Summary
Kreftutvikling er en prosess som involverer samspillet mellom kreftceller og kreft mikromiljøet. Å dissekere de molekylære hendelser, må man isolere ulike celle populasjoner på forskjellige stadier i kreftutvikling. Bruke en mus modell for basal cell carcinoma, beskriver vi en protokoll for celle analyser under kreftutvikling.
Abstract
Kreftutvikling er en flere-trinns prosess som involverer mange celletyper, inkludert kreft forløper celler, immunceller, fibroblaster og endotelceller. Hver type celler gjennomgår signalering og funksjonelle endringer i kreftutvikling. Utfordringen for mange kreftforskere er å dissekere disse endringene i hver celletype i flere trinn in vivo. I de siste årene har forfatterne utviklet et sett av prosedyrer for å isolere ulike celle populasjoner under hudkreft utvikling ved hjelp K14creER/R26-SmoM2 YFP mus. Prosedyren er delt inn i seks deler: 1) generere passende mus for studien (K14creER + og R26-SmoM2 YFP + mus i denne protokollen), 2) inducing SmoM2 YFP uttrykk i mus hud, 3) forbereder mus hud biopsier, 4) isolering Epidermis fra huden, 5) fremstilling av enkeltceller fra epidermis, 6) merking av enkelt-celle populasjoner for strømningscytometri-analyse.Generasjon av tilstrekkelig antall mus med riktig genotype er den begrensende trinn i denne protokollen, noe som kan ta opptil to måneder. Resten av trinnene ta noen timer til noen dager. Innenfor denne protokollen, vi har også en seksjon for feilsøking. Selv om vi fokuserer på hudkreft, kan denne protokollen endres til å gjelde for andre dyremodeller av menneskelige sykdommer.
Introduction
Som den vanligste typen av menneskelig kreft, påvirker basalcellekarsinom (BCC) om lag 2 millioner amerikanere hvert år en. Innsamling av bevismateriale tyder på at unormal aktivering av pinnsvin (tt) signal er drivkraften underliggende BCC utvikling (Anmeldt i 2,3). Endringer av Hh signalering i BCC inkluderer inaktivere mutasjoner av PTCH1 4-6, gain-of-funksjon mutasjoner av SMO 7-9, og avvikende uttrykk for Hh sti transkripsjonsfaktorer GLI1 10 og GLI2 11 eller sjeldne inaktivert mutasjoner av negativ regulator Su (Fu ) 12. Gjennom alle disse og andre studier, har Federal Drug Administration (FDA) har nylig godkjent bruk av Hh signalering inhibitor Vismodegib å behandle metastatisk og lokalavansert BCC 13-15.
Til tross for alle disse prestasjonene 16, har vi fortsatt ikke forstår de molekylære og cellulære mekanismer som Hh signalering driver carcinogenesis. Etablering av dyremodeller med vev-spesifikk aktivering av Hh signalering er fortsatt viktig for disse studiene, og for vår forståelse av resistens. Hos mus, gjør villtype mus ikke utvikler BCC, selv under store doser av kreftfremkallende stoffer, UV eller ioniserende stråling. I kontrast, Ptch1 + / - mus er utsatt for BCC utvikling 17,18. Den penetrans av BCC utvikling i Ptch1 + / - mus er over 50% 18,19 selv om Ptch1 + / - mus sjelden utvikle fullvoksne BCC hvis de holdes under normale forhold. På grunn av den embryoniske letalitet Ptch1 - / -, er vev-spesifikke knockout av PTCH1 vanligvis brukt for undersøkelsen 20.. I tillegg betinget hud-spesifikke uttrykk for oncogenic SmoM2 YFP (Krt14-creer: R26-SmoM2 YFP: R26-SmoM2 YFP eller Krt14-cre) fører til dannelsen av flere mikroskopiske BCC på et svært tidlig alder, noe som gir en enkel genetisk analyse for hh signalering gjørewnstream av SMO 21.
