Summary
微观粒子图像测速（μPIV）是用来配对接种于血流量，给出一个准确的流速剖面互相关微颗粒的图像可视化。剪切速率下，最大速度，速度分布图的形状，和流速，每个都具有临床应用，可以是来自于这些测量。
Abstract
微观粒子图像测速（μPIV）是用于可视化成对的图片，接种在血液流动的微颗粒。图像互相关，给出一个准确的流速剖面。一个协议为μPIV测量血流量在微。规模的微循环，血液不能被认为是一种均匀的流体，因为它是一个灵活的粒子悬浮液悬浮在血浆中，牛顿流体。从这些测量中，可以推导出剪切速率下，最大速度，速度分布图的形状，和流速。如震源深度，粒子浓度，系统符合的几个关键参数，随着各种血细胞比容和流量条件下的实施例和代表性的结果，以确保准确的，有用的数据。
Introduction
人体中含有许多血管直径小于50微米，这是主要的血液和组织之间的交流网站。这些血管的血流量的研究表示一个相当大的挑战，由于规模测量的血液的流体性质。这些测量值，包括在小动脉和小静脉的压力梯度，在墙上的剪切速度分布，是与生理反应的关键因素。现在有前所未有的机遇，以解决这些测量挑战，由于新的实验技术，在微观尺度上，研究了微循环和解决这一多尺度问题。
微观粒子的图像测速（μPIV）是一个基于粒子的流量可视化技术，用于评估血液流动的速度分布在微通道通过交叉相关。 μPIV，首先圣地亚哥等人开发的，已用于与血液流变学自杉井等人的研究，在2001年使用的手法是在100μm的圆形的玻璃管1,2测量血流量。不同的方法μPIV存在。可以使用高速摄像机相关联的运动的红血细胞（红细胞），脉冲的图片可被用来示踪粒子的运动相关联。这些选项可以配上直立或倒置显微镜，根据不同的应用。在这两种情况下，其结果是一个二维速度分布图。另一种方法是使用激光共聚焦显微镜实现2D和3D的配置文件。这种方法已被应用到血液3,4,5。
微观尺度PIV有多种并发症较宏观PIV。位宏PIV中的数据可以被限制为一个单一的平面的光通过片材，但在微观尺度上卷照明是必要的。卷照明成像微血流量是一个更大的问题，如红细胞本身相比要大的channels，使用的红细胞作为示踪粒子导致的深度的相关性（DOC），它可以显着降低的准确性的互相关结果6,7,8。继Wereley 等人（1998年）为40微米高的通道与RBC作为示踪剂的DOC是8.8微米，1微米示踪粒子DOC是6.7微米。改变通道高度和放大倍率时，这种差异变得更加明显。此外，红细胞是不透明的，并在流动的红细胞的密度增加会导致成像的困难。荧光示踪粒子，在第一圣地牙哥等人（1998）所使用的，已被作为一种工具，以减少聚焦粒子的影响，倡导使用尽可能最小的颗粒。使用直径为1微米的荧光的微粒用激光耦合的一种方法，可能会降低微血流显像10的深度的焦点问题。有几个当前的状态μPIVTEC评论的hnology，其中每一个突出的重要性μPIV血流研究11,12。几个重要的考虑，必须考虑到当使用血液μPIV。在微观层面上，改善微循环规模，血液可以不被认为是均匀的流体，因为是悬挂灵活的红血细胞（红细胞），大型白细胞，血小板及其他蛋白质悬浮在一个牛顿流体（血浆） 。
的速度分布测量信号可以用来测量微血流量的某些特性。的重要因素在microhemorheology是血液的流速的速度剖面的形状，容器的壁处的剪切应力。此信息具有临床意义，，改善微循环是网站在体内的养分交换，这种交换是剪切速率依赖。有几个目前的审查研究的微循环状态的研究，以及13，14,15。
