Summary
Cancérogenèse est un processus impliquant des interactions entre les cellules cancéreuses et le micro de cancer. Pour disséquer les événements moléculaires, il faut isoler les différentes populations de cellules à différents stades au cours du développement du cancer. En utilisant un modèle de souris pour le carcinome basocellulaire, nous décrivons un protocole pour les analyses cellulaires au cours de la cancérogenèse.
Abstract
le développement du cancer est un processus en plusieurs étapes impliquant des nombreux types cellulaires dont les cellules cancéreuses, les précurseurs des cellules immunitaires, les fibroblastes et les cellules endothéliales. Chaque type de cellules subit signalisation et fonctionnel changements au cours de la cancérogenèse. Le défi actuel pour de nombreux chercheurs sur le cancer est de disséquer ces changements dans chaque type de cellule pendant le processus à étapes multiples in vivo. Au cours des dernières années, les auteurs ont mis au point un ensemble de procédures pour isoler différentes populations de cellules au cours du développement du cancer de la peau à l'aide K14creER/R26-SmoM2 souris YFP. La procédure est divisée en 6 parties: 1) la génération de souris appropriés pour l'étude (K14creER et R26-SmoM2 YFP souris dans ce protocole) + +, 2) induisant SmoM2 YFP expression dans la peau de souris; 3) la préparation des biopsies de la peau de souris; 4) l'isolement épiderme de la peau; 5) la préparation d'épiderme à partir de cellules individuelles; 6) l'étiquetage des populations de cellules uniques pour l'analyse par cytométrie en flux.Génération d'un nombre suffisant de souris avec le droit génotype est l'étape limitante dans ce protocole, qui peut prendre jusqu'à deux mois. Le reste des étapes de prendre quelques heures à quelques jours. Dans ce protocole, nous incluons également une section pour le dépannage. Bien que nous nous concentrons sur le cancer de la peau, ce protocole peut être modifiée pour s'appliquer à d'autres modèles animaux de maladies humaines.
Introduction
Comme le type le plus commun de cancer chez l'homme, le carcinome basocellulaire (BCC) affecte environ 2 millions d'Américains par an 1. Les preuves accumulées indiquent que l'activation anormale de hérisson (Hh) de signalisation est la force motrice qui sous-tend le développement BCC (Evalué à 2,3). Modifications de signalisation Hh dans BCC comprennent des mutations inactivant de PTCH1 4-6, les mutations gain de fonction de SMO 7-9, et l'expression aberrante de Hh voie facteurs de transcription Gli1 10 et GLI2 11 ou inactivés mutations rares de Su régulateur négatif (Fu ) 12. A travers toutes ces études et d'autres, la Federal Drug Administration (FDA) a récemment approuvé l'utilisation de Hh signalisation inhibiteur Vismodegib pour traiter métastatique ou localement avancé BCC 13-15.
Malgré toutes ces réalisations 16, nous ne comprenons pas encore les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels signalisation Hh drives CRACinogenesis. L'établissement de modèles animaux en utilisant activation tissu-spécifique de la signalisation Hh est toujours important pour ces études et pour notre compréhension de la résistance aux médicaments. Chez les souris, les souris de type sauvage ne se développent pas BCC, même sous de fortes doses de rayonnement UV ou ionisants cancérigènes. En revanche, PTCH1 + / - souris sont sensibles au développement BCC 17,18. La pénétrance de développement BCC dans Ptch1 + / - souris est supérieure à 50%, bien que PTCH1 18,19 + / - souris développent rarement BCC atteint leur pleine croissance si elles sont conservées dans des conditions normales. En raison de la létalité embryonnaire de Ptch1 - / -, KO tissu-spécifique de PTCH1 est généralement utilisé pour l'étude 20. En outre, expression conditionnelle peau spécifique de oncogénique SmoM2 YFP (Krt14-créer: R26-SmoM2 YFP ou Krt14-cre: R26-SmoM2 YFP) conduit à la formation de plusieurs BCC microscopiques à un âge très précoce, en fournissant un test génétique facile pour signalisation Hh fontwnstream de SMO 21.
