マウス脊髄における条件遺伝子操作のためのウイルスベクターの定位注射
Summary
ウイルスベクターは、標的遺伝子操作が可能になります。我々は、脊髄後角へのウイルスベクターの定位注射、一次体性感覚求心性および中枢神経系の神経細胞間のシナプスの接触の著名なサイトを使って、条件付き遺伝子発現やマウス脊髄におけるアブレーションのための方法を示しています。
Abstract
ウイルスベクターの実質内注射は、神経細胞や中枢神経系の特定領域の異なる集団の中の条件遺伝子操作を可能にします。我々は、マウスの脊髄後角における標的遺伝子発現またはサイレンシングを可能に定位注入技術を実証する。手術は短時間です。それは動物と脊椎の健常運動性の迅速なリカバリを提供する、単一の椎骨の椎弓切除術を必要とします。傾斜のガラスカニューレとシリンジの低速および使用に小さなベクター懸濁液量の制御された注射は組織病変を最小限に抑えます。ベクトルの局所免疫応答は、採用ウイルス固有の性質に依存し、我々の経験では、組換えアデノ随伴ウイルスを使用した場合、マイナーと短命です。このような強化された緑色蛍光タンパク質などのレポーター遺伝子は、ベクターの監視空間分布を容易にし、有効性や携帯仕様トランスフェクションのficity。
Introduction
マウスにおける条件遺伝子操作の高度な技術は、中枢神経系におけるシナプス経路と機能の接続の探査への多面的なアプローチを可能にします。導入遺伝子は、エストロゲン受容体1の変異型リガンド結合ドメインを認識するリプレッサーまたは遺伝子の転写活性化因子、またはタモキシフェンとして機能するように設計することができるテトラサイクリン制御トランスに作用するようドキシサイクリンなどの小分子エフェクターによって調節することができる。不可逆的な導入遺伝子の改変は、一般的デオキシリボ核酸（DNA）リコンビナーゼによって達成される。 CRE（原因組換え）とFLP（フリッパーゼ組換え酵素）が切除、反転またはそれぞれ1のloxP（クロスxの軌跡上、P1）またはFRT（フリッパーゼ認識対象）サイトが隣接してDNA断片の転移を触媒する。アプリケーションでは、遺伝子の活性化またはサイレンシングおよび誘導リボ核酸（RNA）干渉を含む<sup> 2。例えば、β-ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの蛍光または酵素レポーターの条件式は、ニューロンにラベルを付け、それらの局所組織と接続3を調べるために使用することができます。北米（の大規模な変異導入プロジェクトhttp://www.norcomm.org/index.htm ）、ヨーロッパ（ http://www.knockoutmouse.org/about/eucommは ）で、マウス胚性幹細胞クローンのライブラリーを製造しています最終的には全体のマウスゲノムをカバーする条件付き遺伝子標的とトラップ。これらのクローンから生成されたマウスは、選択的な遺伝子操作（たとえば、ニューロンの特定の集団へ特異的プロモーターまたは遺伝子座の下でのDNAリコンビナーゼを発現するマウス系統の拡大数と交配することができるhttp://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index 。PHP ）。
<p class= "jove_content">興味のあるニューロン集団に特異的なプロモーターが知られていないか、領域内のすべてのニューロンによって表現されていない場合には、神経細胞や関心のある特定の領域の異なる集団に遺伝子操作を制限することは、単独で標的遺伝子によって達成されない場合があります興味のある。脊髄では、実験的なデザインは、1つまたは2つの頭尾方向のセグメントへの遺伝子操作の空間的制約が必要な場合があります。 CreまたはFLPを発現するウイルスベクターの定位注入フロックス化またはflrted対立、いわゆるDNA断片がloxPまたはFRT部位に隣接されているマウスの脊髄の領域に遺伝子組換えを制限することができます。マウスを表現リコンビナーゼで動物を交配に起因する構成的DNA再構成とは異なり、この戦略はまた、遺伝子の活性化やサイレン以上時間的な制御を提供します。コードするウイルスベクターは、フロックス化または導入遺伝子はcorrespoを発現するマウスで遺伝子操作の逆のオプションを提供しています浮気ニューロン特異的プロモーターの下流にリコンビナーゼをnding。ニューロンへの親和性を持ついくつかの組換えベクターは、4利用可能です。大容量（ガット）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスやレンチウイルスは、一般的に神経親和性のベクトルを使用されています。研究課題に適したウイルスを選択すると、実験デザインの重要な部分です。導入遺伝子のサイズ、配送ルート、グリア細胞とは対照的に、神経細胞への感染の特異性、感染症の効能は、炎症性および毒性の副作用が4を考慮する必要があります。ここでは、脊髄後角へのウイルスベクターを、私たちは痛みの神経生物学上の我々の研究での条件付き遺伝子調節のために採用している手法の定位注射について説明します。後角には侵害受容性ニューロンを含む一次体性感覚ニューロンからの求心性入力を受け取る。投射ニューロンからそれを伝える前に、ローカルの介在ニューロンは情報を処理する脳5〜背角。我々は、構成的に活性サイトメガロウイルスプロモーター下に強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）を発現する神経向性組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVの）と脊髄分節レベルL4で後角ニューロンの感染を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
定位ベクターの注入は、神経変性11の予防または治療のために傷害9,10、または遺伝子治療から再生中に6,7またはoptogenetic郭清8、軸索ガイダンスを広げる経シナプスウイルスに基づいて、このような神経ネットワークのマッピングなどのアプリケーションに脊髄ニューロンを標的にできます12。ウイルスベクターは、体性感覚、運動と自律神経?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、技術的な支援をBakhos A. Tannous、博士のrAAV-EGFPベクターを用いて私たちを提供するためのマサチューセッツ総合病院、チャールスタウン、マサチューセッツ州の神経科学センターのベクター開発·生産担当ディレクター、ジョン·むちで打つことに感謝します。この作品は、神経疾患や脳卒中の国立研究所からの助成金によってR01 NS050408を（JS）にサポートされていました。
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | |
| Spinal base plate | David Kopf Instruments | 912 | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Mouse gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 923-B | |
| Adjustable base mounts | David Kopf Instruments | 982 | |
| V notch spikes | David Kopf Instruments | 987 | |
| Small animal temperature control system | David Kopf Instruments | TCAT-2LV | |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Laminectomy forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| UltraMicroPump (one) with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| Microsyringe, 65RN | Hamilton | 7633-01 | |
| RN compression fitting, 1 mm | Hamilton | 55750-01 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Microgrinder | Narishige | EG-44 |
References
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