Summary
Carcinogenese is een proces waarbij interacties tussen kankercellen en kanker micromilieu. Om de moleculaire gebeurtenissen ontleden, moet men verschillende celpopulaties in verschillende stadia sluiten tijdens kankerontwikkeling. Met behulp van een muismodel voor basaalcelcarcinoom, een protocol voor mobiele analyses beschrijven we tijdens carcinogenese.
Abstract
Kankerontwikkeling is een meerdere stappen waarbij vele celtypen waaronder kanker precursorcellen immune cellen, fibroblasten en endotheelcellen. Elk type cellen ondergaat signalering en functionele veranderingen tijdens carcinogenese. De huidige uitdaging voor veel kanker onderzoekers is om deze veranderingen in elk celtype ontleden tijdens de meervoudige-stap-proces in vivo. In de afgelopen jaren, hebben de auteurs een reeks procedures om de verschillende celpopulaties te isoleren tijdens huidkanker ontwikkeling met behulp K14creER/R26-SmoM2 YFP muizen ontwikkeld. De procedure is verdeeld in 6 delen: 1) het genereren van geschikte muizen voor de studie (K14creER + en R26-SmoM2 YFP + muizen in dit protocol); 2) induceren SmoM2 YFP expressie in de huid van muizen; 3) de voorbereiding muis huidbiopsies; 4) het isoleren epidermis van de huid; 5) bereiden enkele cellen uit epidermis; 6) labelen enkele cel populaties voor flowcytometrie-analyse.Generatie van voldoende aantal muizen met de juiste genotype is de beperkende stap in dit protocol, dat kan duren tot twee maanden. De rest van de stappen een paar uur tot een paar dagen. Binnen dit protocol, hebben we ook een sectie voor het oplossen van problemen. Hoewel we ons richten op huidkanker, kan dit protocol worden gewijzigd om toe te passen voor andere dierlijke modellen van menselijke ziekten.
Introduction
Als de meest voorkomende vorm van kanker bij de mens, basaalcelcarcinoom (BCC) treft ongeveer 2 miljoen Amerikanen per jaar 1. Accumuleren bewijs geven aan dat abnormale activatie van hedgehog (Hh) signalering is de drijvende kracht voor BCC ontwikkeling (beoordeelde in 2,3). Wijzigingen van Hh signalering bij BCC omvatten inactiveren mutaties van PTCH1 4-6, gain-of-function mutaties van SMO 7-9, en afwijkende expressie van de Hh route transcriptiefactoren GLI1 10 en Gli2 11 of zeldzame geïnactiveerde mutaties van negatieve regulator Su (Fu ) 12. Door al deze en andere studies, heeft Federal Drug Administration (FDA) heeft onlangs ingestemd met het gebruik van Hh signalering remmer Vismodegib om met gemetastaseerde en lokaal gevorderde BCC 13-15 behandelen.
Ondanks al deze successen 16, we nog steeds niet de moleculaire en cellulaire mechanismen die Hh signalering drijft carc begrijpeninogenesis. Oprichting van diermodellen met behulp van weefsel-specifieke activatie van Hh signalering is nog steeds belangrijk voor deze studies en voor ons begrip van resistentie tegen geneesmiddelen. Bij muizen, hoeft wild-type muizen ontwikkelen geen BCC, zelfs onder zware doses van kankerverwekkende stoffen, UV of ioniserende straling. In tegenstelling, Ptch1 + / - muizen zijn gevoelig voor BCC ontwikkeling 17,18. De penetrantie van BCC ontwikkeling in Ptch1 + / - muizen is meer dan 50% 18,19 hoewel Ptch1 + / - muizen ontwikkelen zelden volgroeide BCC indien bewaard onder normale omstandigheden. Door de embryonale dodelijkheid van Ptch1 - / -, weefselspecifieke knockout van PTCH1 wordt algemeen gebruikt voor de studie 20. Daarnaast voorwaardelijke huid-specifieke expressie van oncogene SmoM2 YFP (Krt14-Creer: R26-SmoM2 YFP of Krt14-cre: R26-SmoM2 YFP) leidt tot de vorming van meerdere microscopische BCCs op zeer jonge leeftijd, waardoor een gemakkelijke genetische test voor Hh signalering doenwnstream van SMO 21.