这里介绍的是μPIV血流量测量中的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道的协议。按照本协议第1条中的来源渠道，在内部制造PDMS。获得认可的屠宰场猪血液样本和清理后，该协议的第2条。使用LaVision MITAS的μPIV系统，该协议第3条中所描述的所有数据。设置包括一个Nd：YAG激光（新浪潮研究，美国）和CCD照相机（图像激烈，Lavision）由一个可编程触发单元，在荧光显微镜加上3轴载物台移动中，和一台计算机控制的，除了到一个高速照相机（1M150 Dalsa公司，荷兰）溶液中加入红细胞本身的可视化。这两款相机连接到2端口光纤盒（德国蔡司定制）。在典型的在体内的血流量测量，直立的显微镜是用来跟踪的红细胞mselves，而在典型的体外应用倒置显微镜是用来跟踪示踪粒子。在这个独特的双重设置，允许两个示踪剂使用倒置显微镜成像光学框。通过高精密注射器泵的微芯片（Nexus3000，Chemyx公司，美国）被引入到血液。该系统示于图1中 ，图中的顶部部分表示为140μm，40μm的矩形通道的PDMS制作的图表，和底部代表整个系统，包括摄像机，激光，注射泵和显微镜。
电流μPIV集起坐，通常与专有软件，包括TSI，丹特克动力，LaVision。标准的交叉相关算法可以通过众多的软件选项，包括MATLAB的实现。该软件是不是关键，了解的对话方块对应以数学将成为使用ŗ好得多。在这个协议中戴维斯，LaVision的专有软件或MATLAB利用。此协议是不特定的软件，但菜单选项可能会在不同的地方，不同的软件包。
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Protocol
1。微晶片制造
第一步是创建或购买你的微通道。微芯片材料有很多的选择。
选择最常见的材料是聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）。出版物有很多PDMS加工通过软光刻16,17,18的方向。
PDMS通道一旦被制造的，也有一些表面处理，以扭转其天然疏水性。含氧等离子体处理是一种常见的选择。
周，埃利斯，Voelcker（2009）给表面处理，以及它们如何影响PDMS评论。这些结果是水，但是，血液有不同的性质。研究已经做了什么，表面处理是指血液皮茨等人 （2012A）。
基于这里给出的结果，它们的微芯片的表面和载玻片键合到均暴露于含氧等离子体45秒，然后牢固地压合在一起造成永久粘合。
2。血液制剂
- 收集血液样本认可的设施。例如猪血可以使用乙二胺四乙酸（EDTA）作为抗凝剂。添加1克乙二胺四乙酸，4毫升水，然后添加全血的1升的溶液，轻轻混合10倍。
当拿起血液样本，让它们慢慢冷却到室温。血液样本应该是新鲜的，理想使用的天收集血液的流变学特性，以节省。
冷藏样品可在室温下一次，然而没有抗凝全血冷冻后，将无法使用。红细胞上的抗凝血剂，可以保存在冰箱中长达42天，和全血可冷藏保存35天，但污染将有可能在一个非米兼具医疗设备21。
此外，要小心用牛或猪的样品采集方法，避免污染骨髓。
- 离心血液样品3次每次10分钟在3,000 rpm。第一次离心后，除去血浆和白膜，丢弃。它通常是最容易拆卸第一等离子体，然后丢弃或保留以供将来使用，然后以除去血沉棕黄层。
引入的移液管慢慢地，以便不使混回血液的血沉棕黄层。去除白膜后，加入约20毫升的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻混匀，recentrifuge。重复最后一步。第三次离心后，取出PBS和剩余的棕黄色大衣，丢弃。
它也可以使用本机的等离子代替PBS如果你想保持血液聚集性能。确保不能混合任何白膜或白色到血浆中的血细胞。
- 清洗红血细胞（红细胞），并悬浮在PBS或等离子在随意的浓度（血细胞比容）。检查离心比容（美国）FisherSci CritSpin，。
在10〜20％的血细胞比容的血应该是更容易的可视化比40或50％（生理血细胞比容）。血液微循环，一般是半宏循环的血细胞比容，所以H = 20是足够的15。
- 以所需浓度的血液样本，加入荧光示踪粒子。一般的规则是有10个颗粒，在相关窗口，它可以提前计算。
