Summary
La carcinogénesis es un proceso que implica interacciones entre las células cancerosas y el microambiente del cáncer. Para diseccionar los eventos moleculares, uno necesita para aislar poblaciones de células diferentes en diferentes etapas durante el desarrollo del cáncer. Utilizando un modelo de ratón para el carcinoma de células basales, se describe un protocolo para el análisis de células durante la carcinogénesis.
Abstract
El desarrollo del cáncer es un proceso de múltiples etapas que implica muchos tipos celulares, incluyendo células precursoras de cáncer, las células inmunes, fibroblastos y células endoteliales. Cada tipo de células se somete a cambios de señalización y funcionales durante la carcinogénesis. El desafío actual de muchos investigadores del cáncer es diseccionar estos cambios en cada tipo de célula durante el proceso de múltiples pasos in vivo. En los últimos años, los autores han desarrollado un conjunto de procedimientos para aislar diferentes poblaciones de células durante el desarrollo del cáncer de piel con K14creER/R26-SmoM2 YFP ratones. El procedimiento se divide en 6 partes: 1) la generación de ratones apropiados para el estudio (K14creER + y R26-SmoM2 YFP + ratones de este protocolo), 2) que induce SmoM2 YFP expresión en la piel del ratón, y 3) la preparación de las biopsias de piel de ratón, y 4) el aislamiento epidermis de la piel; 5) la preparación de las células individuales de la epidermis; 6) marcar poblaciones de células individuales para el análisis de citometría de flujo.Generación de un número suficiente de ratones con el genotipo adecuado es el paso limitante en este protocolo, que puede tardar hasta dos meses. El resto de pasos tomar unas pocas horas hasta varios días. Dentro de este protocolo, también incluimos una sección de solución de problemas. Aunque nos centramos en el cáncer de piel, este protocolo puede ser modificado para solicitar otros modelos animales de enfermedades humanas.
Introduction
Como el tipo más común de cáncer humano, carcinoma de células basales (BCC) afecta a unos 2 millones de estadounidenses al año 1. La evidencia acumulada indica que la activación anormal de hedgehog (Hh) de señalización es la fuerza motriz que subyace el desarrollo BCC (Revisado en 2,3). Alteraciones de la señalización Hh en CBC incluyen inactivación de las mutaciones de PTCH1 4-6, mutaciones con ganancia de función de SMO 7-9, y la expresión aberrante de la vía Hh factores de transcripción Gli1 10 y GLI2 11 o mutaciones inactivadas raros de regulador negativo Do (Fu ) 12. A través de todos estos y otros estudios, la Administración Federal de Drogas (FDA) ha aprobado recientemente el uso de señalización Hh inhibidor Vismodegib para tratar metastásico y localmente avanzado CB 13-15.
A pesar de todos estos logros 16, todavía no entendemos los mecanismos moleculares y celulares mediante los cuales la señalización Hh impulsa carcinogenesis. El establecimiento de modelos animales que utilizan la activación específica de tejido de señalización Hh sigue siendo importante para estos estudios y para nuestra comprensión de la resistencia a los medicamentos. En los ratones, los ratones de tipo salvaje no se desarrollan las CEBs, incluso bajo fuertes dosis de carcinógenos, la radiación ultravioleta o ionizante. En contraste, Ptch1 + / - ratones son susceptibles al desarrollo BCC 17,18. La penetrancia de desarrollo BCC en Ptch1 + / - ratones es más de 50%, aunque Ptch1 18,19 + / - ratones rara vez se desarrollan los CCB crecidos si se mantienen en condiciones normales. Debido a la letalidad embrionaria de Ptch1 - / -, nocaut específica de tejido de PTCH1 se utiliza generalmente para el estudio 20. Además, la expresión condicional específico para la piel de oncogénico SmoM2 YFP (KRT14-Creer: R26-SmoM2 YFP o KRT14-cre: R26-SmoM2 YFP) conduce a la formación de múltiples CCB microscópicas a una edad muy temprana, proporcionando un análisis genético fácil para señalización Hh hacerwnstream de SMO 21.
