Summary
바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
바이러스 벡터의 Intraparenchymal 주사가 뉴런 또는 중추 신경계의 특정 지역의 독특한 인구에 조건부 유전자 조작을 할 수 있습니다. 우리는 마우스 척추의 등 뿔의 대상으로 유전자 발현이나 입을 수 stereotaxic 분사 기술을 보여줍니다. 수술 절차는 간단합니다. 그것은 동물과 척추 손상되지 않은 운동성의 빠른 복구를 위해 제공하는 하나의 척추 뼈의 laminectomy이 필요합니다. beveled 유리 캐뉼라와 microsyringe의 낮은 속도와 사용의 작은 벡터 정지 볼륨의 조절 주입은 조직 병변을 최소화합니다. 벡터에 대한 현지 면역 반응은 고용 바이러스의 고유 특성에 따라, 우리의 경험으로는, 재조합 adeno - 관련 바이러스가 사용될 때 미성년자 수명이 짧은 것입니다. 이러한 강화 된 녹색 형광 단백질 등의 리포터 유전자는 벡터의 모니터링 공간 배포를 용이하게하고, 효능 및 세포 specitransfection의 ficity.
Introduction
마우스 조건부 유전자 조작의 고급 기술은 중추 신경계의 신경 경로와 기능 연결의 탐구에 다각적 인 접근을 가능하게합니다. Transgenes은 에스트로겐 수용체 (1)의 변이 리간드 결합 도메인을 인식 억제 또는 유전자 전사의 활성화, 또는 tamoxifen으로 작동하도록 설계 할 수있는 테트라 사이클린 제어 transactivator에 행동 등 doxycycline와 같은 작은 분자 effectors에 의해 규제 될 수 있습니다 . 돌이킬 수없는 transgene 수정은 일반적으로 데 옥시 리보 핵산 (DNA) recombinases에 의해 달성된다. Cre (원인 재조합) 및 Flp (flippase 재조합 효소)는 절단, 반전 또는 각각 1 loxP (교차로 X의 궤적 이상, P1) 또는 Frt (flippase 인식 대상) 사이트로 둘러싸인 아르 DNA 조각의 translocation을 catalyze. 응용 프로그램은 유전자 활성화 또는 입을과 inducible ribonucleic 산성 (RNA) 간섭을 포함
4 이용하실 수 있습니다. 높은 용량 (베짱) 아데노 바이러스, adeno - 관련 바이러스, 헤르페스는 바이러스를 단순하고 lentivirus는 일반적으로 neurotropic 벡터를 사용합니다. 연구 질문에 해당하는 바이러스를 선택하면 실험 설계의 중요한 부분입니다. transgene의 크기, 배달 경로, 염증과 독성 부작용 4 간주해야 glial 세포, 감염 효능, 반대로 뉴런에 감염의 특이성.
여기 우리는 척추의 등 뿔, 우리는 고통의 신경 생물학에 대한 우리의 연구에서 조건부 유전자 조절을위한 고용 한 기술로 바이러스 벡터의 stereotaxic 주사를 설명합니다. 등쪽 뿔은 nociceptive 뉴런을 포함한 기본 somatosensory 뉴런에서 수입 성의를 입력받습니다. 프로젝션 뉴런이에서 전달하기 전에 지역 interneurons는 정보를 처리뇌 5 등쪽 뿔. 우리는 constitutively 활성화 사이토 메갈로 바이러스 프로모터에서 더욱 녹색 형광 단백질 (eGfp)를 표현하는 neurotropic 재조합 adeno - 관련 바이러스 (rAAV)와 척추 segmental 수준 L4의 등쪽 뿔 뉴런의 감염을 보여줍니다.
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Protocol
설명 수술 절차는 컬럼비아 대학 (Columbia University)의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 장비 및 바이러스 입자 현탁액의 준비
- 장비를 청소하고 소독, 수술기구와 척추 뼈의 L1 문제를 해결하는 데 사용됩니다 V 노치 스파이크를 소독.
- 당기 및 베벨 유리 피펫. 우리는 40 μm의 팁 직경이 20 °의 각도로 beveled 아르 피펫을 사용합니다. 유리 피펫 멸균을.