Er zijn drie belangrijke kwesties in onze kennis van BCC biologie. Ten eerste, de cellulaire oorsprong van BCC is niet geheel duidelijk. Terwijl sommige studies ondersteunen de krimp van de haarfollikel de stamcellen plaats 22-24, Youssef et al.. 25 gelokaliseerd de muizencellijnen van oorsprong van cutane Hh-driven dat tumoren in de inter-folliculaire epidermis gebied, niet in de haarfollikel , met celspecifieke Cre tot expressie van een transgene ROSA26 aangedreven mutant SMO activeren. Ten tweede, cellulaire interacties tijdens BCC ontwikkeling zijn niet goed begrepen. Het is bekend dat geactiveerde keratinocyten met Hh signalering kan leiden tot de vorming van BCC, maar andere cellulaire veranderingen worden niet goed begrepen. Bovendien kan de behandeling van Smo antagonisten bij muizen leidt tot resistentie 26-28. Dus nieuwe doelen voor BCC zijn hoognodig. Inzicht in deze drie zaken nodig analyses van cellulaire veranderingen in muizen tijdens Carcinogenesis. Hoewel verschillende methoden zijn gepubliceerd voor keratinocytkweek, flowcytometrie en de huid stamcelisolatie 29-31, zijn er momenteel geen uitgebreide procedures voor mobiele analyses in de muis BCC. Door het combineren van methoden voor het muismodel van BCC, scheiding van epidermis, generatie van enkele cellen van weefsels en cellen analyses, zullen we de lezers te voorzien van een reeks procedures om cell signaling, cellulaire en moleculaire interacties te bestuderen tijdens de BCC ontwikkeling. Wij zijn van mening dat dit protocol zal toestaan lezers om te zien hoe elke procedure wordt bereikt. Daarnaast voorzien we enkele gegevens te illustreren wat de resultaten eruit moet zien, en het oplossen van problemen om lezers te helpen om moeilijkheden te overwinnen tijdens het uitvoeren van deze procedures.
Protocol
Deze studie werd door de IACUC goedgekeurd aan de Indiana University School of Medicine.
1. Genereer Muizen met Correct Genotypen
- Instelling van een muismodel van BCC. Mate K14-creer muizen (Jackson laboratorium stock nummer 005107) met R26-SmoM2 YFP muizen (Jackson laboratorium stock nummer 005130) (18) naar K14-creer + en R26-SmoM2 YFP + muizen te genereren.
- Voeren genotypering. Dompel staart exemplaren (0,5 cm lang) in directPCR staart lysisoplossing met 1 mg / ml proteïnase K bij 55 ° C gedurende de nacht met schudden. De volgende dag, weefsel verwijderen vuil door centrifugeren bij topsnelheid in een micro-centrifuge (de supernatant houden genotypering). Met 1 pl van de supernatant van elke PCR reactie met de primers en omstandigheden aanbevolen door de fabrikant. Selecteer de muizen met de juiste genotypen (op de leeftijd van 3-6 weken, buprenorfine bij 0.05-0.1 mg / kg zal worden toegepast via SQ elke 8-12 uur gedurende 2-3 dagen na staart snip) for stap 2.
2. Induceren Expressie van SmoM2 in Skin Keratinocyten
Induceren SmoM2 expressie in keratinocyten door orale toediening van tamoxifen (5 ug / kg lichaamsgewicht in 50 ml plantaardige olie in elke voeding) gedurende 5 opeenvolgende dagen via orale gavage met een voedingsnaald (gebogen 20 gauge).
3. Voorbereiding Skin Monsters
In het algemeen fenotypes ernstiger op het oor en staart K14creER/R26SmoM2 GFP muizen. Ter voorbereiding op cel analyses, we eerst de oogst van de muis huid na het offeren van dieren met een institutionele goedgekeurde procedure (CO 2 plus cervicale dislocatie).
4. Isoleren Epidermis
- Na opoffering muizen met een goedgekeurde procedure (zie stap 3), verwijder vacht met behulp van een trimmer. Dompel skin specimens in dispase-oplossing (5 mg / ml in DMEM met 10% FBS) bij 37 ° C gedurende 1-2 uur (1 uur voor muizen minder dan 8 weken oud en 2 hrvoor muizen oude dan 8 weken).