Il ya trois problèmes majeurs dans notre connaissance de la biologie BCC. Tout d'abord, l'origine cellulaire des carcinomes basocellulaires n'est pas tout à fait clair. Alors que certaines études appuient le bouger de follicule pileux comme le site de cellules souches 22-24, Youssef et al. 25 localisé la cellule murin d'origine cutanées des tumeurs Hh axées être dans la région de l'épiderme inter-folliculaire, pas dans le follicule pileux , en utilisant Cre spécifique des cellules à activer l'expression d'un ROSA26 axée transgénique mutant SMO. Deuxièmement, les interactions cellulaires au cours du développement BCC ne sont pas bien comprises. Il est connu que les kératinocytes avec la signalisation Hh activé peut conduire à la formation de BCC, mais d'autres changements cellulaires ne sont pas bien compris. En outre, le traitement de SMO antagonistes chez la souris peut conduire à la résistance aux médicaments 26-28. Ainsi, de nouvelles cibles pour BCC sont grandement nécessaires. La compréhension de ces trois questions, il faut des analyses des changements cellulaires chez la souris pendant cancérogènesenesis. Alors que plusieurs méthodes ont été publiés pour la culture des kératinocytes, la cytométrie en flux et l'isolement des cellules souches de la peau 29-31, il n'y a aucun procédures complètes pour des analyses cellulaires dans BCC de souris. En combinant des méthodes pour le modèle murin de BCC, la séparation de l'épiderme, la production de cellules individuelles à partir d'analyses cellulaires et des tissus, nous allons fournir aux lecteurs un ensemble de procédures pour étudier la signalisation cellulaire, cellulaires et les interactions moléculaires au cours du développement BCC. Nous pensons que ce protocole permettra aux lecteurs de voir comment chaque procédure est accomplie. En outre, nous avons fourni quelques données pour illustrer ce que les résultats devraient ressembler et le dépannage pour aider les lecteurs à surmonter les difficultés au cours de l'exécution de ces procédures.
Protocol
Cette étude a été approuvée par le comité IACUC à l'Indiana University School of Medicine.
1. Générer des souris avec des génotypes corrects
- Établir un modèle murin de la BCC. Compagnon K14-CREER souris (Jackson laboratoire stock numéro 005107) avec R26-SmoM2 YFP souris (Jackson laboratoire stock numéro 005130) (18) pour générer K14-CREER + et R26-SmoM2 YFP + souris.
- Effectuer le génotypage. Spécimens queue Immerger (0,5 cm de long) dans une solution de lyse queue directPCR avec 1 mg / ml de protéinase K à 55 ° C pendant la nuit avec agitation. Le lendemain, retirer les débris de tissu par centrifugation à la vitesse supérieure dans une micro-centrifugeuse (pour garder le surnageant pour le génotypage). Utilisez 1 pl du surnageant pour chaque réaction PCR avec des amorces et des conditions recommandées par le fournisseur. Sélectionnez les souris avec les bons génotypes (à l'âge de 3-6 semaines, la buprénorphine à 0,05-0,1 mg / kg sera appliqué par chaque SQ 8-12 h pendant 2-3 jours après queue snip) for l'étape 2.
2. Induire l'expression de SmoM2 dans les kératinocytes de la peau
Provoquer SmoM2 expression dans les kératinocytes par l'administration orale de tamoxifène (5 mg / kg de poids corporel dans 50 ml d'huile végétale dans chaque repas) pendant 5 jours consécutifs par gavage oral avec une aiguille d'alimentation (courbe de calibre 20).
3. La préparation des échantillons de peau
En général, les phénotypes sont plus sévères sur l'oreille et la queue dans K14creER/R26SmoM2 GFP souris. Pour se préparer à des analyses cellulaires, nous récoltons premier la peau de la souris après le sacrifice des animaux avec une procédure approuvée institutionnel (CO 2 plus dislocation cervicale).
4. Isoler épiderme
- Après souris de sacrifice avec une procédure approuvée (voir l'étape 3), enlever la fourrure à l'aide d'une tondeuse. Échantillons de peau plonger dans une solution dispase (5 mg / ml dans du DMEM avec 10% de FBS) à 37 ° C pendant 1-2 heures (1 heure pour les souris âgés de moins de 8 semaines et 2 heurespour les souris âgées de 8 semaines).
- Après le traitement de dispase, épiderme séparé du derme par forceps.
