Summary
Carcinogenesis कैंसर कोशिकाओं और कैंसर microenvironment के बीच बातचीत से जुड़े एक प्रक्रिया है. आणविक घटनाओं के टुकड़े करने के लिए, एक कैंसर के विकास के दौरान विभिन्न चरणों में अलग सेल आबादी को अलग करने की जरूरत है. बेसल सेल कार्सिनोमा के लिए एक माउस मॉडल का उपयोग करना, हम carcinogenesis के दौरान सेल विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है.
Abstract
कैंसर के विकास के कैंसर अग्रदूत साबित कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, fibroblasts और endothelial कोशिकाओं सहित कई प्रकार की कोशिकाओं से जुड़े कई कदम प्रक्रिया है. कोशिकाओं के प्रत्येक प्रकार carcinogenesis के दौरान संकेत और कार्यात्मक परिवर्तन आए. कई कैंसर शोधकर्ताओं के लिए वर्तमान चुनौती vivo में कई कदम प्रक्रिया के दौरान प्रत्येक कोशिका प्रकार में इन परिवर्तनों को काटना है. पिछले कुछ वर्षों में, लेखकों K14creER/R26-SmoM2 YFP चूहों का उपयोग त्वचा कैंसर के विकास के दौरान अलग सेल आबादी को अलग करने के लिए प्रक्रियाओं का एक सेट विकसित किया है. अलग) 4, माउस त्वचा बायोप्सी की तैयारी 3), माउस त्वचा में 2) उत्प्रेरण SmoM2 YFP अभिव्यक्ति, अध्ययन के लिए उपयुक्त चूहों (K14creER + और R26-SmoM2 YFP + इस प्रोटोकॉल में चूहों) सृजन: 1) प्रक्रिया 6 भागों में विभाजित है त्वचा से एपिडर्मिस, 5) एपिडर्मिस से एकल कक्षों की तैयारी, 6) प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए एक सेल आबादी लेबलिंग.सही जीनोटाइप के साथ चूहों के लिए पर्याप्त संख्या की पीढ़ी के दो महीने तक लग सकते हैं जो इस प्रोटोकॉल में सीमित कदम है. कदम के आराम के लिए कुछ दिनों के लिए कुछ घंटे लगेंगे. इस प्रोटोकॉल में, हम भी समस्या निवारण के लिए एक खंड शामिल हैं. हम त्वचा कैंसर पर ध्यान केंद्रित हालांकि, इस प्रोटोकॉल मानव रोगों के अन्य पशु मॉडल के लिए लागू करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
Introduction
मानव कैंसर का सबसे आम प्रकार के रूप में, बेसल सेल कार्सिनोमा (बीसीसी) वर्ष 1 लाख प्रति 2 के बारे में अमेरिकियों को प्रभावित करता है. सबूत जमते हाथी (एच एच) संकेत है कि असामान्य सक्रियण संकेत मिलता बीसीसी विकास (2,3 में समीक्षित) अंतर्निहित असली ताकत है. BCCs में संकेत दे चुके परिवारों की बदलाव निष्क्रिय PTCH1 4-6 की म्यूटेशन, एसएमओ 7-9 के लाभ के समारोह म्यूटेशनों, और HH मार्ग प्रतिलेखन कारक GLI1 10 और GLI2 11 या नकारात्मक नियामक र की दुर्लभ निष्क्रिय म्यूटेशन (फू की न्यायपालिका अभिव्यक्ति शामिल ) 12. इन सभी और अन्य अध्ययनों के माध्यम से, फेडरल ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) ने हाल ही में BCCs 13-15 metastatic और स्थानीय रूप से उन्नत करने के लिए इलाज Hh संकेत अवरोध Vismodegib के उपयोग को मंजूरी दी है.
