التجسيمي حقن ناقل للتلاعب الجيني الفيروسي شرطي في الحبل الشوكي ماوس
Summary
ناقلات فيروسية تسمح للتلاعب الجيني المستهدفة. ونحن يبرهن على وجود طريقة للتعبير الجين المشروط أو الاجتثاث في الحبل الشوكي الماوس، وذلك باستخدام حقن التجسيمي من ناقلات فيروسية في القرن الظهري، وهو موقع بارز للاتصال متشابك بين الحسية الجسدية الأولية afferents والخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي.
Abstract
حقن Intraparenchymal من ناقلات فيروسية يمكن التلاعب الجيني في المشروطة السكان متميزة من الخلايا العصبية أو مناطق معينة من الجهاز العصبي المركزي. ونحن يبرهن على وجود تقنية الحقن التجسيمي الذي يسمح استهدفت التعبير الجيني أو إسكات في القرن الظهري في النخاع الشوكي الماوس. الإجراء الجراحي هو وجيزة. أنه يتطلب استئصال الصفيحة الفقرية لفقرة واحدة، تنص على الانتعاش السريع للحيوان والحركة دون عوائق من العمود الفقري. حقن تسيطر عليها وحدة تخزين صغيرة ناقلات التعليق على سرعة منخفضة واستخدام محقنة مكروية مع قنية الزجاج مشطوف تقليل الآفة الأنسجة. الاستجابة المناعية المحلية لمكافحة ناقلات يعتمد على الخصائص الذاتية للفيروس المستخدمة؛ في تجربتنا، فمن قاصر وقصير الأجل عند استخدام المؤتلف الفيروس المرتبط بالفيروس الغدي. A الجين مراسل مثل البروتين المعززة الفلورية الخضراء يسهل توزيع الرصد المكاني للناقلات، وفعالية وSPECI الخلويةficity من ترنسفكأيشن.
Introduction
التكنولوجيات المتقدمة من التلاعب الجيني الشرطية في الماوس تمكين نهج متعدد الأوجه لاستكشاف مسارات وظيفية واتصالات متشابك في الجهاز العصبي المركزي. يمكن تنظيمها من قبل جينات منقولة الصغيرة جزيء المستجيبات مثل الدوكسيسيكلين بناء على transactivator التتراسيكلين التي تسيطر عليها، والتي يمكن أن تكون مصممة لتكون بمثابة المنشط أو قامع من النسخ الجيني، أو عقار تاموكسيفين الاعتراف تحور يجند ملزم المجال من مستقبلات هرمون الاستروجين 1 . ويتحقق عادة لا رجعة فيه تعديل التحوير من الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) recombinases. لجنة المساواة العرقية (أسباب إعادة التركيب) وFLP (flippase إنزيم إعادة التركيب) حفز الختان، أو انعكاس إزفاء من شظايا الحمض النووي التي يحيط بها loxP (بؤرة X معبر أكثر، P1) أو FRT (flippase هدف الاعتراف) مواقع على التوالي 1. وتشمل التطبيقات تفعيل الجينات أو إسكات وحمض النووي الريبي محرض (RNA) تدخل <sup > 2. ويمكن استخدام تعبير شرطي من الصحفيين الفلورسنت أو الأنزيمية مثل غالاكتوزيداز β-الفوسفاتيز القلوية أو لتسمية الخلايا العصبية ودراسة منظمتهم الموضعية والاتصال 3. مشاريع الطفرات واسعة النطاق في أمريكا الشمالية ( http://www.norcomm.org/index.htm ) وأوروبا ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) على انتاج مكتبات الجنينية الماوس استنساخ الخلايا الجذعية مع أهداف الجينات المشروطة والفخاخ التي سوف تغطي في نهاية المطاف جينوم الفأر بأكمله. قد عبرت الفئران المولدة من هذه الحيوانات المستنسخة مع عدد من خطوط توسيع الماوس التي تعبر عن recombinases DNA تحت المروجين أو مواضع معينة للسكان خاصة من الخلايا العصبية للتلاعب الجيني انتقائية ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . PHP ).
