Summary
Carcinogenesis er en proces, der involverer interaktioner mellem kræftceller og kræft mikromiljø. At dissekere de molekylære begivenheder, er man nødt til at isolere forskellige cellepopulationer på forskellige stadier under udviklingen af kræft. Ved hjælp af en musemodel for basalcellekræft, beskriver vi en protokol for celle analyser under carcinogenese.
Abstract
Udviklingen af kræft er en multiple-trins proces, der involverer mange celletyper, herunder cancer precursorceller, immunceller, fibroblaster og endotelceller. Hver type af celler undergår signalering og funktionelle forandringer under carcinogenese. Den aktuelle udfordring for mange kræftforskere er at dissekere disse ændringer i hver celle type i multiple-trins proces in vivo. I de sidste par år, har forfatterne udviklet et sæt procedurer til at isolere forskellige cellepopulationer under hudkræft udvikling ved hjælp K14creER/R26-SmoM2 YFP mus. Proceduren er opdelt i 6 dele: 1) generere passende mus til studiet (K14creER + og R26-SmoM2 YFP + mus i denne protokol) 2) fremkaldende SmoM2 YFP udtryk i musehud, 3) udarbejdelse mus hudbiopsier, 4) at isolere epidermis fra huden, 5) forbereder enkelte celler fra overhuden, 6) mærkning encellede populationer for flowcytometri analyse.Generering af tilstrækkeligt antal mus med den rigtige genotypen er den begrænsende skridt i denne protokol, som kan tage op til to måneder. Resten af trinene tage et par timer til et par dage. Inden for denne protokol, vi også indeholder et afsnit for fejlfinding. Selvom vi fokuserer på hudkræft, kan denne protokol modificeres til at ansøge om andre dyremodeller for humane sygdomme.
Introduction
Som den mest almindelige form for kræft hos mennesker, påvirker basalcellekræft (BCC) omkring 2 millioner amerikanere om året 1.. Akkumulere beviser tyder på, at unormal aktivering af pindsvin (hh) signalering er den drivende kraft bag BCC udvikling (Bedømt i 2,3). Ændringer i Hh signalering i BCC omfatter inaktiverende mutationer af PTCH1 4-6, gain-of-funktion mutationer af SMO 7-9, og afvigende udtryk HH pathway transkriptionsfaktorer GLI1 10 og GLI2 11 eller sjældne inaktiverede mutationer af negativ regulator Su (Fu ) 12. Gennem alle disse og andre studier har Federal Drug Administration (FDA) har for nylig godkendt brugen af Hh signalering inhibitor Vismodegib at behandle metastatisk og lokalt fremskreden BCC 13-15.
På trods af alle disse resultater 16 vi stadig ikke forstår de molekylære og cellulære mekanismer, som Hh signalering driver carcinogenesis. Etablering dyremodeller med vævs-specifik aktivering af Hh signalering er stadig vigtigt for disse undersøgelser og for vores forståelse af resistens. Hos mus har vildtypemus ikke udvikle BCC, selv under tunge doser af kræftfremkaldende stoffer, UV-eller ioniserende stråling. I modsætning Ptch1 + / - er mus modtagelige for BCC udvikling 17,18. Den penetrans af BCC udvikling i Ptch1 + / - mus er over 50% 18,19 selvom Ptch1 + / - mus udvikler sjældent fuldvoksne BCC, hvis de opbevares under normale forhold. På grund af den embryonale letalitet Ptch1 - / -, vævs-specifik knockout af PTCH1 almindeligvis anvendes til undersøgelsen 20. Desuden betingede skin-specifikt udtryk for onkogene SmoM2 YFP (Krt14-creer: R26-SmoM2 YFP: R26-SmoM2 YFP eller Krt14-cre) fører til dannelse af flere mikroskopiske BCC i en meget tidlig alder, der giver en nem genetisk analyse for hh signalering gørwnstream af SMO 21.