- stereotaxic 프레임을 설정, 머니퓰레이터에 microsyringe 분사기를 장착하고 컨트롤러에 주입기를 연결합니다.
- 압축 피팅 키트를 사용하여 microsyringe에 유리 피펫 중 하나를 첨부합니다.
- microsyringe에서 플런저를 제거하고 미네랄 오일과 주사기를 입력합니다. 오일 레드 O (1 - (2,5 - 디메틸-4-(2,5-dimethylphenylazo) phenylazo) -2 - 나프톨은)는 v를 높이기 위해 미네랄 오일에 추가 할 수 있습니다isibility. 플런저를 다시 삽입하고 팁의 모든 방식을 밀어. 조심스럽게 기포를 생성하지 마십시오.
- 바이오 안전성 캐비닛의 바이러스 입자 현탁액을 준비합니다. 얼음에 얼어 붙은 바이러스를 해동하고, 단지 사용하기 전에, 원하는 입자 농도에 생리 멸균 인산 버퍼로 희석.
- 주입기의 홀더에 microsyringe를 삽입합니다.
- 작은 플라스틱 시트로 바이러스 정지 피펫 5 μl, 예를 들어 Parafilm. 드롭에 유리 피펫 팁을 절감하고 microsyringe을 채우기 위해 플런저를 당긴다. 막힘 않도록하기 위해 피펫 팁의 작은 기포를 만듭니다.
2. Laminectomy
- 벤치와 살균제로 소독 가열 패드를 닦고하여 수술 영역을 준비합니다.
- 마우스를 마취. 우리는 isoflurane과 흡입 마취를 사용하여 (3 %를 유도, 유지 보수 기간 동안 2% -3 % 중).
- 동안 건조에서 눈을 보호하기 위해 각 눈에 윤활제를 배치작동.
- 허리에서 마우스의 목에 털을 면도하고 chlorhexidine 또는 povidone-요오드와 70 %의 에탄올과 같은 국소 살균의 잎사귀 교대로 피부를 소독. 수술 드레이프와 무균 준비된 사이트를 격리하고 bupivacaine (0.25 % 생리 식염수에 희석 1시 10분)로 절개 사이트를 침투.
- 중간 선 (2-3 ㎝)을 따라 흉곽의 꼬리 끝에있는 피부를 절개하고 척추를 덮고있는 근막을 분리합니다.
- 척추는 척추 열보다 출생 후의 개발 기간 동안 이전의 성장을 중지하기 때문에, 척추 세그먼트 L4는 첫 번째 요추 척추 (L1) 아래에 자리 잡고 있습니다. 척추 L1은 갈비뼈의 마지막 쌍을 보유하고있는 척추에 꼬리에 자리 잡고 있습니다. 확인하고 작은 척추 근육과 등쪽 표면에 부착 인대를 제거하여 척추의 L1을 쉽게받을 수 있습니다.
- 약간 Adson의 포셉과 함께 척추 뼈의 L1를 들고십시오. 등쪽의 portio를 제거하는 전용 laminectomy의 집게를 사용하여N 척추 (척추와 얇은 판)와 척수를 노출의. 척수를 손상하지 마십시오.
- stereotaxic 프레임에 가열 플레이트에 마우스를 전송합니다. 후속 작업 중에 마우스의 온도를 모니터링 할 수 있습니다.
3. 주입
- V 노치 스파이크와 척추 L1 문제를 해결했습니다. 척추 뼈가 호흡하는 동안 움직이지 않도록 스파이크는 척추를 안정화해야합니다.
- 가까이 있으므로 피펫 팁은 laminectomy 사이트 위에있는 microsyringe 가져와. 당신은 피펫을 종료 바이러스 정지가 나타날 때까지 플런저를 낮 춥니 다. 멸균면 팁으로 작은 물방울을 제거합니다.