Hay tres cuestiones importantes en nuestro conocimiento de la biología del BCC. En primer lugar, el origen celular de los CCB no está del todo claro. Mientras que algunos estudios apoyan la bullir de folículo piloso como el sitio de células madre 22-24, Youssef y col. 25 localiza el celular murina de origen de los tumores cutáneos Hh-impulsados a estar en la región de la epidermis inter-folicular, no en el folículo piloso , mediante el uso de Cre específico de las células para activar la expresión de un ROSA26 impulsada transgénico mutante SMO. En segundo lugar, las interacciones celulares durante el desarrollo BCC no se entienden bien. Se sabe que los queratinocitos activados con Hh señalización puede conducir a la formación de las CEBs, pero otros cambios celulares no están bien entendidas. Además, el tratamiento de los antagonistas de Smo en ratones puede provocar resistencia al medicamento 26-28. Son muy necesarios nuevos objetivos tanto para BCC. La comprensión de estas tres cuestiones requiere un análisis de los cambios celulares en ratones durante carcinogENESIS. Mientras varios métodos han sido publicados para cultivo de queratinocitos, citometría de flujo y la piel de aislamiento de células del tallo 29-31, actualmente no hay procedimientos integrales para los análisis de células en los CCB ratón. Mediante la combinación de métodos para el modelo de ratón de los CCB, la separación de la epidermis, la generación de células individuales a partir de tejido y análisis de células, vamos a ofrecer a los lectores con un conjunto de procedimientos para estudiar la señalización celular, celular y de las interacciones moleculares durante el desarrollo BCC. Creemos que este protocolo permitirá a los lectores a ver cómo se lleva a cabo cada procedimiento. Además, proporcionamos algunos datos para ilustrar lo que los resultados deben ser similar, y solución de problemas para ayudar a los lectores a superar las dificultades en la realización de estos procedimientos.
Protocol
Este estudio ha sido aprobado por el Comité IACUC en la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana.
1. Generar ratones con genotipos correctos
- Establecer un modelo de ratón de las CEBs. Mate K14-créer ratones (Jackson laboratorio stock número 005107) con R26-SmoM2 YFP ratones (Jackson laboratorio stock número 005130) (18) para generar K14-CREER + y R26-SmoM2 YFP + ratones.
- Realizar genotipado. Sumergir la cola muestras (0,5 cm de largo) en directPCR solución de lisis de la cola con 1 mg / ml de proteinasa K a 55 ° C durante la noche con agitación. El día siguiente, eliminar los restos de tejido por centrifugación a velocidad máxima en una microcentrífuga (para mantener el sobrenadante para la determinación del genotipo). Usar 1 l del sobrenadante para cada reacción de PCR con los cebadores y las condiciones recomendadas por el proveedor. Seleccione los ratones con los genotipos derecha (a la edad de 3-6 semanas, la buprenorfina en 0,05-0,1 mg / kg se aplicará a través ² cada 8-12 horas durante 2-3 días después de la cola snip) FOr paso 2.
2. Inducir la expresión de SmoM2 en queratinocitos de la piel
Inducir SmoM2 expresión en los queratinocitos por la administración oral de tamoxifeno (5 mg / kg de peso corporal en 50 ml de aceite vegetal en cada comida) durante 5 días consecutivos a través de una sonda oral con una aguja de alimentación (curvada de calibre 20).
3. Preparación de muestras de piel
En general, los fenotipos son más graves en la oreja y la cola en K14creER/R26SmoM2 GFP ratones. Para prepararse para el análisis de células, lo primero que cosechamos la piel del ratón tras el sacrificio de animales con un procedimiento institucional aprobado (CO 2 más dislocación cervical).
4. Aislar Epidermis
- Después de ratones sacrificio con un procedimiento aprobado (ver paso 3), retire la piel utilizando un condensador de ajuste. Muestras de piel Sumergir en solución de dispasa (5 mg / ml en DMEM con 10% de FBS) a 37 ° C durante 1-2 horas (1 hora para los ratones de menos de 8 semanas de edad y 2 hrpara los ratones viejos de 8 semanas).
- Después del tratamiento con dispasa, la epidermis separada de la dermis por el fórceps.