<p class= "jove_content"> ومع ذلك، قد تقيد التلاعب الجيني للسكان متميزة من الخلايا العصبية أو مناطق معينة ذات أهمية لا يمكن أن يتحقق عن طريق الوراثية وحدها التي تستهدف إذا لم يعلم أحد المروجين محددة للسكان الخلايا العصبية في المصالح أو لا عبرت عنها جميع الخلايا العصبية في المنطقة من الفائدة. في الحبل الشوكي، قد تتطلب تقييد التصاميم التجريبية المكاني للتلاعب الجيني إلى واحد أو جزأين رأسي ذنبي. حقن التجسيمي من ناقلات الفيروسية التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية أو FLP يسمح الحد إعادة التركيب الجيني لمناطق في الحبل الشوكي للفئران التي يتم يحيط شظايا الحمض النووي عن طريق loxP أو مواقع FRT، ما يسمى الأليلات floxed أو flrted. على عكس إعادة ترتيب DNA التأسيسي، الذي من شأنه أن يؤدي من التهجين للحيوانات مع الفئران معربا عن recombinase، فإن هذه الاستراتيجية توفر أيضا السيطرة الزمنية على تفعيل الجينات أو إسكات. floxed ناقلات فيروسية أو ترميز الجينات المحورة تعاملت تقديم خيار عكس التلاعب الجيني في الفئران التعبير عن corresponding المصب recombinase من المروج الخلايا العصبية الخاصة. ناقلات المؤتلف مع تقارب عدة لالخلايا العصبية متاحة 4. ويشيع استخدام ذات قدرة عالية (جبان) اتش، فيروس الغدة المرتبطة بها، وفيروس الهربس البسيط الفيروسة البطيئة ناقلات الموجهات العصبية. اختيار الفيروس مناسبة لسؤال البحث هو جزء حاسم من التصميم التجريبي. حجم التحوير، طرق التوصيل، خصوصية العدوى إلى الخلايا العصبية بدلا من الخلايا الدبقية، فعالية العدوى، والآثار الجانبية السامة والتهابات تحتاج إلى النظر فيها 4.نحن هنا وصف حقن التجسيمي من ناقلات فيروسية في القرن الظهري في النخاع الشوكي، وهي تقنية التي نستخدمها لتنظيم الجينات الشرطية في أبحاثنا على بيولوجيا الأعصاب من الألم. القرن الظهري يتلقى مساهمات من الخلايا العصبية الحسية الجسدية وارد الأولية بما في ذلك الخلايا العصبية nociceptive. interneurons المحلية معالجة المعلومات قبل الخلايا العصبية الإسقاط من يجاريهاالقرن الظهري إلى الدماغ 5. علينا أن نبرهن إصابة الخلايا العصبية القرن الظهري في النخاع المستوى القطاعي L4 مع فيروس الغدة المرتبطة المؤتلف الموجهات العصبية (rAAV) التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء تعزيز (EGFP) تحت المروج الفيروس المضخم للخلايا النشطة جوهري.
Protocol
Representative Results
Discussion
التجسيمي حقن الخلايا العصبية التي تستهدف ناقلات يسمح الحبل الشوكي لتطبيقات مثل رسم خرائط شبكة الخلايا العصبية على أساس الفيروس عبر التشابك نشر أو 6،7 optogenetic تشريح 8، التوجيه محور عصبي خلال التجديد من الاصابة 9،10، أو العلاج الجيني لمنع أو علاج تنكس عص…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر باخوس طنوس A.، دكتوراه، مدير تطوير وإنتاج النواقل في مركز العلوم العصبية من مستشفى ماساتشوستس العام، تشالزتاون، ماساتشوستس، لتزويدنا ناقلات rAAV-EGFP، والعضو الذكري جون للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من قبل منحة R01 NS050408 (لJS) من المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
