Summary
Carcinogenesis är en process som involverar interaktioner mellan cancerceller och cancer mikromiljö. Att dissekera de molekylära händelser, måste man isolera olika cellpopulationer vid olika stadier under utvecklingen av cancer. Med hjälp av en musmodell för basaliom, beskriver vi ett protokoll för cell analyser under cancer.
Abstract
Cancerutveckling är en multipel-steg process med många celltyper inklusive cancerceller föregångare, immunceller, fibroblaster och endotelceller. Varje typ av celler genomgår signalering och funktionella förändringar under cancer. Den stora utmaningen för många cancerforskare är att dissekera dessa förändringar i varje celltyp under flera steg in vivo. Under de senaste åren har författarna utvecklat en rad förfaranden för att isolera olika cellpopulationer under hudcancer utveckling med K14creER/R26-SmoM2 YFP möss. Förfarandet är uppdelat i 6 delar: 1) skapa lämpliga möss för studien (K14creER + och R26-SmoM2 YFP + möss i detta protokoll), 2) inducerande SmoM2 YFP uttryck i mushud, 3) förbereder biopsier mushud, 4) isolering epidermis från huden, 5) framställning enstaka celler från överhuden, 6) märkning encelliga populationer för flödescytometri analys.Generering av tillräckligt antal möss med rätt genotyp är den begränsande steget i detta protokoll, vilket kan ta upp till två månader. Resten av stegen ta några timmar till några dagar. Inom detta protokoll, har vi också ett avsnitt för felsökning. Även om vi fokuserar på hudcancer, kan detta protokoll ändras för att ansöka om andra djurmodeller för mänskliga sjukdomar.
Introduction
Eftersom den vanligaste typen av cancer hos människor, drabbar basalcellscancer (BCC) omkring 2 miljoner amerikaner per år 1. Ackumulerande bevis tyder på att onormal aktivering av hedgehog (HH)-signalering är den drivande kraften bakom BCC utveckling (Betygsatt under 2,3). Förändringar av Hh-signalering i BCC inkluderar inaktiverande mutationer av Ptch1 4-6, vinst-of-funktion mutationer av SMO 7-9, och onormalt uttryck av Hh faktorer pathway transkription Gli1 10 och Gli2 11 eller sällsynta inaktiverade mutationer av negativ regulator Su (Fu ) 12. Genom alla dessa och andra studier, har Federal Drug Administration (FDA) godkände nyligen användningen av Hh-signalering inhibitor vismodegib att behandla metastaserande och lokalt avancerad BCC 13-15.
Trots alla dessa framgångar 16, vi förstår fortfarande inte de molekylära och cellulära mekanismer genom vilka Hh-signalering driver carcinogenesis. Etablera djurmodeller med vävnads-specifik aktivering av Hh-signalering är fortfarande viktigt för dessa studier och för vår förståelse av resistens. Hos möss framkallar vildtypsmöss inte BCC, även under tunga doser av cancerframkallande ämnen, UV eller joniserande strålning. Däremot Ptch1 + / - möss är känsliga för BCC utveckling 17,18. Den penetrans av BCC utveckling i Ptch1 + / - möss är över 50% 18,19 trots Ptch1 + / - möss sällan utvecklar fullvuxna BCCs om de förvaras under normala förhållanden. På grund av den embryonal dödlighet av Ptch1 - / -, är vävnadsspecifik knockout av Ptch1 allmänhet användes för studien 20. Dessutom villkorlig hud-uttryck av onkogen SmoM2 YFP (Krt14-creer: R26-SmoM2 YFP: R26-SmoM2 YFP eller Krt14-cre) leder till bildandet av flera mikroskopiska BCCs vid en mycket tidig ålder, vilket ger en enkel genetisk analys för Hh-signalering görawnstream av SMO 21.
Det finns tre viktiga frågor i vår kunskap om BCC biologi. Det första är den cellulära ursprung BCCs inte helt klar. Medan vissa studier stöder vika av hårsäcken som stamceller plats 22-24, Youssef et al. 25 lokaliserade murina cellen varifrån kutana Hh-drivna tumörer vara i inter-follikulära epidermis regionen, inte i hårsäcken , med hjälp av cell-specifik Cre att aktivera uttrycket av en ROSA26-driven transgen mutant SMO. Det andra cellulära interaktioner under BCC utveckling är inte väl förstådd. Det är känt att keratinocyter med aktiverad Hh-signalering kan leda till bildandet av BCC, men andra cellulära förändringar är inte väl förstådd. Dessutom kan behandling av SMO-antagonister hos möss leder till resistens 26-28. Således nya mål för BCC är stort. Att förstå dessa tre frågor kräver analyser av cellförändringar i möss under Carcinogenesis. Medan flera metoder har publicerats för keratinocyte kultur, flödescytometri och hudens stamceller isolering 29-31, finns det för närvarande ingen heltäckande förfaranden för cell analyser i mus BCCs. Genom att kombinera metoder för musmodell av BCC, separation av epidermis, generering av enstaka celler från vävnad och analyser cell, kommer vi att ge läsarna en rad förfaranden för att studera cell signalering, cellulära och molekylära interaktioner under BCC utveckling. Vi tror att detta protokoll kommer att ge läsarna att se hur varje förfarande åstadkoms. Dessutom gav vi några uppgifter att illustrera vad resultatet ska se ut, och felsökning för att hjälpa läsarna att övervinna svårigheter under genomförandet av dessa förfaranden.