5. Générer des cellules individuelles
- Pour obtenir seule population cellulaire, émincer l'épiderme par des ciseaux et puis plonger dans la solution de collagénase IV (1 mg / ml dans du DMEM avec 10% de FBS) pendant 1-2 heures à 37 ° C dans un tube de 50 ml. Essayez de mélanger doucement les tubes toutes les 20 minutes pour aider dissociation cellulaire.
- Inspectez dissociation cellulaire au microscope. Lorsque des cellules individuelles peuvent être détectés dans le milieu de la collagénase, incuber l'échantillon pendant 30 minutes supplémentaires pour augmenter le rendement des cellules. En général, l'épiderme d'une souris peut produire jusqu'à 10 7 cellules.
- Filtrer le mélange de tissu à travers tamis cellulaire (taille des pores 70 um), les cellules de spin bas à 1500 rpm via paillasse centrifugation, et laver une fois de temps avec PBS.
6. Les cellules d'étiquetage et d'effectuer des analyses de cytométrie en flux
- Reprendre les cellules dans 10% de FBSdans du PBS à 2,5 x 10 6 cellules / ml pour bloquer la liaison non spécifique (sur de la glace pendant 30 minutes)
- Prélever des cellules à chacun des microtubes de 1,5 ml pour l'étiquetage des anticorps spécifiques. Ajouter anticorps différents à chaque tube à une concentration finale de 2 mg / ml. Mélanger anticorps avec les cellules par l'intermédiaire d'un sommet doux pendant quelques secondes et laisser sur la glace pendant 30 min, puis laver avec 1 ml de PBS. Pour les échantillons BCC, nous avons utilisé les anticorps de biomarqueurs suivants: CD11b-PE, plus Gr1-APC (cellules myéloïdes ou des cellules myéloïdes suppressives dérivées); vimentine-FITC (fibroblastes) (voir réactifs pour plus de détails).
- Pour la coloration intracellulaire, nous utilisons un kit et suivre le manuel de l'éditeur (voir Réactifs pour plus de détails). Nous utilisons des cellules fraîches pour analyser les marqueurs de surface cellulaire. Après coloration des marqueurs de surface, laver les cellules, et les remettre en suspension dans PBS. Ajouter DAPI pour le mélange de cellules à une concentration finale de 1 ng / ml. DAPI se colorer les cellules mortes qui sera fermée à partir des analyses plus poussées.
- Analyser les données avec spécifilogiciel c. Nous sélectionnons d'abord des cellules individuelles sur la base du FSC vs SSC complot, et utilisons DAPI population négatif (cellules vivantes) pour une analyse plus approfondie.
Representative Results
Il est connu que les souris ne développent pas les carcinomes basocellulaires, sauf avec l'activation de signalisation Hh. Figure 1 montre le phénotype de la peau suite à l'expression induite de oncogénique lissée, SmoM2 YFP. Figure 2 montre l'analyse des cellules myéloïdes chez des souris normales et porteur d'une tumeur. CD11b + + cellules Gr1 sont dérivées de cellules myéloïdes, et certains d'entre eux sont myéloïde cellules suppressives dérivées. En situation normale, le CD11b + Gr1 + population cellulaire est difficilement détectable, mais va augmenter en réponse à l'inflammation ou le développement de tumeurs. Nous avons montré que l'expression induite de SmoM2YFP dans les résultats de la peau par une augmentation de CD11b + Gr1 + cellules. Actuellement, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce changement de BCC ne sont pas claires.
Figure 1. Morphological changements après induction SmoM2YFP dans la peau de souris. du haut montre un schéma de génotypes de souris. Le panneau du milieu: le K14creER + et R26-SmoM2 YFP + souris traitées par le tamoxifène a montré grossièrement anomalie dans la peau (à droite) ainsi que des tumeurs de la peau dans la section H & E (à gauche). Le panneau du bas: la souris sans SmoM2YFP induction a montré une peau d'apparence normale (à droite) et aucune morphologie anormale dans la section H & E (à gauche).
Figure 2. D'analyse de flux de CD11b + + cellules Gr1. Afin d'examiner le changement de CD11b + + cellules Gr1 pendant le développement du cancer de la peau, nous avons isolé les cellules simples et colorées avec des anticorps marqué par fluorescence à CD11b et Gr1. Après analyse avec FlowJo, nous avons remarqué une augmentation de cette population de cellules dans les tissus de la peau chez des souris traitées par le tamoxifène.
