Stereotaksiske Injeksjon av en viral vektor for betinget genmanipulering i Mouse Spinal Cord
Summary
Virale vektorer tillate målrettet genmanipulering. Vi viser en fremgangsmåte for betinget genekspresjon eller ablasjon i mus ryggmargen ved hjelp stereotaksiske injeksjon av en viral vektor i dorsal horn, en fremtredende område av synaptiske kontakt mellom primære somatosensoriske afferenter og nevroner i sentralnervesystemet.
Abstract
Intraparenchymal injeksjon av en viral vektor gjør betinget genmanipulering i forskjellige populasjoner av nerveceller eller bestemte regioner i det sentrale nervesystemet. Vi viser en stereotaksiske injeksjonsteknikk som muliggjør en målrettet genuttrykk eller stanse i dorsalhornet av musen ryggmargen. Den kirurgiske prosedyren er kort. Det krever laminektomi av en enkelt vertebra, sørger for rask gjenoppretting av dyret og usvekket motilitet av ryggraden. Kontrollert injeksjon av en liten vektor suspensjon volum ved lav hastighet og bruk av en mikrosprøyte med fasettglass kanyle minimere vevet lesjonen. Den lokale immunrespons til vektoren avhenger av de iboende egenskapene til viruset benyttes, i vår erfaring, er det mindre og kortvarige når en rekombinant adeno-assosiert virus er brukt. Et rapportørgen som forbedret grønt fluorescerende protein forenkler overvåking romlige fordelingen av vektoren, og effekt og cellulære specificity av transfeksjon.
Introduction
Avansert teknologi for betinget genmanipulering i musen gjør mangefasetterte tilnærminger til utforskning av synaptiske trasé og funksjonelle forbindelser i det sentrale nervesystemet. Transgener, kan reguleres ved små-molekyl effektorer som doksycyklin virker på en tetracyklin-kontrollert transactivator, som kan være konstruert for å fungere som et repressor eller en aktivator av gentranskripsjon, eller tamoxifen gjenkjenne en mutert ligand-bindende domene av østrogen reseptor 1 . Irreversible transgenet modifikasjon er ofte oppnådd ved deoksyribonukleinsyre (DNA) recombinases. CRE (årsaker rekombinasjon) og Flp (flippase rekombinasjon enzym) katalysere excision, inversjon eller translokasjon av DNA-fragmenter som er flankert av loxP (locus of krysset x over, P1) eller Frt (flippase anerkjennelse target) områder, henholdsvis 1. Bruksområder omfatter genaktivering eller taushet induserbar ribonukleinsyre (RNA) interferens <sup> 2. Betinget uttrykk av fluorescerende eller enzymatisk reportere som β-galaktosidase eller alkalisk fosfatase kan brukes til å merke nevroner og undersøke deres topisk organisasjon og tilkobling 3. Store mutagenese prosjekter i Nord-Amerika ( http://www.norcomm.org/index.htm ) og Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) produserer biblioteker av mus embryonale stamceller kloner med betingede genet mål og feller som til slutt vil dekke hele musa genomet. Mus som genereres fra disse kloner kan passeres med et voksende antall mus linjer som uttrykker DNA recombinases henhold arrangører eller loci som er spesifikke for en bestemt populasjon av nerveceller for selektiv genmanipulering ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).