इन सब उपलब्धियों के 16 के बावजूद, हम अभी भी Hh संकेत CARC जो ड्राइव से आणविक और सेलुलर तंत्र समझ में नहीं आताinogenesis. Hh संकेत के ऊतक विशेष सक्रियण का उपयोग कर पशु मॉडल की स्थापना इन अध्ययनों के लिए और दवा प्रतिरोध के बारे में हमारी समझ के लिए अब भी महत्वपूर्ण है. चूहों में, जंगली की तरह चूहे भी, कार्सिनोजन यूवी या विकिरण की भारी खुराक के तहत, BCCs विकसित नहीं है. इसके विपरीत, Ptch1 / - चूहों बीसीसी विकास 17,18 लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. सामान्य परिस्थितियों में रखा है अगर चूहों शायद ही कभी पूर्ण विकसित BCCs विकसित - Ptch1 में बीसीसी विकास की अंतर्वेधन / - Ptch1 / + हालांकि चूहों 50% से अधिक 18,19 है. Ptch1 की भ्रूण मारक के कारण - / -, PTCH1 के ऊतक विशेष पीटकर आम तौर पर अध्ययन के 20 के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके अलावा, oncogenic SmoM2 YFP (Krt14-CreER: R26-SmoM2 YFP या Krt14-रचनात्मक: R26-SmoM2 YFP) की सशर्त त्वचा के विशिष्ट अभिव्यक्ति के लिए एक आसान जेनेटिक परख प्रदान करने, एक बहुत कम उम्र में कई सूक्ष्म BCCs के गठन की ओर hh संकेत करते हैंएसएमओ 21 की wnstream.
बीसीसी जीव विज्ञान के हमारे ज्ञान में तीन प्रमुख मुद्दे हैं. सबसे पहले, BCCs के सेलुलर मूल पूरी तरह स्पष्ट नहीं है. कुछ अध्ययनों से स्टेम सेल साइट 22-24 के रूप में बाल कूप की हिलता का समर्थन करते हैं, युसुफ एट अल. 25 बाल कूप में, अंतर - कूपिक एपिडर्मिस क्षेत्र में होने की त्वचीय Hh संचालित ट्यूमर की मूल के murine सेल नहीं स्थानीयकृत , एक ROSA26 संचालित ट्रांसजेनिक उत्परिवर्ती एसएमओ की अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए सेल विशिष्ट Cre का उपयोग करके. बीसीसी के विकास के दौरान दूसरा, सेलुलर बातचीत अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं. यह सक्रिय Hh संकेत के साथ केरेटिनकोशिकाओं BCCs के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जाना जाता है, लेकिन अन्य सेलुलर परिवर्तन अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं. इसके अलावा, चूहों में एसएमओ विरोधी के उपचार दवा प्रतिरोध 26-28 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. बीसीसी के लिए इस प्रकार उपन्यास लक्ष्य बहुत जरूरत है. इन तीन मुद्दों को समझना carcinog दौरान चूहों में सेलुलर परिवर्तन के विश्लेषण की आवश्यकता हैenesis. कई तरीकों keratinocyte संस्कृति, प्रवाह cytometry और त्वचा स्टेम सेल अलगाव 29-31 के लिए प्रकाशित किया गया है, माउस BCCs में सेल विश्लेषण के लिए कोई व्यापक प्रक्रियाओं वर्तमान में कर रहे हैं. BCCs के माउस मॉडल, एपिडर्मिस की जुदाई, ऊतकों और सेल विश्लेषण से एकल कक्षों की पीढ़ी के लिए विधियों के संयोजन से, हम बीसीसी विकास के दौरान सेल संकेतन, सेलुलर और आणविक बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रक्रियाओं का एक सेट के साथ पाठकों को प्रदान करेगा. हम इस प्रोटोकॉल पाठकों प्रत्येक प्रक्रिया को पूरा किया है देखने के लिए अनुमति देगा. इसके अलावा, हम परिणाम कैसा दिखना चाहिए उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए कुछ डेटा प्रदान की है, और पाठकों को इन प्रक्रियाओं के प्रदर्शन के दौरान कठिनाइयों को दूर करने के लिए मदद करने के लिए समस्या निवारण.
Protocol
इस अध्ययन मेडिसिन के इंडियाना विश्वविद्यालय के स्कूल में IACUC समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है.
1. सही जीनोटाइप के साथ चूहे उत्पन्न
- BCCs की एक माउस मॉडल स्थापित करना. R26-SmoM2 YFP चूहों (जैक्सन प्रयोगशाला स्टॉक संख्या 005130) (18) के साथ मेट K14-CreER चूहों (जैक्सन प्रयोगशाला स्टॉक संख्या 005107) K14-CreER + और R26-SmoM2 YFP + चूहों उत्पन्न करने के लिए.