- 노출 된 척수의 뱃 부리 장식이있는 - 가장 부분에 피펫 팁을 배치합니다. 센터 뒤쪽 중간 고랑 위의 피펫 다음, 500 μm 측면 팁을 이동합니다. 코드와 펑크 경질 한 학교의 표면에 팁을 낮추거나, 당신이 unbeveled 유리 피펫 작업을하는 경우, D에게 주사에 beveled 철강 캐뉼라를 사용하여우라. 척수에 유리 피펫 300 μm의 팁을 낮 춥니 다.
- 200 NL / 분의 속도로 바이러스 정지 1 μl를 삽입.
- 분사의 끝에서 천천히 retracting 피펫을하기 전에 최소한 2 분 정도 기다리십시오.
- 척추 세그먼트 L4에서 바이러스 벡터의 전체 분포를 달성하기 위해 노출 된 척수의 꼬리 - 대부분의 부분에 3.5 단계 3.3를 반복합니다. 두 사출 사이트는 대상 지역의 조직 손상을 방지 할 수 뱃 부리 장식이있는 및 L4 세그먼트의 꼬리에 위치해 있습니다.
4. 상처 폐쇄
- 릴리스 척추 V 노치 클램프의 L1하고 stereotaxic 프레임에서 마우스를 제거합니다.
- 5.0 vicryl과 근막을 봉합 해. 폐쇄 근막은 laminectomy 사이트에 대한 커버를 제공합니다.
- 나일론 봉합이나 수술 스테이플로 피부를 닫습니다.
5. 수술 후 관리
- 부드러운 nonparticular 침구 복구 케이지에 마우스를 전송합니다. t에 배치그는 편안한 호흡을 위해면. 이 걸을 수있는, 완벽하게 경고하고 술을 시작할 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다.
- 우리는 carprofen 매일 피하 주사 (5.0 밀리그램 / kg)와 72 시간에 postsurgical 진통제를 제공합니다.
- 처음 3 일간 매일 검사하여 postsurgical 복구를 모니터링 한 다음 실험까지 매일 3 일에 한 주이 완료됩니다.
- 상처 치유가 완료되면, 7-10일 수술 후 피부 봉합 또는 스테이플을 제거합니다.
- 실험 완료 후 동물을 안락사시켜야.
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Representative Results
성공적으로 transfection 수율 contralateral 측면, 배면의 뿔과 등쪽 루트 신경절의 등 뿔을 구해 주신 주입 등쪽 뿔 (그림 1)의 뉴런에 강력한 유전자 표현.
1 그림. 등쪽 뿔 뉴런의 Transfection. (A) L4 척추, rAAV-eGfp의 stereotaxic 주입 후 2 주 (혈청 형 AAV2 / 8 / 10 9 게놈 사본의 왼쪽 등쪽 뿔에있는 형광 기자 eGfp (녹색)의 표현 ) μl. 뉴런은 neuronal 핵 단백질 (NeuN, 빨간색)을 immunostained되었습니다. 화살표는 등쪽의 항목에 흩어져 transfected glial 세포에 지점을 향합니다. 스케일 바, 150 μm. (B) 내측 등쪽 뿔에있는 뉴런의 약 80 %가 감염되었습니다. 스케일 바, 20 μm. NeuN (EMD Millipore)에 대한 단클론 항체는 1:2,0의 희석에 사용 된immunostaining에 대한 00.
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Discussion
Stereotaxic 벡터 주입은 neurodegeneration 11 예방 또는 치료에 대한 상해 9,10, 또는 유전자 치료에서 재생하는 동안 6,7 또는 optogenetic의 해부 8, 축삭 안내를 확산 transsynaptic 바이러스에 따라 이러한 neuronal 네트워크 매핑과 같은 응용 프로그램에 대한 척추의 뉴런을 대상으로 할 수 있습니다 12. 바이러스 벡터는 somatosensory, 모터 및 자율 경로주세요 9,10,13-15을 공부하는 척수의 유전자 조작에 사용되었습니다. 마우스는 가장 널리 뇌 또는 척수에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주사를 포함하는 연구에 사용 된 모델 생물이지만, 기술은 nonhuman 영장류 16 등의 다른 종에 채용되었습니다.