Der er tre store spørgsmål i vores viden om BCC biologi. Først, den cellulære oprindelse BCC er ikke helt klar. Mens nogle undersøgelser understøtter rokke af hårsækken, da stamceller webstedet 22-24, Youssef et al. 25. lokaliseret den murine celle oprindelse kutane Hh-drevet tumorer at være i inter-follikulært epidermis region, ikke i hårsækken , ved hjælp af cellespecifik Cre at aktivere ekspression af et ROSA26-drevet transgen mutant SMO. Sekund, cellulære interaktioner under BCC udvikling er ikke godt forstået. Det vides, at keratinocytter med aktiverede Hh signalering kan føre til dannelse af BCC, men andre cellulære ændringer er ikke godt forstået. Endvidere kan behandling af SMO antagonister i mus fører til resistens 26-28. Således nye mål for BCC er stærkt behov for. Forståelsen af disse tre spørgsmål kræver analyser af celleforandringer hos mus under carcinogenesis. Mens flere metoder er blevet offentliggjort keratinocytkultur, flowcytometri og hud stamceller isolation 29-31, der i øjeblikket ingen omfattende procedurer for celle analyser i mus BCC. Ved at kombinere metoder til musemodel af BCC, adskillelse af epidermis, generering af enkelte celler fra væv og celler analyser, vil vi give læserne med et sæt af procedurer til at studere celle signalering, cellulære og molekylære interaktioner i løbet af BCC udvikling. Vi mener, at denne protokol vil give læserne at se, hvordan hver enkelt procedure er gennemført. Desuden fremlagde vi nogle data til at illustrere hvad resultaterne skal se ud, og fejlfinding for at hjælpe læserne til at overvinde vanskeligheder under udførelsen af disse procedurer.
Protocol
Denne undersøgelse er blevet godkendt af den IACUC Udvalg ved Indiana University School of Medicine.
1.. Generer Mus med Korrekte genotyper
- Etablere en musemodel af BCC. Mate K14-creer mus (Jackson laboratorium stock nummer 005.107) med R26-SmoM2 YFP mus (Jackson laboratorium stock nummer 005.130) (18) til at generere K14-creer + og R26-SmoM2 YFP + mus.
- Udfør genotypebestemmelse. Fordyb hale prøver (0,5 cm lang) i directPCR hale lyseopløsning med 1 mg / ml proteinase K ved 55 ° C natten over under omrystning. Den næste dag, fjerne vævsrester ved centrifugering ved tophastighed i en mikro-centrifuge (for at holde supernatanten til genotypebestemmelse). Brug 1 pi af supernatanten for hver PCR-reaktion med primerne og betingelser anbefalet af leverandøren. Vælg musene med de rette genotyper (i en alder af 3-6 uger, buprenorphin ved 0,05-0,1 mg / kg vil blive anvendt via SQ hver 8-12 timer i 2-3 dage efter halen snip) for trin 2.
2.. Inducere ekspression af SmoM2 i hudkeratinocyter
Inducere SmoM2 ekspression i keratinocytter ved oral administration af tamoxifen (5 ug / kg legemsvægt i 50 ml vegetabilsk olie i hver fodring) i 5 på hinanden følgende dage via oral sondeernæring med en fodring nål (buet 20 gauge).
3.. Forberedelse Hud Prøver
Generelt er fænotyper mere alvorlig på øret og halen i K14creER/R26SmoM2 GFP mus. For at forberede celle analyser vi først høste musen huden efter dyreofringer med en institutionel godkendt procedure (CO 2 plus halsdislokation).
4.. Isolating Epidermis
- Efter aflivning mus med en godkendt procedure (se trin 3), fjernes pelsen ved hjælp af en trimmer. Fordyb hudprøver i dispase opløsning (5 mg / ml i DMEM med 10% FBS) ved 37 ° C i 1-2 timer (1 time for mus mindre end 8 uger gamle og 2 timerfor mus gamle end 8 uger).