- जीनोटाइपिंग प्रदर्शन करना. 1 मिलीग्राम / एमएल proteinase कश्मीर के साथ directPCR पूंछ lysis समाधान में विसर्जित पूंछ नमूनों (0.5 सेमी लंबे) 55 डिग्री सेल्सियस झटकों के साथ रात भर. अगले दिन, (जीनोटाइपिंग के लिए सतह पर तैरनेवाला रखने के लिए) एक सूक्ष्म अपकेंद्रित्र में शीर्ष गति पर centrifugation द्वारा ऊतक मलबे को हटा दें. विक्रेता द्वारा सिफारिश की प्राइमरों और शर्तों के साथ प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए सतह पर तैरनेवाला के 1 μl का प्रयोग करें. सही जीनोटाइप (3-6 सप्ताह की आयु, 0.05-0.1 पर buprenorphine पर मिलीग्राम / किग्रा पूंछ कटाव के बाद 2-3 दिनों के लिए वर्ग हर 8-12 घंटे के माध्यम से लागू किया जाएगा) के लिए के साथ चूहों का चयन करेंआर चरण 2.
2. त्वचा keratinocytes में SmoM2 की अभिव्यक्ति को प्रेरित
एक खिला सुई (20 गेज घुमावदार) के साथ मौखिक नलिका - पोषण के माध्यम से लगातार 5 दिनों के लिए tamoxifen (प्रत्येक भोजन में वनस्पति तेल के 50 मिलीलीटर में 5 ग्राम / किग्रा शरीर के वजन) के मौखिक प्रशासन द्वारा keratinocytes में SmoM2 अभिव्यक्ति को प्रेरित.
3. त्वचा के नमूने की तैयारी
सामान्य में, phenotypes के K14creER/R26SmoM2 GFP चूहों में कान और पूंछ पर अधिक गंभीर हैं. सेल विश्लेषण के लिए तैयार करने के लिए, हम पहली बार एक संस्थागत अनुमोदित प्रक्रिया (सीओ 2 प्लस ग्रीवा अव्यवस्था) के साथ पशु बलि के बाद माउस त्वचा फसल.
4. एपिडर्मिस अलग
- एक अनुमोदित प्रक्रिया (चरण 3 देखें) के साथ बलिदान चूहों के बाद, एक trimmer का उपयोग फर हटा दें. 37 में dispase समाधान (10% FBS के साथ DMEM में 5 मिलीग्राम / एमएल) ° 1-2 घंटा (कम से कम 8 सप्ताह पुरानी है और 2 घंटा चूहों के लिए 1 घंटे के लिए सी में विसर्जित त्वचा के नमूनों) 8 सप्ताह की तुलना में पुराने चूहों के लिए.
- बाद dispase उपचार, संदंश द्वारा त्वचा से अलग एपिडर्मिस.
5. एकल कक्ष उत्पन्न
- एकल कक्ष जनसंख्या प्राप्त करने के लिए, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 1-2 घंटे के लिए collagenase चतुर्थ समाधान (10% FBS के साथ DMEM में 1 मिलीग्राम / एमएल) में विसर्जित तो कैंची से एपिडर्मिस कीमा और. धीरे ज़ुल्फ़ ट्यूबों सेल विसंघटन मदद करने के लिए हर 20 मिनट के लिए प्रयास करें.
- खुर्दबीन के नीचे सेल विसंघटन निरीक्षण किया. एकल कक्षों collagenase माध्यम में पता लगाया जा सकता है, जब सेल उपज बढ़ाने के लिए एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए नमूना सेते हैं. सामान्य तौर पर, एक माउस से एपिडर्मिस 10 7 कोशिकाओं के लिए ऊपर प्राप्ति कर सकते हैं.
- बेंच शीर्ष centrifugation के माध्यम से 1500 rpm पर सेल झरनी (ताकना आकार 70 माइक्रोन), स्पिन कोशिकाओं के माध्यम से ऊतक मिश्रण नीचे फिल्टर, और पीबीएस के साथ समय एक बार धोने.
6. लेबल कोशिकाओं और फ्लो विश्लेषण प्रदर्शन करना
- 10% FBS में कोशिकाओं Resuspendपीबीएस में 2.5 x 10 6 कोशिकाओं / गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक मिलीलीटर (बर्फ पर 30 मिनट के लिए)
- विशिष्ट एंटीबॉडी लेबलिंग के लिए 1.5 मिलीलीटर microtubes से प्रत्येक के लिए कोशिकाओं का एक विभाज्य लो. 2 ग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में प्रत्येक ट्यूब अलग एंटीबॉडी जोड़ें. कई सेकंड के लिए एक सौम्य शीर्ष के माध्यम से कोशिकाओं के साथ एंटीबॉडी मिक्स और 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धो लो, फिर 30 मिनट के लिए बर्फ पर उन्हें छोड़ दें. ; Vimentin-FITC (तंतुप्रसू) (विवरण के लिए अभिकर्मकों देखें) CD11b पीई प्लस GR1-एपीसी (माइलॉयड कोशिकाओं या माइलॉयड व्युत्पन्न शमन कोशिकाओं): बीसीसी नमूनों के लिए, हम निम्नलिखित बायोमार्कर के लिए एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया.