Discussion
Nous avons décrit une méthode d'analyse de la population cellulaire dans les BCC. Les tissus tumoraux sont conformes de nombreux types de cellules, et chaque type de cellule se comporte différemment à un moment donné de la cancérogenèse, qui est très difficile à retrouver même dans les meilleures conditions in vitro. En utilisant ce protocole, nous avons montré que le développement du carcinome basocellulaire est accompagné par l'expansion des cellules souches de l'épiderme ainsi que le recrutement des cellules myéloïdes. En comparaison avec l'immunohistochimie ou immunofluorescence analyses, les analyses de la population de cellules donnent une évaluation plus quantitative de l'évolution de la population de cellules depuis des anticorps spécifiques à une variété de types de cellules sont maintenant disponibles.
Pour ce protocole, à 10 semaines sont nécessaires pour terminer l'étude parce que le changement phénotypique de l'induction du gène nécessite du temps. Il est donc important de planifier l'expérience à l'avance. Pour l'isolement et l'analyse cellulaire, deux jours entiers peuvent être nécessaires. Parce que les cellules vivantes sont utilisés pour analyses, il est important de réserver une FACSCalibur avance. Nous avons également énuméré les problèmes communs lorsque l'on travaille avec ce protocole (voir ci-dessous).
Dans notre expérience, ci-dessous sont des problèmes communs que nous avons rencontrés:
- Mauvais séparation de l'épiderme: Cela peut être causé par un traitement incomplet dispase (Veuillez augmenter le temps de traitement diapase) ou une solution de dispase insuffisante (La peau a besoin d'être totalement immergé dans une solution dispase). Nous utilisons au moins 5 ml de solution dispase pour une souris. Le volume peut varier en fonction de la taille de la peau.
- Faible rendement du nombre de cellules: Cette mai en raison de la digestion incomplète par la collagénase IV. S'il vous plaît premier concentration de la collagénase de chèque ou de la date d'expiration. Cela peut aussi être causée par une quantité insuffisante de l'épiderme utilisé. En outre, la digestion enzymatique doit être effectuée à 37 ° C avec agitation (s'il vous plaît ajuster la température avant de réaliser la digestion).
- amas de cellules: Ceci est très fréquent pour les cellules de la peau (cellules pipettequelques fois après avoir traversé la crépine (avant centrifugation), ou l'existence de Mg 2 + et Ca 2 + dans la solution (s'il vous plaît utiliser Mg 2 + et Ca 2 + sans PBS pour le lavage de la cellule).
- Trop de cellules mortes: Cela peut être le résultat de tissus dégradés (s'il vous plaît utiliser les tissus frais), ou sur-digestion (éviter incubation prolongée avec dispase et de la collagénase IV).
Ce protocole peut être combinée à une transplantation de moelle osseuse ou une transplantation de tissu à examiner à l'origine de la cellule. Par exemple, la transplantation de cellules exprimant la GFP de la moelle osseuse des souris mortellement irradiées va nous permettre d'examiner la contribution des cellules de la moelle osseuse à des fibroblastes associés aux tumeurs et des cellules myéloïdes. De même, des tumeurs de la peau peuvent être transplantées dans un nouvel hôte de la souris pour examiner les interactions tumeur-hôte.
En plus d'examiner l'évolution de la population de cellules au cours de la cancérogenèse, ce protocole permettra également aux chercheurs d'examinereffets des traitements médicamenteux pour les cellules dans l'environnement tumoral. Bien que ce protocole est conçu pour utiliser des analyses de la population de cellules au cours de la carcinogenèse cutanée, de légères modifications peuvent être apportées à d'autres types de cancer.
En résumé, les analyses de la population de cellules dans des modèles murins de cancer de la peau peuvent nous donner les changements dynamiques cellulaires au cours de la cancérogenèse, conduisant à une meilleure compréhension de la biologie cellulaire dans la transformation néoplasique et différents événements cellulaires dans le processus de transformation.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le NCI (R01-R01-94160 et 155086), IU Simon Cancer Center et Wells Center for Pediatric Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
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