Det er tre store spørsmålene i vår kunnskap om BCC biologi. Først er den cellulære opprinnelsen til BCC ikke helt klart. Mens noen studier støtter rikke av hårsekken som stamcelleforskningen området 22-24, Youssef et al. 25. lokalisert murine celle opprinnelsesland kutane Hh-drevet svulster å være i inter-follikulær epidermis regionen, ikke i hårsekken , ved å bruke celle-spesifikk Cre for å aktivere ekspresjon av et transgent ROSA26-drevet mutant SMO. Sekund, cellulære interaksjoner BCC utvikling er ikke godt forstått. Det er kjent at keratinocytter med aktivert Hh signalering kan føre til dannelse av BCC, men andre cellulære endringer ikke er godt forstått. Videre kan behandling av Smo antagonister i mus føre til resistens 26-28. Dermed nye mål for BCC er stort behov. Forstå disse tre spørsmålene krever analyser av celleforandringer i mus under carcinogenesis. Mens flere metoder har blitt publisert for keratinocyte kultur, flowcytometri og hud stamceller isolert 29-31, er det i dag ingen omfattende prosedyrer for celle analyser i mus BCC. Ved å kombinere metoder for mus modell av BCC, separasjon av epidermis, generering av enkeltceller fra vev og celle analyser, vil vi gi leserne et sett av prosedyrer for å studere cellesignalisering, cellulære og molekylære interaksjoner under BCC utvikling. Vi tror at denne protokollen vil tillate leserne å se hvordan hver prosedyre er skjedd. I tillegg gav vi noen data for å illustrere hva resultatet skal se ut, og feilsøking for å hjelpe leserne til å overvinne vanskelighetene ved å utføre disse prosedyrene.
Protocol
Denne studien har blitt godkjent av IACUC komiteen ved Indiana University School of Medicine.
En. Generere Mus med riktige genotyper
- Etablere en mus modell av BCC. Mate K14-creer mus (Jackson laboratorium lager nummer 005107) med R26-SmoM2 YFP mus (Jackson laboratorium lager nummer 005 130) (18) å generere K14-creer + og R26-SmoM2 YFP + mus.
- Utføre genotyping. Fordyp hale prøvene (0,5 cm lang) på halen directPCR lysis løsning med 1 mg / ml proteinase K ved 55 ° C over natten med risting. Den neste dagen, fjerne vev rusk ved sentrifugering i full fart i en mikro-sentrifuge (for å holde supernatanten for genotyping). Bruk 1 ul av supernatanten for hver PCR-reaksjon med primerne og betingelser anbefalt av leverandøren. Velg musene med de rette genotyper (i en alder av 3-6 uker, buprenorfin på 0,05-0,1 mg / kg vil bli brukt via SQ hver 8-12 timer i 2-3 dager etter hale klipp) for trinn 2.
2. Indusere Expression of SmoM2 i Skin Keratinocytter
Induser SmoM2 ekspresjon i keratinocytter etter oral administrering av tamoxifen (5 mikrogram / kg kroppsvekt i 50 ml vegetabilsk olje i hver foring) i 5 påfølgende dager via mavesonde med en foring nål (20 gauge buet).
3. Forbereder Skin Prøver
Generelt, fenotyper er alvorligere på øret og halen i K14creER/R26SmoM2 GFP mus. For å forberede celle analyser, må vi først høste musen huden etter dyreofringer med en institusjonell godkjent prosedyre (CO 2 pluss halshugging).
4. Isolere epidermis
- Etter offer mus med godkjent prosedyre (se trinn 3), fjerne pels med en trimmer. Dypp hud prøver i dispase oppløsning (5 mg / ml i DMEM med 10% FBS) ved 37 ° C i 1-2 timer (1t for mus mindre enn 8 uker gamle og 2 timersfor mus enn 8 uker gamle).
- Etter dispase behandling, separat epidermis fra dermis av tang.
