 네거티브 필름 17 오류와 함께, 정확하게 작동합니다. 이 플러그인 먼저 라벨에게 반 REPO 항체와 immunofluorescence를 사용하여 시편의 모든 glia를 (중간 선 제외)을 사용합니다. 그런 다음 설치 플러그인 ImageJ에서 공 촛점 이미지의 스택을 열고 플러그인 실행합니다. 이 30 초에서 자동으로 glial 세포를 계산합니다.
- apoptotic 세포의 자동 계산. "DeadEasy Caspase의 애벌레"플러그인 ( www.biosciences-labs.bham.ac.uk/hidalgo/Software.html) 18 :이 반 흘리고 - Caspase3으로 표시된 셀의 개수를 계산하기 위해 개발되었으며, 새 버전이 애벌레의 VNCs에 적응했다. 부상을 찌른 곳은 프로그래밍 세포 사망 11 증가됩니다. 사용하려면이 플러그인 반 흘리고-Caspase-3 항체와 immunofluorescence를 사용하여 시편의 첫 번째 레이블 apoptotic 세포.에게 그런 다음 설치 플러그인 ImageJ에서 공 촛점 이미지의 스택을 열고 플러그인 실행합니다. 이 30 초에서 자동으로 apoptotic 세포를 계산합니다.
8. 시약
- 문화 매체 : 방패와 상 M3의 곤충 매체, 7.5 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린과 1 % 스트렙토 마이신.
- 0.01 % 멸균 DW에 폴리-L-lysin.
- 정착액 : 4 %의 포름 알데히드, PEM의 울트라 순수 (0.1 M 파이프, 2 MM EGTA, 1 MM MgSO 4) 솔루션입니다.
- immunostaining에 대한 차단 솔루션 : 0.3 % 트리톤 X PBS에서 10 % 정상 염소 혈청.
- 안티 - 글루타민 Synthetase이 항체 : 솔루션을 차단에 1:250.
- 안티 - GFP 항체 : 솔루션을 차단에 1:1,000.
- 안티 - REPO 항체 : 솔루션을 차단에 1:250.
- 안티 ELAV 항체 : 솔루션을 차단에 1:250.
- 안티 흘리고 Caspase 3 항체 : 솔루션을 차단에 1:1,000.
- 차 항체 : 솔루션을 차단에 1:250.
Representative Results
여기 Drosophila 애벌레의 VNC로 찔러 부상을 수행하고 시간 경과를 사용하고 공 촛점 형광 현미경을 immunostaining 부상으로 세포 응답을 분석하는 방법을 보여줍니다.
시간 경과 데이터의 경우 병변은 G9 axonal 마커 (그림 2) 베어링 표본의 neuropile 내 GFP-부정적인 지역으로 시각화합니다. 자상 한 직후에, 작은 GFP-부정적인 공간, 구멍 또는 액포 모양 (그림 2A) 표시 할 시작합니다. 이러한 GFP-부정적인 지역은 일반적으로 (그림 2A) 찔러 후 8-6 주변의 시간까지 확대. (그림 2B) 그 후, GFP-부정적인 부분은 축소하고 심지어 사라질 수 있습니다. 칼에 찔린 후 22 시간으로, 상처가 차지하는 면적은 (그림 2A, B) 찔러 후 6-8 시간에 있었던 최대 영역보다 일반적으로 작습니다. 마찬가지로 glial 프로세스에서 DsRed-형 영역은 처음도 증가하지만, shrin칼에 찔린 후 22 시간으로 KS. 흥미롭게도, 자주 DsRed-긍정적 인 glial 프로세스는 이전에 자신의 실종 (그림 2C)에 neuropile에서 GFP-부정적인 구멍을 채우십시오.