- इंट्रासेल्युलर धुंधला के लिए, हम एक किट का उपयोग और (विवरण के लिए अभिकर्मकों देखें) विक्रेता के मार्गदर्शन का पालन करें. हम कोशिका की सतह मार्करों का विश्लेषण करने के लिए नए सिरे से कोशिकाओं का उपयोग करें. सतह मार्कर धुंधला के बाद, कोशिकाओं को धो लो, और पीबीएस में उन्हें resuspend. 1 ग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में सेल मिश्रण को DAPI जोड़ें. DAPI के आगे के विश्लेषण से gated बाहर हो जाएगा कि मृत कोशिकाओं दाग होगा.
- Specifi के साथ डेटा का विश्लेषणग सॉफ्टवेयर. हम पहले FSC बनाम एसएससी भूखंड पर आधारित एकल कक्षों का चयन करें, और आगे के विश्लेषण के लिए DAPI नकारात्मक जनसंख्या (जीवित कोशिकाओं) का उपयोग करें.
Representative Results
यह चूहों Hh संकेत सक्रियण के साथ छोड़कर बेसल सेल कार्सिनोमा विकसित नहीं है कि जाना जाता है. चित्रा 1 smoothened oncogenic से प्रेरित अभिव्यक्ति का पालन त्वचा फेनोटाइप, SmoM2 YFP. चित्रा 2 सामान्य और ट्यूमर असर चूहों में माइलॉयड कोशिकाओं के विश्लेषण से पता चलता है दिखाता है. CD11b + GR1 + कोशिकाओं माइलॉयड कोशिकाओं से प्राप्त कर रहे हैं, और उनमें से कुछ व्युत्पन्न शमन कोशिकाओं माइलॉयड रहे हैं. सामान्य स्थिति में, CD11b + GR1 + कोशिकाओं की आबादी मुश्किल से detectable है, लेकिन सूजन या ट्यूमर के विकास के जवाब में वृद्धि होगी. हम CD11b + GR1 + कोशिकाओं में वृद्धि में त्वचा परिणामों में SmoM2YFP की कि प्रेरित अभिव्यक्ति दिखाया. वर्तमान में, BCCs में इस परिवर्तन अंतर्निहित आणविक तंत्र स्पष्ट नहीं हैं.
चित्रा 1. Morphologicaमाउस त्वचा में SmoM2YFP शामिल करने के बाद मैं बदल जाता है. शीर्ष माउस जीनोटाइप का एक चित्र से पता चलता है. मध्यम पैनल: tamoxifen के साथ इलाज K14creER + और R26-SmoM2 YFP + माउस एच ई अनुभाग में निहायत त्वचा में विषमता (दाएं) के साथ ही त्वचा ट्यूमर (बाएं) से पता चला है. नीचे पैनल: माउस SmoM2YFP प्रेरण के बिना सामान्य लग त्वचा (दाएं) और एच ई खंड (बाएं) में कोई असामान्य आकारिकी दिखाया.
चित्रा 2. CD11b + GR1 + कोशिकाओं का प्रवाह विश्लेषण. त्वचा कैंसर के विकास के दौरान CD11b + GR1 + कोशिकाओं के परिवर्तन की जांच करने के लिए, हम CD11b और GR1 को प्रतिदीप्ति लेबल एंटीबॉडी के साथ एकल कक्षों और दाग अलग. FlowJo साथ विश्लेषण करने के बाद, हम tamoxifen के इलाज चूहों से त्वचा के ऊतकों में इस सेल की आबादी की वृद्धि देखी.
Discussion
हम BCCs में सेल आबादी के विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन किया है. ट्यूमर ऊतकों कई प्रकार की कोशिकाओं की संगत कर रहे हैं, और प्रत्येक कोशिका प्रकार इन विट्रो स्थिति में सबसे अच्छा के तहत भी हटा देना बहुत कठिन है, जो carcinogenesis के एक निश्चित समय पर अलग ढंग से व्यवहार करता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम बेसल सेल कार्सिनोमा के विकास एपिडर्मल स्टेम कोशिकाओं के विस्तार के साथ ही माइलॉयड कोशिकाओं की भर्ती के साथ है कि पता चला है. Immunohistochemistry या immunofluorescent विश्लेषण के साथ इसकी तुलना में, सेल आबादी विश्लेषण सेल प्रकार की एक किस्म के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के बाद सेल जनसंख्या परिवर्तन का एक और मात्रात्मक आकलन दे अब उपलब्ध हैं.