5. Generere enkeltceller
- For å oppnå enkel cellepopulasjon, hakke epidermis av saks og deretter senkes i collagenase IV-oppløsning (1 mg / ml i DMEM med 10% FBS) i 1-2 timer ved 37 ° C i et 50 ml rør. Prøv å virvle rørene hvert 20 min for å hjelpe celle disassociation.
- Inspisere celle disassociation henhold mikroskop. Når enkelt-celler kan påvises i collagenase medium, inkubere prøven i ytterligere 30 min for å øke celle-utbytte. Generelt kan overhuden fra en mus gi opp til 10 7 celler.
- Filtrere vev blandingen gjennom celle sil (pore størrelse 70 mikrometer), spin celler ned på 1500 rpm via benk topp sentrifugering, og vaske en gang tid med PBS.
6. Label Cells og utføre flowcytometrisystemer Analyser
- Resuspender cellene i 10% FBSi PBS ved 2,5 x 10 6 celler / ml for å blokkere ikke-spesifikk binding (på is i 30 min)
- Ta en porsjon av cellene til hver av 1,5 ml mikrorør for spesifikt antistoff merking. Legg forskjellige antistoffer til hvert rør ved en endelig konsentrasjon på 2 ug / ml. Bland antistoffer med celler via en mild toppunktet i flere sekunder og la dem på is i 30 min, vask deretter med 1 ml PBS. For BCC prøver, brukte vi antistoffer for følgende biomarkører: CD11b-PE pluss Gr1-APC (myeloide celler eller myeloid-deriverte suppressor celler), vimentin-FITC (fibroblast) (se reagenser for detaljer).
- For intracellulær flekker, bruker vi et kit og følg leverandørens manual (se Reagenser for detaljer). Vi bruker friske celler for å analysere celleoverflatemarkører. Etter overflate markør flekker, vaske cellene, og resuspender dem i PBS. Legg DAPI til celleblandingen ved en endelig konsentrasjon på 1 pg / ml. DAPI vil farge døde celler som vil være gated ut fra videre analyser.
- Analysere data med spesific programvare. Vi først velge enkeltceller basert på FSC versus SSC tomten, og bruke DAPI negativ befolkningsutvikling (levende celler) for videre analyse.
Representative Results
Det er kjent at mus ikke utvikler basalcellekreft unntatt med Hh signaliserer aktivering. Figur 1 viser hud fenotype etter indusert uttrykk for onkogene glattet, viser SmoM2 YFP. Figur 2 analyse av myeloide celler i normale og tumor-bærende mus. CD11b + Gr1 + celler er hentet fra myeloide celler, og noen av dem er myelogen avledet suppressor celler. I normal situasjon, CD11b + + Gr1 cellepopulasjon er knapt synlig, men vil øke som reaksjon på betennelse eller tumorutvikling. Vi viste at indusert uttrykk for SmoM2YFP i huden resulterer i en økning i CD11b + Gr1 + celler. Foreløpig de molekylære mekanismene bak denne endringen i BCC ikke klart.
Figur 1. Morphological endringer etter SmoM2YFP induksjon i mus huden. Den øverste viser et diagram av mus genotyper. Den midtre panelet: den K14creER + og R26-SmoM2 YFP + mus behandlet med tamoxifen viste grovt abnormitet i huden (til høyre) samt hudkreft i H & E delen (til venstre). Den nederste panelet: mus uten SmoM2YFP induksjon viste normal hud (til høyre) og ingen unormal morfologi i H & E delen (til venstre).
Figur 2. Flow analyse av CD11b + Gr1 + celler. For å undersøke endring av CD11b + Gr1 + celler i løpet av hudkreft utvikling, isolert vi enkeltceller og farget med fluorescens-merkede antistoffer til CD11b og Gr1. Etter analyse med FlowJo, la vi merke til en økning av denne cellen befolkningen i hudvev fra tamoxifen-behandlede mus.