例如，30微升的颗粒被添加到视频中所示的设置的1毫升的血溶液。或者，可以被荧光标记的红细胞本身。
- 此外，进行校准溶液与水和流感颗粒orescing。这将是牛顿的解决方案，需要对系统进行校准。
例如，当使用10倍的目标与通道上的规模为100μm，合适的浓度为300μl的颗粒用15毫升的蒸馏水混合。另一种选择是使用用蒸馏水稀释甘油的粘度为3CP，这是更接近血液的宏观粘度。
3。 μPIV测量
- 激光安全：检查温度和湿度。穿戴合适的激光安全眼镜。关闭激光窗帘或打开门不被暴露保护，以防止有人在实验室的激光标志。
- 戴维斯软件程序在视频显示。欲了解更多详细信息，请参阅特定系统的用户手册。
- 在获取数据之前，需要进行校准相机规模使用千分尺。
- 为了降低系统的合规性，用最短的油管d为最小的刚性注射器可能的，诸如15或50微升汉密尔顿气密注射器。血液或进气口，以减少泄漏到系统中，密封管连接到注射器和芯片。这是可以做到用胶水，PDMS或凡士林（小心不要污染的血液）。
为了填补股价与示踪粒子与水的微量注射器使用回流的方法，因为微量注射器的体积通常是远小于卷以填充。
通过我们的回流方法，包括填充微量注射器和信道的信道使用的二次塑料注射器经由输出。对于这一点，首先除去微量注射器柱塞，然后推入的液体，采用经典的塑料注射器附着到出口的通道，让液体流出来的微量注射器，直到所有的微泡的微型注射器，管或芯片，终于把柱塞回，拔下塑料注射器。的存在可以验证ŗ没有微泡，用显微镜。
- 平注射器泵实现横向管。程序注射器泵所需的流量。
要意识到可能短暂影响，像“瓶颈效应”，刚性的系统或系统的合规性，修改实际流量。一个系统的特征时间可估计为一个函数的系统的材料和尺寸。 （第2章，第77-81页，Tabeling，2005年）
- 显微镜舞台上放置微芯片，并启动泵。使用水与颗粒校准系统到中间的速度分布图和校准DT（脉冲图像之间的时间）。
粒子良好的相关性11 5和10之间移动的帧之间的像素。校准时，小心衡量，在中间的通道。在中间聚焦平面具有最高的速度8。
如果使用一个圆形通道，小心的阴影效果。
图2所示的图像样本，使用脉冲的摄像头，而最佳的图像是第一个脉冲和底部的图像是第二脉冲。可以看出，图中的最亮的点（荧光颗粒）是在焦。
- 可选：数据在不同的高度的三维速度分布可以重建成一个单一的图像通过添加不同媒介。视频提出了一种的例程被开发的过程自动化。
- 当患者的血液中的数据时，填充注射器与所需量的血液中的水的方法相同的方法。编程注射泵以所需流速，并采取所需的数据。获得的原始图像的一个例子，提出了如图2所示 。小心红细胞沉降。加注射器每次运行或每其他的运行会降低红细胞的沉降。
- 获取图像后，进行相互相关的图像对取得的图像之间的速度矢量场。重要的是要具有良好的图像，以具有良好的相关性。关联之前，可以做前处理，以消除背景噪音。
在相邻的图像，它可以是多种多样的大小和形状的影响相关的窗口之间进行相互相关。交叉相关性后，可以做图像后处理，删除错误向量或离群。
不同的可用选项及其精度的详细描述，可以发现在皮茨等人 （2012B），最好的处理血液被认为是“图像重叠”与窗口长度延长的方法，与流。这些操作可以像MATLAB程序中手动完成，或在您的系统软件包。该软件并不重要，更重要的是背后的数学操作，每个操作可以影响最终速度的档案的准确性。
由此产生的向量在空间可被平均在整个信道取得瞬时速度分布，然后时刻再次平均，得到的平均的，有代表性的速度分布图。 kloosterman 等人（2011）得到大景深的μPIV测量中的错误的解释。这里介绍的数据处理错误的讨论中可以找到皮茨等人（2012B）的脉冲测量和Chayer 等人 （2012）的高速测量。
速度分布的实例列于图3和图4，图3给出一个单一的速度剖面的中心线10微升/小时流量的RBC在H = 10，在140μm宽的信道。