जीन प्रेरण से प्ररूपी परिवर्तन समय की आवश्यकता है क्योंकि इस प्रोटोकॉल के लिए, 10 हफ्तों के अध्ययन की जरूरत को पूरा कर रहे हैं. यह समय से आगे के प्रयोग की योजना के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है. सेल अलगाव और विश्लेषण के लिए, पूरे दो दिन की जरूरत हो सकती है. जीवित कोशिकाओं analys के लिए उपयोग किया जाता हैतों, यह समय से आगे एक FACSCalibur आरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है. इस प्रोटोकॉल (देखें नीचे) के साथ काम कर रहा है, जब हम भी आम समस्याओं को सूचीबद्ध किया है.
हमारे अनुभव में, नीचे हम सामना करना पड़ा आम समस्याएं हैं:
- Epidermis के गरीब जुदाई: यह अधूरा dispase उपचार (diapase उपचार के समय को बढ़ाने के लिए धन्यवाद) या अपर्याप्त dispase समाधान (त्वचा पूरी तरह से dispase समाधान में डूब जाने की जरूरत है) की वजह से हो सकता है. हम एक माउस के लिए dispase समाधान के कम से कम 5 मिलीलीटर का उपयोग करें. मात्रा त्वचा के आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
- Collagenase चतुर्थ के साथ अधूरा पाचन के कारण यह हो सकता है: सेल संख्या की कम उपज. पहले की जांच collagenase एकाग्रता या समाप्त होने की तिथि कृपया. यह भी प्रयोग किया जाता है epidermis के अपर्याप्त राशि के कारण हो सकता है. इसके अलावा, एंजाइम पाचन डिग्री सेल्सियस (पाचन प्रदर्शन से पहले तापमान को समायोजित करें) झटकों के साथ 37 से कम किया जाना चाहिए.
- सेल clumps: यह (त्वचा कोशिकाओं के लिए पिपेट कोशिकाओं बहुत आम हैएक बार कुछ झरनी (centrifugation के पहले), या 2 मिलीग्राम के अस्तित्व के माध्यम से जाने के बाद + और सीए 2 + समाधान में (2 मिलीग्राम उपयोग कृपया सेल धोने के लिए + और सीए 2 + मुक्त पीबीएस).
- बहुत सारे मृत कोशिकाओं: यह (ताजा ऊतकों का उपयोग करें) अपमानित ऊतकों का परिणाम हो, या हो सकता है पर-पाचन (dispase और collagenase चतुर्थ के साथ विस्तारित ऊष्मायन से बचने).
इस प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण या सेल मूल की जांच करने के लिए ऊतक प्रत्यारोपण के साथ जोड़ा जा सकता है. उदाहरण के लिए, के प्रत्यारोपण GFP-व्यक्त घातक विकिरणित चूहों में अस्थि मज्जा की कोशिकाओं हमें ट्यूमर जुड़े fibroblasts और माइलॉयड कोशिकाओं को अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के योगदान की जांच करने की अनुमति देगा. इसी प्रकार, त्वचा ट्यूमर ट्यूमर मेजबान बातचीत की जांच के लिए एक नया माउस मेजबान में प्रत्यारोपित किया जा सकता है.
Carcinogenesis के दौरान सेल जनसंख्या परिवर्तन की जांच करने के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी शोधकर्ताओं की जांच करने की अनुमति देगाट्यूमर वातावरण में कोशिकाओं को दवा उपचार के प्रभाव. इस प्रोटोकॉल त्वचा के दौरान सेल की आबादी विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है हालांकि कर्कटजनन, मामूली संशोधनों के अन्य प्रकार के कैंसर के लिए बनाया जा सकता है.
संक्षेप में, त्वचा कैंसर के माउस मॉडल में सेल की आबादी का विश्लेषण हमें नवोत्पादित परिवर्तन में कोशिका जीव विज्ञान की एक बेहतर समझ के लिए अग्रणी carcinogenesis के दौरान गतिशील सेलुलर परिवर्तन, और परिवर्तन की प्रक्रिया में विभिन्न सेलुलर घटनाओं दे सकते हैं.
Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस अध्ययन NCI (R01-94160 और R01-155086), आइयू साइमन कैंसर केंद्र और बाल चिकित्सा अनुसंधान के लिए वेल्स केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
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