마우스 척수로 Stereotaxic 벡터 주입은 안전, 동물 instabili없이 복구 수 있도록 여기에 설명 된 수술은 주입 사이트에서 하나의 laminectomy가 필요합니다는 척추의 움직임에 티. 사출 및 캐뉼라의 느린 제거는 10 분 내에 완료, 피부 준비와 상처 폐쇄를 포함한 전체 과정은 약 40 분 정도 소요됩니다. 우리는 carprofen, 비 스테로이드 항 염증성 진통제 약물에 72 시간을위한 postsurgical 마취를 제공합니다.
조직의 외상을 최소화하기 위해, 우리는 40 μm의 팁 직경과 당겨 유리 cannulas를 사용합니다. 날카로운 beveled 캐뉼라 팁은 micropipette 연삭기의 투자를 정당화, 척수에 삽입을 쉽게. 연삭기의 사용은 또한 주입 결과의 편차를 줄이고, 각 실험에서 일관 베벨 각도를 유지 할 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에있는 바이러스 입자 현탁액의도 배포 수동 천계의 17 이상 주입 속도의 자동 제어를 선호 주입 오류의 위험을 줄이기 위해. 마찬가지로 중요한이 injecti를 완료 한 후 2-5 분을 시작해야 캐뉼라의 느린 추출입니다다시 바이러스 정지를 그림과 extraspinal 유출의 원인이되지 않도록하는 방법에 대한.
intraspinal transfection의 정도 및 배포는 주입 입자 복용 및 혈청 형 및 감염 효능으로 바이러스 벡터의 고유 특성에 따라 달라집니다. 최적의 입자 희석는 각 바이러스와 혈청 형에 대해 경험적으로 결정되어야하고 동일한 바이러스의 다른 일괄 사이에 차이가있을 수 있습니다. 감염과 DNA의 도입 모두의 효능은 뉴런 18,19의 대상 인구에 따라 다를 수 있습니다. AAV는 병원성과 최소한의 면역 부작용없이 20 뉴런에 유전자 전송을 실현. 우리의 경험에서 등쪽 뿔 뉴런의 감염 1-2 주 안정 내에 완료됩니다. 우리는 사출 사이트에서 사소한 microglial 반응을 관찰했지만 이것들은 일주일 이내에 해결.
우리는 건강 검진 보고서에 이러한 eGfp 같은 리포터 유전자를 표현 벡터의 다른 serotypes을 비교하는 것이 좋습니다transfection 속도를 uate, 사출하고 안정적인 transfection 사이의 시간 간격을 결정하고 감염이 뉴런로 제한 여부를 설정합니다. 특이성은 벡터, transfected 유전자와 프로모터의 셀 tropism에 따라 달라집니다. somatosensory 경로를 연구 조사는 또한 등쪽 뿔에서의 중앙 터미널이나 뇌척수 19 오염에서 이러한 뉴런의 감염으로부터 발생할 수 있습니다 리포터 유전자의 잠재적 인 표현 등쪽 루트 신경절의 뉴런을 검사해야합니다.
미국에서 유전자 조작에 대한 바이러스 벡터의 사용은 재조합 DNA 분자 (참여 연구 NIH 가이드 라인에 의해 규제 http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html을 ). 이 가이드 라인은 조사원 교육, 개인 보호, 바이러스 성 벡터 억제, decontaminatio에 대한 요구 사항을 규정N, 이러한 사용 주사기와 cannulas, 그리고 주입 후 동물의 주택과 같은 오염 물질의 처리. 조사는 지역 IACUC 또는 연구에 적용되는 규칙과 규정을 결정하기 위해 기관 감독의 등가 몸으로 작동합니다.
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Disclosures
제작자들은 더 경쟁 금융 이익이 없다는 점 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을 Bakhos A. Tannous, 박사, rAAV-eGfp 벡터으로 우리를 제공 매사추세츠 종합 병원, 찰스 타운, 매사추세츠,의 신경 과학 센터에서 벡터 개발 및 생산 이사, 존 강타 감사드립니다. 이 작품은 신경 질환 및 뇌졸중의 국립 연구소에서 교부금으로 R01 NS050408을 (JS까지) 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
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