Protocol
Denna studie har godkänts av den IACUC kommittén vid Indiana University School of Medicine.
Ett. Generera Möss med korrekta Genotypes
- Upprätta en musmodell av BCCs. Mate K14-créer möss (Jackson laboratorium lager nummer 005.107) med R26-SmoM2 YFP möss (Jackson laboratorium lager nummer 005.130) (18) för att generera K14-créer + och R26-SmoM2 YFP + möss.
- Utför genotypning. Doppa svans prover (0,5 cm lång) i directPCR svans lyslösning med 1 mg / ml proteinas K vid 55 ° C över natten med skakning. Nästa dag, ta bort vävnad skräp genom centrifugering vid topphastighet i en mikro-centrifug (för att hålla supernatanten för genotypning). Använd ett pl av supernatanten för varje PCR-reaktion med primers och villkor som rekommenderas av säljaren. Välj mössen med rätt genotyper (vid en ålder av 3-6 veckor, buprenorfin vid 0,05-0,1 mg / kg kommer att tillämpas via SQ var 8-12 timme i 2-3 dagar efter svansen snip) for steg 2.
2. Inducera uttryck av SmoM2 i hudkeratinocyter
Inducera SmoM2 expression i keratinocyter genom oral administrering av tamoxifen (5 ng / kg kroppsvikt i 50 ml vegetabilisk olja i varje matning) under 5 på varandra följande dagar via oral sondmatning med en matningsnål (böjd 20 gauge).
Tre. Förberedelse Skin Prover
I allmänhet fenotyper är allvarligare på örat och svansen i K14creER/R26SmoM2 GFP möss. Att förbereda för cell analyser, skördar vi först musen huden efter djuroffer med en godkänd institutionellt förfarande (CO 2 plus halsdislokation).
4. Isolerande Epidermis
- Efter avlivning möss med ett godkänt förfarande (se steg 3), ta bort päls med en trimmer. Sänk ned huden exemplar i dispas-lösning (5 mg / ml i DMEM med 10% FBS) vid 37 ° C under 1-2 h (1 h för möss mindre än 8 veckor gamla och 2 timför möss gammal än 8 veckor).
- Efter dispas behandling, separat epidermis från dermis med pincett.
Fem. Generera enstaka celler
- För att erhålla enda cellpopulation, färs epidermis av sax och sedan sänk ned i kollagenas IV-lösning (1 mg / ml i DMEM med 10% FBS) under 1-2 h vid 37 ° C i ett 50 ml rör. Försök att försiktigt snurra rören varje 20 min för att hjälpa cellen dissociation.
- Inspektera cell disassociation under mikroskop. När enstaka celler kan detekteras i kollagenas mediet, inkubera provet under ytterligare 30 min för att öka cellutbytet. I allmänhet kan epidermis från en mus ge upp till 10 7-celler.
- Filtrera vävnaden blandningen genom cell sil (porstorlek 70 mikrometer), snurra celler nedåt vid 1500 rpm via bänk centrifugering, och tvätta en gång tid med PBS.
6. Label celler och utföra Analyser flödescytometrisystem
- Resuspendera cellerna i 10% FBSi PBS vid 2,5 x 10 6 celler / ml för att blockera icke-specifik bindning (på is under 30 min)
- Tag en alikvot av celler till var och en av 1,5 ml mikrorör för specifik antikropp märkning. Lägg olika antikroppar till varje rör vid en slutlig koncentration av 2 | ig / ml. Blanda antikroppar med celler via en mild vertex i flera sekunder och lämna dem på is i 30 minuter, tvätta sedan med 1 ml PBS. För BCC prover, använde vi antikropparna för följande biomarkörer: CD11b-PE plus Gr1-APC (myeloida celler eller myeloid-härledde suppressorceller), vimentin-FITC (fibroblaster) (se reagenser för detaljer).
- För intracellulär färgning, använder vi ett kit och följ leverantörens manual (se Reagenser för detaljer). Vi använder färska celler för att analysera cellytemarkörer. Efter ytmarkör färgning, tvätta cellerna, och suspendera dem i PBS. Lägg DAPI till cellen blandningen vid en slutlig koncentration av 1 pg / ml. DAPI kommer färga döda celler som kommer att vara gated ut från ytterligare analyser.
- Analysera data med specific programvara. Vi väljer först enstaka celler baserat på FSC-mot SSC plot, och använd DAPI negativ befolkningsutveckling (levande celler) för vidare analys.