고정 표본, 고급 glial 프로세스 및 부상에 대한 그들의 응답에 immunostaining을 사용하여 시간 경과 이미지보다 해상도로 시각화 할 수 있습니다. 이 모든 glial 세포를 (중간 선 glia 제외) 시각화하기 위해 파리에 막 테 더링 기자 (예 : UAS-mCD8GFP)의 표현을 유도하기 위해 repoGAL4 glial 드라이버를 사용, 예를 들어, 작업을 수행 할 수 있습니다. 이것은 또한 neuropile - 관련 glial 세포를 (인물 3A, B) 레이블 안티 - GS2 같은 다른 glial 마커와 결합 할 수 있습니다. 여기 보여주고 복부 신경 코드는 ventrally 구멍 (그림 3A, 화살촉)에 상해 결과를 찔러, 등쪽의 편에서 칼에 찔되어 있지만. 칼로 더 심각 neuropile 및 neuropile - 관련 glial 세포의 일에 영향을 미칠 것으로 보인다표면과 피질 glial 세포 (그림 3B). 그들은 여전히 피질의 조직처럼 자신의 메쉬를 유지하는 반면 Glial 프로세스는 neuropile에서조차도 나타납니다. 파편 조각 등의 정상 세포와 구분됩니다 GS2 - 긍정적 인 세포 파편에 부상 결과는 훨씬 적은하며 전지 본체에 연결되지. 이 neuropile - 관련 glial 세포 (그림 3B)에 손상을 드러내고있다. Degenerating neuropile - 관련 glial 세포는 전자 현미경 15 일까지 관찰되었다. 안티 - 흘리고 - Caspase 3 + apoptosis의 얼룩들은 부상을 찔러에 apoptosis를 받아야 보여 neuropile - 관련 glial 세포 15 관찰된다. Neuropile 관련 glial 세포는 또한 neuronal 파편 15, 그리고 GS2을 phagocytose에 + 신호는 glial 프로세스에 의해 apoptotic 뉴런의 engulfment을 표시 할 수 표시되었습니다. 죽 - Caspase + apoptotic 세포는 (적어도 Elav + 뉴런에 해당하는 일부의, 피질에서 관찰 아르 고정 샘플을 사용하고 immunostaining은 또한 증식과 apoptosis의 효과로, 부상으로 세포 반응의 양적 분석을 할 수 있습니다. 이를 위해, 우리는 의도적으로 각각 자동으로 glial 세포 및 apoptotic 세포의 수를 계산하는 두 ImageJ 플러그인, DeadEasy Caspase의 유충과 DeadEasy Glia을 개발했습니다. 그들은 애벌레의 VNCs에서 작동하도록 검증하고 매우 정확하고 있습니다. 이러한 사용하면, 22 시간 (그림 4A) 15에 의해 칼에 찔린 상처로 인한 REPO - 긍정적 인 glial 세포의 수가 늘어나고 있음을 관찰 할 수 있습니다. 6 시간 후 찔러 (그림 4B) 15 반 흘리고-Caspase-3 apoptotic 세포의 수가 증가도 있습니다. Drosophila의 CNS의 부상에 대응 glial 증식과 apoptosis의 이러한 증가는 척추 CNS의 부상 응답을 연상합니다. 이 프로의 중요한 측면tocol은 VNC dissections의 품질입니다. 이 VNCs이 과정에서 손상 여부를 여부를 해부시에 말씀하기가 어렵습니다. 그것은 부드러운 dissections을 수행하기 위해 특정 처리하는 것이 중요합니다. 그러나, 나쁜 품질의 샘플은 필연적으로 생산하고,이는 나중에 단계에서 식별하고 삭제하는 필수되지 않습니다. 손에서 VNC 변성은 부상과 관련이없는 것으로 나타납니다하지만, 대신에 거친 절개로 발생했습니다. 우리는 부상 상처에 중요한 크기를 관찰하지 않은, 우리는 성능이 저하되지 않습니다 모든 부상 샘플을 분석 할 수 있습니다. VNCs가 자신의 무결성을 유지하면 VNC 표면은 부드럽고 환해 경향이 있으며, neuropile에 구멍 (그림 5A) 관찰되지 않습니다. VNCs의 저하는 VNC 복부와 측면 부분 (그림 5B)의 거친 표면에서 24 시간의 포스트 절개로 인식 할 수 있습니다. 찔러 부상과 관련이없는 neuropile의 저하가 발생할 수 있으며 neuropile H으로 인정 받고 있습니다immunostained 표본의 배경 신호의 oles. 변성 이러한 증상이있는 샘플은 (그림 5C) 폐기해야합니다. 손으로 절개하고 온전하고 칼에 찔 컨트롤에 상해 (yw) 파리에 대한 성공률은 70 % 정도에 있습니다. 이 속도는 실험을 수행하는 사람의 능력에 따라 달라질 수 있으며, 유전자형과 함께합니다. 