5. Generar células individuales
- Para obtener la población de células única, carne picada epidermis por las tijeras y luego sumergir en solución de colagenasa IV (1 mg / ml en DMEM con 10% de FBS) durante 1-2 horas a 37 ° C en un tubo de 50 ml. Pruebe a girar suavemente los tubos cada 20 minutos para ayudar a la disociación celular.
- Inspeccionar disociación celular bajo el microscopio. Cuando las células individuales se pueden detectar en el medio de la colagenasa, incubar la muestra durante 30 minutos adicionales para aumentar el rendimiento celular. En general, la epidermis de un ratón puede producir hasta 10 7 células.
- Se filtra la mezcla de tejido a través de células colador (tamaño de poro de 70 micras), las células dejen de girar a 1.500 rpm a través de sobremesa centrifugación y lavar una vez el tiempo con PBS.
6. Las células Label y llevar a cabo análisis de citometría de flujo
- Resuspender las células en 10% de FBSen PBS a 2,5 x 10 6 células / ml para bloquear la unión no específica (en hielo durante 30 min)
- Tomar una alícuota de células a cada uno de microtubos de 1,5 ml para el etiquetado de anticuerpo específico. Añadir diferentes anticuerpos a cada tubo a una concentración final de 2 mg / ml. Mezclar anticuerpos con células a través de un vértice suave durante varios segundos y dejar en hielo durante 30 min, a continuación se lava con 1 ml de PBS. Para las muestras de BCC, se utilizaron los siguientes anticuerpos para los biomarcadores: CD11b-PE plus Gr1-APC (células mieloides o células supresoras de origen mieloide), vimentina-FITC (fibroblastos) (ver reactivos para más detalles).
- Para la tinción intracelular, se utiliza un kit y seguir el manual del fabricante (ver Reactivos para más detalles). Utilizamos células frescas para analizar marcadores de superficie celular. Después de la tinción marcador de superficie, lavar las células, y los resuspender en PBS. Añadir DAPI a la mezcla de células a una concentración final de 1 mg / ml. DAPI se mancha las células muertas que será cerrada a partir de nuevos análisis.
- Analizar los datos con especificacionessoftware c. En primer lugar, seleccionamos las células individuales en base a la FSC frente a SSC trama, y el uso de población negativa DAPI (células vivas) para su posterior análisis.
Representative Results
Se sabe que los ratones no desarrollan carcinomas de células basales, excepto con la activación de la señalización Hh. Figura 1 muestra el fenotipo de la piel después de la expresión inducida de oncogénico smoothened, SmoM2 YFP. Figura 2 muestra el análisis de las células mieloides en ratones normales y portadores de tumores. Células CD11b + Gr1 + se derivan de las células mieloides, y algunos de ellos son células mieloides supresoras derivadas. En situación normal, el CD11b + Gr1 + población de células es difícilmente detectable, pero aumentará en respuesta a la inflamación o el desarrollo de tumores. Hemos demostrado que la expresión inducida de SmoM2YFP en los resultados de la piel en un aumento en las células CD11b + Gr1 +. En la actualidad, los mecanismos moleculares que subyacen a este cambio en los CCB no son claras.
Figura 1. Morphological cambios después de la inducción SmoM2YFP en la piel del ratón. La parte superior muestra un diagrama de los genotipos del ratón. El panel central: la K14creER + y R26-SmoM2 YFP + ratón tratado con tamoxifeno mostró sumamente anormalidad en la piel (a la derecha), así como los tumores de piel en la sección H & E (izquierda). El panel inferior: el ratón sin SmoM2YFP inducción mostró la piel de aspecto normal (derecha) y sin morfología anormal en la sección H & E (izquierda).
Figura 2. Análisis de flujo de células CD11b + Gr1 +. Para examinar el cambio de las células CD11b + Gr1 + durante el desarrollo del cáncer de piel, que aísla las células individuales y se tiñeron con anticuerpos marcados con fluorescencia a CD11b y Gr1. Tras el análisis de FlowJo, notamos un aumento de esta población de células en los tejidos de la piel de los ratones tratados con tamoxifeno.