- Na dispase behandeling, gescheiden epidermis van dermis door pincet.
5. Genereer Single Cellen
- Om enkele cel populatie verkrijgen gehakt epidermis door schaar en vervolgens onderdompelen IV collagenase oplossing (1 mg / ml in DMEM met 10% FBS) gedurende 1-2 uur bij 37 ° C in een 50 ml buis. Proberen om zachtjes wervelen de buizen elke 20 min naar cel dissociatie helpen.
- Inspecteer cel dissociatie onder de microscoop. Bij enkele cellen in de collagenase medium kan worden gedetecteerd, incubeer het monster gedurende 30 minuten aan de cel opbrengst te verhogen. In het algemeen kan de epidermis van de ene muis omhoog rendement tot 10 7 cellen.
- Filter de weefsels mengsel door cel zeef (poriegrootte 70 micrometer), spin-cellen neer op 1500 rpm via bench top centrifuge, en eenmaal tijd met PBS wassen.
6. Label Cellen en uitvoeren flowcytometrie Analyses
- Resuspendeer de cellen in 10% FBSin PBS bij 2,5 x 10 6 cellen / ml van niet-specifieke binding te blokkeren (op ijs gedurende 30 min)
- Neem een monster van cellen van telkens 1,5 ml microbuisjes specifieke antilichaam labeling. Voeg verschillende antilichamen aan elke buis in een eindconcentratie van 2 ug / ml. Meng antilichamen met cellen via een zachte hoekpunt gedurende enkele seconden en laat ze op ijs gedurende 30 minuten, daarna wassen met 1 ml PBS. Voor BCC exemplaren, gebruikten we de antilichamen voor volgende biomarkers: CD11b-PE plus Gr1-APC (myeloïde cellen of myeloide suppressor cellen); vimentine-FITC (fibroblast) (zie reagentia voor details).
- Voor intracellulaire kleuring, maken we gebruik van een kit en volg de handleiding van de leverancier (zie reagentia voor details). We gebruiken verse cellen om celoppervlaktemerkers analyseren. Na oppervlak marker vlekken, wassen cellen en resuspendeer ze in PBS. Voeg DAPI de cel mengsel bij een eindconcentratie van 1 ug / ml. DAPI zal vlek dode cellen die gated out zal zijn van verdere analyses.
- Analyseren van de gegevens met specific software. We enkele cellen selecteert u eerst gebaseerd op het FSC vs SSC plot, en gebruik DAPI negatieve populatie (levende cellen) voor verdere analyse.
Representative Results
Het is bekend dat muizen ontwikkelen geen basaalcelcarcinomen behalve Hh signaleringsactiviteit. Figuur 1 toont de huid geïnduceerd fenotype na expressie van oncogeen glad, SmoM2 YFP. Figuur 2 toont analyse van myeloïde cellen in normale en tumor-dragende muizen. CD11b + GR1 + cellen afkomstig van myeloïde cellen en sommige zijn myeloïde afgeleide suppressor cellen. In normale toestand, de CD11b + GR1 + celpopulatie nauwelijks waarneembaar, maar zal toenemen in reactie op ontsteking of tumorontwikkeling. We toonden aan dat geïnduceerde expressie van SmoM2YFP in huid resulteert in een toename van CD11b + GR1 + cellen. Momenteel is de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verandering in BCC zijn niet duidelijk.
Figuur 1. Morphological veranderingen na SmoM2YFP inductie in de huid van muizen. De bovenste toont een diagram van de muis genotypen. Het middenpaneel: de K14creER + en R26-SmoM2 YFP + muis behandeld met tamoxifen bleek grove afwijking in de huid (rechts) alsook huidtumoren bij de H & E sectie (links). Het onderste paneel: de muis zonder SmoM2YFP inductie toonde normaal uitziende huid (rechts) en geen abnormale morfologie in de H & E sectie (links).
Figuur 2. Flow analyse van CD11b + GR1 + cellen. Om de verandering van CD11b + GR1 + cellen onderzocht tijdens de ontwikkeling van huidkanker, die we enkele cellen en gekleurd met fluorescentie-gemerkte antilichamen tegen CD11b en Gr1. Na analyse met FlowJo, merkten we een stijging van deze cel populatie in de huid weefsels van tamoxifen behandelde muizen.