Representative Results
Det är känt att möss inte utvecklar basaliom förutom med Hh signaleringsaktivering. Visar huden fenotypen efter inducerade expression av onkogen smoothened, visar SmoM2 YFP. Figur 2 analys av myeloida celler i normala och tumörbärande möss Figur 1. CD11b + Gr1 + celler är härledda från myeloidceller, och vissa av dem är myeloida härledda suppressorceller. Vid normal situation, CD11b + Gr1 +-cell population är knappast detekterbar, men kommer att öka till följd av inflammation eller tumörutveckling. Vi visade att inducerad expression av SmoM2YFP i huden resulterar i en ökning av CD11b + Gr1 + celler. För närvarande, de molekylära mekanismerna bakom denna förändring i BCC är inte klart.
Figur 1. Morphological förändringar efter SmoM2YFP induktion i mushud. Toppen visar ett diagram av mus genotyper. Den mellersta panelen: den K14creER + och R26-SmoM2 YFP + mus behandlades med tamoxifen visade grovt missbildning i huden (till höger) samt hudtumörer i H & E avsnitt (vänster). Den nedre panelen: musen utan SmoM2YFP induktion visade normal hud (höger) och ingen onormal morfologi i H & E avsnitt (vänster).
Figur 2. Flow analys av CD11b + Gr1 + celler. För att undersöka förändringen av CD11b + Gr1 + celler under hudcancer utveckling, isolerade vi enskilda celler och färgades med fluorescens-märkta antikroppar mot CD11b och Gr1. Efter analys med FlowJo, märkte vi en ökning av denna cell population i huden vävnader från tamoxifen-behandlade möss.
Discussion
Vi har beskrivit en metod för cell population analys BCCs. Tumör vävnader överensstämmer av många celltyper, och varje cell typ uppför sig annorlunda vid en given tidpunkt på karcinogenes, vilket är mycket svårt att återta även under de bästa betingelser in vitro. Med hjälp av detta protokoll, visade vi att utveckla basalcellscancer åtföljs av expansionen av epidermal stamceller samt rekrytering av myeloida celler. I jämförelse med immunohistokemi eller immunofluorescens analyser, cellpopulation analyser ger en mer kvantitativ bedömning av cellförändringar befolkningen sedan specifika antikroppar mot ett antal olika celltyper finns nu tillgängliga.
För detta protokoll är 10 veckor krävs för att genomföra studien eftersom fenotypisk förändring från geninduktion kräver tid. Det är därför viktigt att planera experimentet i förväg. För cellisolering och analyser, får två hela dagar att behövas. Eftersom levande celler används för analyses, är det viktigt att reservera en FACSCalibur förväg. Vi har också noterat vanliga problem när man arbetar med detta protokoll (se nedan).
I vår erfarenhet, nedan är vanliga problem som vi stött på:
- Dålig separation av epidermis: kan detta bero på ofullständig dispase behandling (Vänligen öka tiden för diapase behandling) eller otillräcklig dispase lösning (Huden måste vara helt nedsänkt i dispase lösning). Vi använder minst 5 ml dispase lösning för en mus. Volymen kan variera beroende på storleken på huden.
- Låg avkastning av cellantal: Detta kan bero på ofullständig nedbrytning med kollagenas IV. Vänligen första koncentration kontroll kollagenas eller utgångsdatum. Detta kan också orsakas av otillräcklig mängd som används av epidermis. Vidare bör enzymnedbrytning utföras vid till 37 ° C med skakning (vänligen justera temperatur innan utföra uppslutning).
- Cellklumpar: Detta är mycket vanligt att hudceller (pipett cellerett par gånger efter att ha gått igenom silen (före centrifugering), eller förekomsten av Mg 2 + och Ca 2 + i lösningen (använd Mg 2 + och Ca 2 +-fri PBS för celltvätt).
- Alltför många döda celler: Detta kan vara ett resultat av försämrade vävnader (använd färska vävnader), eller över-matsmältningen (undvik förlängd inkubation med dispas och kollagenas IV).
Detta protokoll kan kombineras med benmärgstransplantation eller vävnadstransplantation att undersöka cellursprung. Till exempel, transplantation av GFP-uttryckande benmärgsceller i letalt bestrålade möss kommer att tillåta oss att undersöka bidraget av benmärgsceller till tumörassocierade fibroblaster och myeloidceller. På liknande sätt kan hudtumörer kan transplanteras in i en ny mus värd att undersöka tumör-värd interaktioner.
Förutom att undersöka cellförändringar befolkning under karcinogenes, kommer detta protokoll också tillåta forskare att undersökaeffekter av läkemedelsbehandling till cellerna i tumören miljön. Även detta protokoll är avsedd att användas för analyser cellpopulation under huden carcinogenes, smärre ändringar kan göras för andra cancertyper.
Sammanfattningsvis kan cellpopulation analyser i musmodeller av hudcancer ger oss de dynamiska cellförändringar under cancer, vilket leder till en bättre förståelse av cellbiologi i neoplastisk transformation och olika cellulära händelser i omvandlingsprocessen.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NCI (R01-94160 och R01-155.086), IU Simon Cancer Center och Wells Centrum för pediatrisk forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
References
- Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
- Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
- Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
- Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
- Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
- Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
- Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
- Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
- Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
- Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
- Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
- Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
- Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
- Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
- Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
- Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
- Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
- Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
- Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
- Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
- Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
- Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
- Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
- Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
- Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).
- Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
- Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).
- Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).
