Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal
Summary
Vetores virais permitem a manipulação de genes alvo. Nós demonstramos um método para a expressão de genes condicionais ou ablação da medula espinhal de rato, utilizando a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal, um local proeminente de contacto sináptico entre os aferentes primários e os neurónios de somatossensorial no sistema nervoso central.
Abstract
Intraparenquimatosa injecção de um vector viral permite a manipulação genética condicional em populações distintas de neurônios ou regiões específicas do sistema nervoso central. Nós demonstramos uma técnica de injecção estereotáxica que permite a expressão do gene alvo ou silenciamento no corno dorsal da medula espinal do rato. O procedimento cirúrgico é breve. Ele requer laminectomia de uma única vértebra, fornecendo para a recuperação rápida do animal e da motilidade perfeita da coluna vertebral. Injecção controlada de um pequeno volume vector suspensão a baixa velocidade e à utilização de uma micro-seringa com cânula de vidro biselado minimizar a lesão dos tecidos. A resposta imunitária local do vector depende das propriedades intrínsecas do vírus empregue, na nossa experiência, é menor e de curta duração quando um vírus adeno-associado recombinante é utilizado. Um gene repórter, tais como a proteína fluorescente verde melhorada facilita a distribuição espacial de controlo do vector, e a eficácia e celular specipecificidade da transfecção.
Introduction
As tecnologias avançadas de manipulação genética condicional no rato permitir abordagens multifacetadas para a exploração de vias sinápticas e ligações funcionais no sistema nervoso central. Os transgenes podem ser regulados por moléculas pequenas efectoras, tais como a doxiciclina que actuam sobre um transactivador controlado por tetraciclina, que pode ser concebido para funcionar como um repressor ou um activador da transcrição de genes, ou tamoxifeno reconhecendo um domínio mutado de ligação ao ligando do receptor de estrogénio 1 . Modificação irreversível transgene geralmente é conseguido por o ácido desoxirribonucléico (DNA) recombinases. Cre (recombinação causas) e FLP (flippase enzima de recombinação) catalisam a excisão, inversão ou translocação de fragmentos de DNA que são ladeadas por loxP (locus de cruzamento x mais, P1) ou Frt (flippase alvo de reconhecimento) sites, respectivamente 1. As aplicações incluem a ativação do gene ou silenciamento e ácido induzível ribonucléico (RNA) interferência <sup> 2. Expressão condicional de repórteres fluorescentes ou enzimáticos, tais como β-galactosidase ou fosfatase alcalina pode ser utilizada para rotular os neurónios e examinar a sua organização tópica e conectividade 3. Grandes projectos de mutagênese na América do Norte ( http://www.norcomm.org/index.htm ) e Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) estão produzindo bibliotecas de clones de rato com células-tronco embrionárias condicionais genes alvos e armadilhas que eventualmente cobrem o genoma do rato inteiro. Ratos gerados a partir destes clones podem ser cruzadas com um número crescente de linhas de ratinhos que expressam ADN sob recombinases promotores ou loci específicos para uma determinada população de neurónios para a manipulação de genes selectiva ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> No entanto, restringir a manipulação de genes a diferentes populações de neurónios ou de regiões de interesse particular não pode ser obtida por segmentação genética sozinho, se um promotor específico para a população de neurónios de interesse não é conhecido ou não expresso por todos os neurónios na região de interesse. Na medula espinal, os desenhos experimentais podem exigir restrição espacial da manipulação genética de um ou dois segmentos crânio-caudal. Injecção estereotáxica de um vector viral que expressa Cre ou Flp permite limitar a recombinação de genes para as regiões na medula espinal de ratos em que os fragmentos de DNA são flanqueados por sítios loxP ou FRT, os chamados alelos floxed ou flrted. Ao contrário de rearranjo do DNA constituinte, que resultaria da hibridização, os animais com ratos que expressam recombinase, esta estratégia também proporciona um controlo temporal sobre a activação do gene ou silenciamento. Os vectores virais que codificam floxed ou flertou transgenes oferecem uma opção inversa de manipulação de genes em ratos expressando a corresponding recombinase jusante de um promotor específico para neurónios. Vários vetores recombinantes com afinidade para os neurônios estão disponíveis 4. De elevada capacidade de adenovírus (gutless), vírus adeno-associados, vírus do herpes simplex e lentivírus são comumente utilizados vectores neurotrópicas. Selecionando o vírus apropriado para uma questão de pesquisa é uma parte crucial do projeto experimental. Tamanho do transgene, via de administração, a especificidade da infecção para os neurónios, em oposição às células da glia, a eficácia da infecção, os efeitos secundários inflamatórios e tóxicos precisam ser considerados 4.Aqui descrevemos a injecção estereotáxica de um vector viral no corno dorsal da medula espinhal, uma técnica que empregam para a regulação do gene condicional na nossa pesquisa sobre a neurobiologia da dor. O corno dorsal recebe entrada aferente primário neurônios somatossensoriais incluindo neurónios nociceptivos. Interneurônios locais processar as informações antes de neurônios de projeção transmiti-lo a partir decorno dorsal para o cérebro 5. Nós demonstramos que a infecção de neurónios do corno dorsal da coluna vertebral ao nível segmental L4 com um neurotrópica de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que expressa a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) no âmbito de um promotor de citomegalovírus constitucionalmente activo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injecção estereotáxica vector permite a segmentação neurónios da espinal medula de aplicações, tais como mapeamento de rede neuronal com base em vírus transsináptica espalhando 6,7 ou optogenética dissecção 8, durante a regeneração axonal de orientação a partir de 9,10 lesão, ou terapia de gene para a prevenção ou tratamento da neurodegeneração 11, 12. Os vectores virais têm sido utilizados para a manipulação de genes na medula espinhal de estudar vias…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Bakhos A. Tannous, Ph.D., Diretor de Desenvolvimento de Vector e Produção no Centro de Neurociências de Massachusetts General Hospital, em Charlestown, Massachusetts, para fornecer-nos com o vetor rAAV-EGFP e João Whang para assistência técnica. Este trabalho foi financiado por subvenções R01 NS050408 (a JS) do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
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