Discussion
Vi har beskrevet en fremgangsmåte for cellepopulasjon analyse i BCC. Tumorvev er konsistente av mange celletyper, og hver celle type oppfører seg annerledes på et gitt tidspunkt av kreftutvikling, noe som er svært vanskelig å gjenskape selv under de beste in vitro forhold. Ved hjelp av denne protokollen, viste vi at utvikling av basalcellekreft er ledsaget av utvidelse av epidermal stamceller samt rekruttering av myeloide celler. I sammenligning med immunhistokjemi eller immunofluorescent analyser, cellepopulasjon analyser gir en mer kvantitativ vurdering av cellepopulasjon endringer siden spesifikke antistoffer til en rekke celletyper, er nå tilgjengelig.
For denne protokollen, er 10 uker for å fullføre studiet fordi fenotypisk endring fra genet induksjon krever tid. Det er derfor viktig å planlegge forsøket på forhånd. For celleisolasjon og analyser, kan to hele dager være nødvendig. Fordi levende celler brukes for analyses, er det viktig å reservere en FACSCalibur forhånd. Vi har også listet opp vanlige problemer når du arbeider med denne protokollen (se nedenfor).
I vår erfaring, nedenfor er vanlige problemene vi:
- Dårlig separasjon av epidermis: Dette kan være forårsaket av ufullstendig dispase behandling (Vennligst øke tiden av diapase behandling) eller utilstrekkelig dispase løsning (Huden trenger å bli totalt oppslukt i dispase løsning). Vi bruker på minst 5 ml av dispase løsning for en mus. Volumet kan variere basert på størrelsen av huden.
- Lav avkastning på celle nummer: Dette kan skyldes ufullstendig fordøyelse med collagenase IV. Vennligst første sjekken collagenase konsentrasjon eller utløpsdato. Dette kan også være forårsaket av utilstrekkelig mengde av epidermis benyttes. Videre bør enzym fordøyelsen utføres ved til 37 ° C med risting (vennligst justere temperaturen før utføre fordøyelse).
- Celle klumper: Dette er svært vanlig for hudceller (pipette cellernoen få ganger etter å gå gjennom silen (før sentrifugering), eller eksistensen av Mg 2 + og Ca 2 + i løsning (vennligst bruk Mg2 + og Ca2 +-fri PBS i celle vask).
- For mange døde celler: Dette kan være et resultat av degradert vev (vennligst bruk friske vev), eller over-fordøyelse (unngå forlenget inkubasjon med dispase og collagenase IV).
Denne protokollen kan kombineres med benmargstransplantasjon eller vevstransplantasjon å undersøke celle opprinnelse. For eksempel transplantasjon av GFP-uttrykke celler fra beinmargen til livsfarlige bestrålte mus vil gi oss mulighet til å undersøke bidraget fra benmargceller til tumor-assosierte fibroblaster og myeloide celler. Likeledes kan hud tumorer bli transplantert inn en ny vert mus for å undersøke tumor-vert interaksjoner.
I tillegg til å undersøke celle befolkningsendringer i løpet av kreft, vil denne protokollen også tillate forskere å undersøkeeffekter av medikamentell behandling til cellene i tumor miljø. Selv om denne protokollen er designet for å bruke for cellepopulasjonen analyser under huden av kreft, små endringer kan gjøres for andre krefttyper.
Oppsummert kan cellepopulasjonen analyser i musemodeller av hudkreft gi oss de dynamiske celleforandringer under kreftutvikling, som fører til en bedre forståelse av cellebiologi i neoplastisk transformasjon og ulike cellulære hendelser i transformasjonsprosessen.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NCI (R01-94160 og R01-155086), IU Simon Cancer Center og Wells Center for Pediatric Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
References
- Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
- Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
- Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
- Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
- Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
- Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
- Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
- Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
- Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
- Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
- Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
- Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
- Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
- Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
- Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
- Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
- Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
- Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
- Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
- Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
- Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
- Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
- Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
- Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
- Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).
- Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
- Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).
- Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).