Discussion
We hebben een methode beschreven voor celpopulatie analyse bij BCC. Tumorweefsels stroken van vele celtypen, en elk celtype gedraagt zich op een bepaald moment van carcinogenese, die zeer moeilijk, zelfs onder optimale omstandigheden in vitro heroveren. Met dit protocol hebben we aangetoond dat de ontwikkeling van basaalcelcarcinomen vergezeld door uitzetting van epidermale stamcellen en rekrutering van myeloïde cellen. In vergelijking met immunohistochemie en immunofluorescentie analyses celpopulatie analyses geven een kwantitatieve beoordeling van celpopulatie veranderingen sinds antilichamen van verschillende celtypen zijn nu beschikbaar.
Voor dit protocol, worden 10 weken nodig om de studie af te ronden omdat fenotypische verandering van geninductie vergt tijd. Het is dus belangrijk om de komende tijd experiment plannen. Voor celisolatie en analyses, kunnen twee hele dagen nodig zijn. Omdat levende cellen worden gebruikt analyses is het belangrijk om te reserveren een FACSCalibur tevoren. We hebben ook vermeld voorkomende problemen bij het werken met dit protocol (zie hieronder).
In onze ervaring, hieronder zijn veel voorkomende problemen die we tegenkwamen:
- Slechte scheiding van de epidermis: Dit kan worden veroorzaakt door incomplete dispase behandeling (Gelieve meer tijd van diapase behandeling) of onvoldoende dispase oplossing (De huid moet volledig ondergedompeld in dispase oplossing). We maken gebruik van ten minste 5 ml dispase oplossing voor een muis. Het volume kan variëren op basis van de grootte van de huid.
- Lage opbrengst van het aantal cellen: Dit kan als gevolg van onvolledige vertering met collagenase IV. Gelieve eerst cheque collagenase concentratie of vervaldatum. Dit kan ook worden veroorzaakt door onvoldoende hoeveelheid epidermis toegepast. Voorts moet enzymdigestie worden uitgevoerd bij tot 37 ° C onder schudden (gelieve temperatuur aanpassen voordat uitvoeren spijsvertering).
- Celklonten: Dit is heel gebruikelijk voor huidcellen (pipet celleneen paar keer na via zeef (vóór centrifugatie) of aanwezigheid van Mg2 + en Ca2 + in oplossing (gebruik Mg 2 + en Ca2 +-vrij PBS cel wassen).
- Te veel dode cellen: Dit kan een gevolg van aangetaste weefsels (gebruik verse weefsels), of over-vergisting (vermijd langdurige incubatie met dispase en collagenase IV).
Dit protocol kan worden gecombineerd met beenmergtransplantatie of weefseltransplantatie de cel oorsprong te onderzoeken. Bijvoorbeeld, transplantatie van GFP-expressie beenmergcellen in lethaal bestraalde muizen zal ons toelaten om de bijdrage van beenmergcellen aan tumor-geassocieerde fibroblasten en myeloïde cellen te onderzoeken. Op dezelfde manier kan huidtumoren worden getransplanteerd in een nieuwe muis gastheer voor tumor-gastheer interacties te onderzoeken.
Naast celpopulatie veranderingen te onderzoeken tijdens carcinogenese, zal dit protocol ook kunnen onderzoekers te onderzoekeneffecten van drugs behandelingen om de cellen in de tumoromgeving. Hoewel dit protocol is ontworpen om te gebruiken voor celpopulatie analyses tijdens huidcarcinogenese, geringe modificaties kunnen worden gemaakt voor andere vormen van kanker.
Samenvattend kan celpopulatie analyses in muismodellen van huidkanker ons de dynamische cellulaire veranderingen tijdens carcinogenese, waardoor een beter begrip van celbiologie in neoplastische transformatie en verschillende cellulaire gebeurtenissen in het transformatieproces.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door NCI (R01-94160 en R01-155086), IE Simon Cancer Center en Wells Center for Pediatric Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
References
- Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
- Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
- Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
- Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
- Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
- Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
- Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
- Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
- Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
- Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
- Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
- Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
- Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
- Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
- Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
- Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
- Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
- Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
- Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
- Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
- Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
- Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
- Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
- Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
- Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).
- Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
- Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).
- Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).