<p class= "Jove_content"> kan imidlertid begrense genmanipulering til distinkte populasjoner av nerveceller eller bestemte regioner av interesse ikke oppnås ved genetisk målretting alene hvis en promoter som er spesifikk for neuron populasjonen ikke er kjent eller ikke uttrykkes av alle nevronene i regionen av interesse. I ryggmargen, kan eksperimentelle design krever romlig begrensning av genmanipulering til ett eller to craniocaudal segmenter. Stereotaksiske injeksjon av en viral vektor som uttrykker Cre eller Flp lar deg begrense genet rekombinasjon til regioner i ryggmargen av mus der DNA-fragmenter flankert av loxP eller FRT områder, såkalte floxed eller flrted alleler. I motsetning til konstituerende DNA omorganisering, noe som ville resultere fra crossbreeding dyrene med rekombinase uttrykker mus, gir denne strategien også timelige kontroll over genet aktivering eller Silencing. Virale vektorer som koder floxed eller flørtet transgener tilby en omvendt muligheten genmanipulering i mus som uttrykker corresponding rekombinase nedstrøms et nevron-promoter. Flere rekombinante vektorer med affinitet til nevroner er tilgjengelig 4. Høy kapasitet (gutless) adenovirus, adeno-assosiert virus, herpes simplex virus og lentivirus blir ofte brukt neurotropisk vektorer. Velge riktig virus for en problemstilling er en viktig del av den eksperimentelle design. Størrelsen av transgenet, produksjonstid rute, spesifisitet av smitte til nevroner i motsetning til gliaceller, infeksjon effekt, inflammatoriske og giftig bivirkninger må vurderes 4.Her beskriver vi stereotaksiske injeksjon av en viral vektor i dorsal horn av ryggmargen, en teknikk som vi bruker for betinget genregulering i vår forskning på nevrobiologi av smerte. Dorsalhornet mottar afferent input fra primære somatosensoriske nevroner inkludert nociceptive nerveceller. Lokale interneurons behandler informasjonen før projeksjon nevroner formidle det fradorsalhornet til hjernen 5. Vi viser smitte av dorsal horn nevroner på spinal segmentell nivå L4 med en neurotropisk rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) som uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein (eGfp) under en konstitutivt aktiv cytomegalovirus promoter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotaksiske vektor injeksjon tillater målretting ryggmargssegmenter nevroner for applikasjoner som neuronal nettverk kartlegging basert på transsynaptic viruset sprer 6,7 eller optogenetic disseksjon 8, axon veiledning under regenerering fra skade 9,10 eller genterapi for forebygging eller behandling av nevrodegenerasjon 11, 12. Virale vektorer har vært brukt til genmanipulering i ryggmargen for å studere somatosensoriske, motor og autonome trasé 9,10,13-15.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bakhos A. Tannous, Ph.D., direktør for Vector Utvikling og Produksjon i Neuroscience Center of Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts, for å gi oss med rAAV-eGfp vektor, og John Whang for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av stipend R01 NS050408 (til JS) fra National Institute of nevrologiske lidelser og hjerneslag.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2, 743-755 (2001).
- Couto, L. B., High, K. A. Viral vector-mediated RNA interference. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 534-542 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Davidson, B. L., Breakefield, X. O. Viral vectors for gene delivery to the nervous system. Nature Reviews Neuroscience. 4, 353-364 (2003).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11, 823-836 (2010).
- Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 21848-21853 (2010).
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72, 938-950 (2011).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
- Tang, X. Q., Heron, P., Mashburn, C., Smith, G. M. Targeting sensory axon regeneration in adult spinal cord. J. Neurosci. 27, 6068-6078 (2007).
- Cameron, A. A., Smith, G. M., Randall, D. C., Brown, D. R., Rabchevsky, A. G. Genetic manipulation of intraspinal plasticity after spinal cord injury alters the severity of autonomic dysreflexia. J. Neurosci. 26, 2923-2932 (2006).
- Passini, M. A., et al. CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 120, 1253-1264 (2010).
- Lutz, C. M., et al. Postsymptomatic restoration of SMN rescues the disease phenotype in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3029-3041 (2011).
- Chen, S. L., et al. dsAAV type 2-mediated gene transfer of MORS196A-EGFP into spinal cord as a pain management paradigm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 20096-20101 (2007).
- South, S. M., et al. A conditional deletion of the NR1 subunit of the NMDA receptor in adult spinal cord dorsal horn reduces NMDA currents and injury-induced pain. J. Neurosci. 23, 5031-5040 (2003).
- Tappe, A., et al. Synaptic scaffolding protein Homer1a protects against chronic inflammatory pain. Nat. Med. 12, 677-681 (2006).
- Colle, M. A., et al. Efficient intracerebral delivery of AAV5 vector encoding human ARSA in non-human primate. Human Molecular Genetics. 19, 147-158 (2010).
- Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus. J. Vis. Exp. (53), e2834 (2011).
- Snyder, B. R., et al. Comparison of adeno-associated viral vector serotypes for spinal cord and motor neuron gene delivery. Hum. Gene Ther. 22, 1129-1135 (2011).
- Towne, C., Pertin, M., Beggah, A. T., Aebischer, P., Decosterd, I. Recombinant adeno-associated virus serotype 6 (rAAV2/6)-mediated gene transfer to nociceptive neurons through different routes of delivery. Mol. Pain. 5, 52 (2009).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian. 8, 148-154 (1994).