- Efter dispase behandling, separat epidermis fra dermis ved pincet.
5.. Generer enkeltceller
- At opnå en enkelt cellepopulation, hakkekød epidermis ved saks og derefter nedsænkes i collagenase IV opløsning (1 mg / ml i DMEM med 10% FBS) i 1-2 timer ved 37 ° C i et 50 ml rør. Prøv at forsigtigt swirl rørene hver 20 min for at hjælpe celle afstandtagen.
- Efterse celle afstandtagen under mikroskop. Når enkelte celler kan påvises i collagenase medium, inkubere prøven i yderligere 30 minutter for at øge celle udbytte. I almindelighed, kan epidermis fra en mus giver op til 10 7 celler.
- Filtreres vævet blandingen gennem cellefilter (porestørrelse 70 um), spin-celler ned ved 1.500 rpm via bænk top centrifugering, og vaskes en gang tid med PBS.
6.. Label Celler og Perform Flowcytometri Analyser
- Cellerne i 10% FBSi PBS ved 2,5 x 10 6 celler / ml til at blokere ikke-specifik binding (på is i 30 minutter)
- Tag en portion af cellerne til hver af 1,5 ml mikrorør for specifikt antistof mærkning. Tilføje forskellige antistoffer til hvert rør i en endelig koncentration på 2 ug / ml. Bland antistoffer med celler via en blid toppunkt i flere sekunder og efterlade dem på is i 30 minutter, derefter vaskes med 1 ml PBS. For BCC prøver, brugte vi antistofferne for følgende biomarkører: CD11-PE plus Gr1-APC (myeloide celler eller myeloid-afledte suppressor celler), vimentin-FITC (fibroblast) (se reagenser for detaljer).
- For intracellulær farvning, bruger vi et kit og følge sælgerens manual (se Reagenser for detaljer). Vi bruger friske celler til at analysere celleoverflademarkører. Efter overflade markør farvning, vask cellerne, og resuspender dem i PBS. Læg DAPI til cellen blandingen ved en slutkoncentration på 1 ug / ml. DAPI vil plette døde celler, der vil være gated ud fra yderligere analyser.
- Analysere data med specific software. Vi først vælge enkelte celler baseret på FSC-versus SSC plot, og bruge DAPI negative population (levende celler) til yderligere analyse.
Representative Results
Det er kendt, at mus ikke udvikler basalcellekarcinomer undtagen med Hh signalering aktivering. Figur 1 viser huden fænotype efter induceret glittesinden ekspression af onkogen, SmoM2 YFP. Figur 2 viser analyse af myeloide celler i normale og tumorbærende mus. CD11 + GR1 +-celler er afledt af myeloide celler, og nogle af dem er myeloide afledte suppressorceller. I normal situation er CD11 + Gr1 + cellepopulationen er næppe detekterbar, men vil stige som reaktion på inflammation eller tumorudvikling. Vi viste, at induceret ekspression af SmoM2YFP i huden resulterer i en stigning i CD11 + GR1 +-celler. I øjeblikket er de molekylære mekanismer bag denne ændring i BCC er ikke klare.
Figur 1. Morphological ændres efter SmoM2YFP induktion i mus huden. Den øverste viser et diagram af muse genotyper. Den midterste panel: Den K14creER + og R26-SmoM2 YFP + mus behandlet med tamoxifen udviste groft abnormitet i huden (til højre) samt hudtumorer i H & E sektion (venstre). Det nederste panel: musen uden SmoM2YFP induktion viste normale udseende hud (til højre) og ingen unormal morfologi i H & E sektion (venstre).
Figur 2. Flow analyse af CD11 + GR1 +-celler. At undersøge ændringen af CD11 + GR1 +-celler under hudkræft udvikling, vi isolerede enkelte celler og farves med fluorescens-mærkede antistoffer mod CD11 og Gr1. Efter analyse FlowJo bemærkede vi en stigning af denne celle population i hudens væv fra tamoxifen-behandlede mus.