Discussion
Hemos descrito un método para el análisis de población de células en los CCB. Los tejidos tumorales son consistentes de muchos tipos de células, y cada tipo de célula se comporta de manera diferente en un momento dado de la carcinogénesis, que es muy difícil de recuperar incluso en las mejores condiciones in vitro. El uso de este protocolo, se puso de manifiesto que el desarrollo de carcinoma de células basales es acompañada por la expansión de las células madre epidérmicas, así como el reclutamiento de células mieloides. En comparación con los análisis de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia, análisis de la población de células dan una evaluación más cuantitativa de los cambios en la población de células ya que los anticuerpos específicos para una variedad de tipos de células están ahora disponibles.
En este protocolo, se necesitan 10 semanas para completar el estudio porque el cambio fenotípico de la inducción de genes requiere tiempo. Por lo tanto, es importante para planificar el experimento antes de tiempo. Para el aislamiento de células y análisis, pueden ser necesarias dos días enteros. Dado que las células vivas se utilizan para analysES, es importante reservar un FACSCalibur antes de tiempo. También hemos hecho una lista de los problemas más comunes cuando se trabaja con este protocolo (véase más adelante).
En nuestra experiencia, a continuación son los problemas comunes que nos encontramos:
- Malo separación de la epidermis: Esto puede ser causado por el tratamiento dispasa incompleta (Por favor, aumentar el tiempo de tratamiento diapase) o una solución de dispasa insuficiente (La piel necesita ser totalmente sumergido en una solución de dispasa). Utilizamos por lo menos 5 ml de solución de dispasa para un ratón. El volumen puede variar en función del tamaño de la piel.
- Bajo rendimiento del número de células: Puede ocurrir debido a la digestión incompleta con colagenasa IV. Por primera concentración de colagenasa cheque o fecha de caducidad. Esto también puede ser causada por la cantidad insuficiente de la epidermis utilizado. Además, digestión con enzimas se debe realizar a a 37 ° C con agitación (por favor, ajuste de temperatura antes de realizar la digestión).
- Grupos celulares: Esto es muy común para las células de la piel (células de pipetaun par de veces después de pasar a través del filtro (antes de la centrifugación), o la existencia de Mg 2 + y Ca 2 + en la solución (por favor, utilice Mg 2 + y Ca 2 + libre de PBS para lavado de células).
- Demasiados células muertas: Esto puede ser el resultado de los tejidos degradados (por favor utilice tejidos frescos), o sobre-digestión (evitar la incubación prolongada con dispasa y colagenasa IV).
Este protocolo se puede combinar con el trasplante de médula ósea o trasplante de tejido para examinar el origen de célula. Por ejemplo, el trasplante de las buenas prácticas agrarias-que expresan las células de médula ósea en ratones irradiados letalmente nos permitirá examinar la contribución de las células de la médula ósea de los fibroblastos asociados al tumor y las células mieloides. Del mismo modo, los tumores de la piel pueden ser trasplantados a un nuevo huésped ratón para examinar las interacciones tumor-huésped.
Además de examinar los cambios en la población de células durante la carcinogénesis, este protocolo también permitirá a los investigadores examinarefectos de los tratamientos con fármacos a las células en el ambiente del tumor. Aunque este protocolo está diseñado para utilizar para el análisis de la población de células durante la carcinogénesis de piel, ligeras modificaciones se pueden hacer para otros tipos de cáncer.
En resumen, el análisis de la población de células en modelos de ratón de cáncer de piel nos pueden dar los cambios dinámicos durante la carcinogénesis celulares, lo que lleva a una mejor comprensión de la biología celular en la transformación neoplásica y diferentes eventos celulares en el proceso de transformación.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este estudio fue apoyado por el Instituto Nacional del Cáncer (R01-R01-94160 y 155086), IU Centro Oncológico Simon Wells y Centro de Investigación Pediátrica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
References
- Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
- Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
- Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
- Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
- Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
- Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
- Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
- Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
- Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
- Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
- Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
- Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
- Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
- Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
- Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
- Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
- Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
- Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
- Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
- Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
- Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
- Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
- Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
- Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
- Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).
- Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
- Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).
- Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).