1 그림. 의 개략적 인 도면 애벌레의 부상을 막고 있으며 찔러. (A) 일 0, 파리는 3 시간에 포도 주스는 배양 접시에 알을 낳기 위해 사용할 수 있습니다. 1 일에서 부화 첫번째 instar의 애벌레는 (L1) 수집되며 다른 3 일 동안 보관 된 표준 효모 식품을 포함 병에 배치. 4 일에서 애벌레가 음식 유리 병에서 수집되며, 찔러 실험에 사용됩니다. 애벌레의 중추 신경계의 (B) 측면 전망은.복부 신경 코드의 복부 지역은 등쪽의 측면에서 바늘로 찌른 있습니다. 앞의 왼쪽에 있으며, 오른쪽 뒤쪽. 
그림 2. VNC의 병변의 시간 경과의 진행. GFP-라벨 axons과 DsRed-라벨 glial 세포와 라이브 VNCs에 공 촛점 현미경. 유전자형 :. UASDsRed / +; G9 / +; repoGAL4 / + (A) 병변은 axonal neuropile에 형광의 부족에 의해 인정되고 있습니다. 칼에 찔린 후, GFP-부정적인 구멍 후 크기와 수에 증가가 나타납니다. 칼에 찔린 후 9 시간에서 부상을 찔러 후마다 포인트에서 5 광 섹션의 예상치는. (B) axonal neuropile 병변 정신과 의사. 이러한 이미지는 부상을 찔러 후 다른 시간 지점에서 하나의 광학 섹션입니다. 각 샘플에 상응하는 위치, EA에서 같은 슬라이스 번호를 확인하려면시간 경과 데이터의 스택의 채널 시간 지점 선정되었습니다. 비교하여 패턴 찔러에 의해 영향을받지 않는다 영역에서 G9과 repoGAL4> UASmCD8GFP과 시각화, 슬라이스는 Z 축에 상응하는 위치에서되는 것으로 확인되었다. 의 점선은 (A, B) 상처의 가장자리를 나타냅니다. neuropile에 상처 (C) 높은 배율이 있습니다. GFP-부정적인 구멍 DsRed-긍정적 인 glial 프로세스로 가득하고, 이후 (화살촉) 실종되었다. 가로보기. 앞까지. 
그림 3. VNC의 병변의 세포 특성. 안티 GFP 및 안티 GS2, neuropile - 관련 glial 세포 마커 물들 모든 glial 세포 (glia 중간 선 제외)에 대한 막 곁에 GFP 기자 베어링 VNCs. 유전자형 :. + / +; UASmCD8GFP / +; repoGAL4 / + (A) VNCs은 가졌 칼을했다샐면,이은 (화살촉) ventrally 발전을 발생합니다. 단일 광 섹션 시상 전망, 최대 등쪽과 앞쪽 왼쪽. (A, B)가 부상을 찌른 곳은 피질 및 표면 glial 세포보다 더 심각하게 neuropile - 관련 glial 세포에 영향을 미칩니다. 단일 광 섹션 GS2 - 긍정적 인 세포 파편에 부상 결과 (B의 화살촉). (B) 수평보기, 앞까지. 화살촉은 GS2를 가리 킵니다 + 세포 파편을. (C) apoptotic 마커 반 흘리고-Caspase-3와 neuronal 마커 부상시 피질에서 죽어 세포의 일부 뉴런이 있다고 보여 방지 Elav의 Colocalisation. NP, neuropile, CX, 피질. 