Discussion
Vi har beskrevet en fremgangsmåde til cellepopulation analyse i BCC. Tumorvæv er konsekvent af mange celletyper, og hver celletype opfører sig anderledes på et givet tidspunkt af carcinogenese, hvilket er meget svært at genvinde selv under de bedste in vitro-betingelser. Ved hjælp af denne protokol, viste vi, at udviklingen af basalcellekræft er ledsaget af udvidelsen af epidermale stamceller samt rekruttering af myeloide celler. I sammenligning med immunhistokemisk eller immunofluorescensglas analyser giver cellepopulation analyser en mere kvantitativ vurdering af cellepopulation ændringer, da specifikke antistoffer til en række celletyper er nu tilgængelige.
Til denne protokol, er 10 uger til at fuldføre studiet, fordi fænotypisk ændring fra geninduktion kræver tid. Det er derfor vigtigt at planlægge eksperimentet i forvejen. For celle isolation og analyser kan to hele dage være nødvendig. Fordi levende celler anvendes til analyses, er det vigtigt at reservere en FACSCalibur forvejen. Vi har også opført almindelige problemer når der arbejdes med denne protokol (se nedenfor).
Det er vores erfaring, er under fælles problemer, vi stødte:
- Dårlig adskillelse af epidermis: Dette kan skyldes ufuldstændig dispase behandling (Please øge den tid af diapase behandling) eller utilstrækkelig dispase opløsning (Huden skal være helt nedsænket i dispase opløsning). Vi bruger mindst 5 ml dispase opløsning for en mus. Lydstyrken kan variere baseret på størrelsen af huden.
- Lavt udbytte af celletal: Dette kan på grund af ufuldstændig fordøjelse med collagenase IV. Venligst første kontrol collagenase koncentration eller udløbsdatoen. Dette kan også være forårsaget af utilstrækkelig anvendte mængde af epidermis. Endvidere bør fordøjelse udføres ved til 37 ° C med omrystning (venligst justere temperaturen før udføre fordøjelsen).
- Celleklumper: Dette er meget almindeligt for hudceller (pipette celleret par gange efter at gå gennem sien (før centrifugering), eller eksistensen af Mg 2 + og Ca 2 + i opløsningen (benyt Mg 2 + og Ca 2 +-fri PBS for celle vask).
- Alt for mange døde celler: Dette kan være et resultat af forringet væv (venligst bruge friske væv) eller over-fordøjelse (undgå forlænget inkubation med dispase og collagenase IV).
Denne protokol kan kombineres med knoglemarvstransplantation eller vævstransplantation at undersøge celle oprindelse. For eksempel GFP-udtrykkende transplantation af knoglemarvsceller i letalt bestrålede mus vil tillade os at undersøge bidraget af knoglemarvsceller til tumorassocierede fibroblaster og myeloide celler. Tilsvarende kan hudtumorer blive transplanteret ind i en ny mus vært at undersøge tumor-vært interaktioner.
Ud over at undersøge cellepopulation forandringer under karcinogenese vil denne protokol også give forskere til at undersøgevirkninger af lægemiddelbehandlinger til cellerne i tumoren miljø. Selv om denne protokol er designet til at bruge til cellepopulation analyser under hudkræft, mindre ændringer kan foretages for andre kræfttyper.
Sammenfattende kan cellepopulation analyser musemodeller af hudkræft give os de dynamiske cellulære ændringer i karcinogenese, hvilket fører til en bedre forståelse af cellebiologi i neoplastisk transformation og forskellige cellulære begivenheder i omstillingsprocessen.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af NCI (R01-94160 og R01-155086), IU Simon Cancer Center og Wells Center for Pediatric Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
References
- Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
- Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
- Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
- Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
- Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
- Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
- Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
- Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
- Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
- Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
- Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
- Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
- Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
- Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
- Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
- Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
- Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
- Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
- Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
- Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
- Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
- Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
- Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
- Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
- Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).
- Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
- Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).
- Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).