4 그림. DeadEasy를 사용하여 glial 세포와 apoptotic 세포의 자동 계산. (A) 'DeadEasy 애벌레의 glia'를 사용하는 예제 REPO는 긍정적 인 계산하기glial 세포. 왼쪽 : 안티 - REPO 항체 물들 VNC 복부 절반, 중간 : 플러그인에 의해 식별 세포를 보여주는 DeadEasy 애벌레의 glia의 출력, 자 : 병합합니다. 오른쪽에있는 숫자는 약 30 초 광학 공 촛점 섹션의 전체 스택을 자동으로 계산 REPO - 긍정적 인 셀의 수입니다. 칼에 찔린 VNCs에서 glia 증가의 수입니다. 'DeadEasy Caspase의 유충'를 사용하는 (B) 예. 왼쪽 : 반 흘리고 - CASPASE 세 항체 물들 5 광학 공 촛점 섹션의 계획, 중간 : 플러그인에 의해 식별 세포를 보여주는 출력, 오른쪽 : 병합합니다. 오른쪽에있는 숫자는 약 30 초 광학 공 촛점 섹션의 전체 스택을 자동으로 계산 CASPASE - 긍정적 인 셀의 수입니다. apoptotic 세포의 수는 칼에 찔린 VNC에 증가한다. 
그림 5. degenerat의 예이온. (A) A 건강 VNC. 변성의 흔적은 없습니다. (B) 가슴의면이 찔 표본에 degenerating (화살촉)입니다. 별표 병변 사이트를 나타냅니다. (C) 가슴 neuropile (흰색 화살촉), 피질 (오렌지 화살촉)이 아닌 칼에 찔 VNC에서의 홀. 손상된 neuropile 및 광범위한 vacuolization있는 표본을 폐기해야합니다. 여기 VNCs은 neuropile 관련 glial 마커 백신 에보니 물들했다. 가로보기, 앞까지.
Discussion
우리는 상해, 수리 및 재생에 세포 반응을 조사하기 Drosophila 애벌레의의 CNS에 부상을 찔러 죽이고는 사죄하기 위해 프로토콜을 구축했습니다. 애벌레의 VNCs가 해부하고이 시간 경과 현미경으로 촬영 또는 glia 뉴런, apoptosis 또는 세포 분열을 시각화하는 형광 immunostaining에 고정 된 후, 칼에 찔 있습니다. 시간이 지남에 따라 병변의 진행을 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 부상시 및 수리시 휴대폰 번호 변경 정량 및 통계 분석을 위해 의도적으로 개발 한 소프트웨어와 함께합니다.
우리는 전에 번데기 후 성인 플라이로의 전환에 96 시간 AEL의 애벌레 (및 해당이 중 고정이나 추가 개발 할 수 있었다), 발달 단계를 칼로 찔렀어요. 그들은 셋째 instar 무대의 중앙에 있으며, 따라서 아직 pupation을 진행하지 않습니다; 96 시간에서 VNCs은 자상만큼 넓으며 신경계 이미 광고의 그것과 완전히 기능과 유사합니다ult. 그것은 약간 나중에 애벌레의 자상 가능한 될 수 있으며 정확한 타이밍은 연구 문제에 맞게 선택해야합니다. 그러나, 해결 질문에 따라, 그것은 일반적으로 부상을 세포 반응을 관찰 할 시간을 문화 VNCs을 위해 필요한 것입니다. 120 시간 AEL의 pupation이 시작 후 몇 시간, 기간은 CNS는 리모델링하고 때 따라서 가장 피해야합니다. 따라서 유충에 플러스 문화를 찔러에 대한 시간 창이 오히려 제한됩니다. 애벌레를 사용하면 여전히 성인을 사용하는 동안 훌륭한 기술 장점이 있습니다 : 마찬가지로 어른까지하면서, 신경 시스템은 부상에 대한 응답을 분석, 이미 애벌레에서 상당히 빠르고 쉽게 모든 기능이다.
접시에 배양없이 동등한 나중에 지점에서 해부하는 아르 VNCs에 접시에 해부 및 배양 두뇌와 VNCs의 크기와 형태를 비교했을 때, 그 개발은 생체에 비해 문화 느립니다 나타납니다. 다른면에서,개발은 정상적으로 문화, 조직 무결성이 보존되어 있으며 세포가 살아 여러 답변을 게재를 수행합니다. 상처 확장, neuropile 수리와 glial 확산은 22 시간이 포스트 찔러에서 열립니다. 이 부상 세포 응답이 문화에서 개최하고 하루 이상의 explants을 유지하기 위해 필요없이 가장 가능성이 있다는 것을 보여줍니다. 장기적 문화 원하는 된 경우, 프로토콜은 문화 판 삽입 5를 사용 등의 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.
이 degenerating의 부분에서 양질의 샘플을 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜을 최적화하는 몇 가지 기술을 소요 필연적으로 변성 일부 표본에 발생합니다. VNC는 조직의 무결성의 세부 (그림 5B)를 반영하는 '콜리 플라워'모양을 취득 할 수 있습니다. 변성도의 독립적 VNC의 vacuolization 인정되는 (그림 5C 그대로가 아닌 칼에 찔 표본에 존재 할 수있는 찔러
이 프로토콜에서는, 우리는 기존의 GAL4-UAS 시스템을 사용 glial 프로세스의 시각화에 병렬로 neuropile을 시각화하기 위해 파리의 단백질 트랩 라인을 이용했다. 이 도구는 또한 르와 같은 다른 바이너리 표현 시스템과 결합 될 수GAL4 무관 XA 19 Q-시스템 (20). 이 부상에 대한 응답으로, axons와 glial 프로세스간에 예를 들어 상호 작용의 분석을 활성화합니다. 추가로 이러한 수석 21 칼슘 유입 22 기자와 같은 다른 유전 도구와 함께 결합하여,이 방법은 glial 세포, neuronal axons과 CNS의 수석의 부상 응답 뒤에 세포 생물학을 분석 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 마지막으로,이 방법은 부상과 재생에 대한 답변에 유전자 기능을 테스트하기 위해, 표준 유전학, 돌연변이와 유전자의 이상 표현과 결합 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 성공적으로 CNS의 부상 11 재생 glial 응답을 근간 유전자 네트워크의 발견하게되었다. 이러한 셀룰러 이벤트와 과일 파리의 유전자 기능을 분열 유전자 기능의 진화 보존 주어진 것은 mA의 이해에 중요한 통찰력을 제공 할 가능성이부상 및 재생 속도 mmalian CNS는 반응.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 원고의 중요한 읽기와이 작품의 과정에 걸쳐 자신의 토론에 대한 실험실의 다른 회원들에게 메이 앤 임 감사드립니다. 이 작품은 야마다 과학 재단 (NSF)과 로얄 학회 단기 방문 휄로 십과 KK에 대한 EU 마리 퀴리 국제 수신 휄로 십 그래, 난 및 BBSRC 프로젝트 기금 (BB/H002278/1)와 웰컴 트러스트 장비 기금 (073228/Z/03/Z)에 의해 재정 지원되었다 AH로
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Staining block | Brunel Microscope | ||
| Forceps No. 5 | Fine Science Tools | e.g. 11251-20 | |
| Tungsten needle: rod diameter, 0.5 mm; tip size, 1 μm; length, 2 inch | Roboz Surgical Instrument | RS-6065 | |
| Needle holder | Roboz Surgical Instrument | RS-6060 | |
| Arkansans stones: Repair Kit for Dumont Forceps | Fine Science Tools | 29000-00 | |
| 35 mm Petri dish with 27 mm glass base | Iwaki | 3930-035 | |
| Leica SP2-AOBS confocal inverted microscope with environment chamber | Leica | ||
| Reagent | |||
| Shield and Sang M3 insect medium (ecdysone free) | Sigma | S3652-500 ml | |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | See 12 | ||
| FBS | Sigma | F7524 | |
| Poly-L-lysin | Sigma | P1399-25mg | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Polysciences | 04018-1 | |
| Mouse anti-glutamine synthetase antibodies | Millipore | MAB302 | |
| Rabbit anti-GFP antibodies | Life technologies | A11122 | |
| Mouse anti-REPO antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 8D12 | |
| Rat anti-ELAV antibodies | Developmental Studies Hybridoma bank | 7E8A10 | |
| Rabbit anti-active caspase 3 antibodies | Abcam | ab13847 | |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Life technologies | A11034 | |
| Anti-mouse Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21236 | |
| Anti-rat Alexa Fluor 647 | Life technologies | A21247 | |
References
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