帐篷“这种单一的配置文件来实现的平均值在整个信道的相关的载体，得到的速度分布，然后取平均值得到有代表性的测量时间，在这种情况下，100对整个视场的时间的平均值。水标定流量与编程为30微升/小时的流速在100平方微米的信道的三维重建轮廓的一个例子，在图4中找到。在图4中 ，以1微米的间隔测量的档案。
- 可选：在所描绘的高速图像设置可以在相同条件下通过切换摄像机（和数据采集系统）。用于可视化的无细胞层中的信道，并用于定量聚合，这可能是有用的。数据分析是略有不同的（Chayer， 等人，2012）。
白光图像与无红细胞聚集预选在图5中，与指向H = 20。最佳的图像显示H = 20除去的红细胞聚集的能力，在PBS中，在1微升/小时。底部图像是原生0.5微升/小时血浆H = 20。 ，聚集在底部的图像是可见的。
- 关闭系统时，以安全的方式测量已完成。使用适当的激光安全程序，直到完全关闭激光电源。
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Representative Results
在所有的数字中，流是左到右的原始图像，并在计算速度剖面向上。与血液血细胞比容H = 10以10微升/小时的流动获得的原始数据，例如， 如图2所示。上游的数据可能会被交叉没有任何的数据处理，以实现速度分布密切相关。皮茨， 等人，（2012B）的前处理和数据处理方法的影响进行了讨论。 = 10和10微升/小时的流速得到的速度分布图，从与图2相似在hematorcrit H的数据的一个例子示出在图3中 ，从水标定如图4所示的三维轮廓。 图3和图4包括标准数据处理。可用于这些速度分布进行测量，如上面的中心的最大速度的通道，在通道中的流率，和各种流量的条件下，上面的壁剪切速率，信道共同的nfigurations，和生理上的， 图5给出了一个高速的图像的一个例子，有和没有红细胞的聚集。高速的图像，如在图5中，也可以被用于计算使用交叉相关的速度分布。
图1。图的μPIV，设置其中（a）表示为140μm40μm的矩形通道流动左到右，及（b）表示整个系统的PDMS制造。
图2。得到的原始脉冲从的μPIV系统以设定的流速为10和H = 10，在PBS中的图像数据微升/小时（流动从左向右）。最上面的图片是第一个脉冲。
图3。产生的速度轮廓从μPIV系统为H = 10在PBS中已编程的10微升/小时的流速。简介旋转，显示向上流动。
图4。例如在100平方微米的通道与多个公司采取相距1微米的水标定三维重建速度剖面。简介旋转，显示向上流动。 点击这里查看大图。
图5。高速图像顶部的例子）是H = 20在PBS 1微升/小时（无聚集）和底部）是H = 20在本土的等离子在0.5微升/小时（聚合）。在两个图像流是自左向右。
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Discussion
使用μPIV规模的微循环血流量测量可以洞察到了大量的有关生物医药，机械和化工过程。部分的关键因素考虑到红细胞本身，红细胞聚集或运动的荧光微粒的聚集和变形性，和在通道中的RBC的沉降密度。所有这些都可以被占，则一般遵循上述指引。有一个基本的清单，要记住，使用这个系统的良好的测量。首先，确定有多少合规系统或建议系统。为了尽量减少遵守使用油管可能在最短的和尽可能最小的注射器。刚性系统有更少的合规性，但可能会导致瓶颈。尽管小规模的测量，重力会影响红细胞。保持在同一高度上的注射器，管道和通道我的理想。其次，确定悬浮液的浓度。确保有足够的荧光示踪粒子在溶液中并不算太高的红细胞浓度。示踪粒子的试样的密度增加，因此无法克服的红细胞的固有的不透明度。示踪粒子的量会影响的相关性，但具有过多的红细胞难以成像的流体不透明和示踪粒子。的整体的血细胞比容的样本必须保持足够低，可以清晰地成像的通道的中间平面。这是一个权衡之间血细胞比容和通道的大小。在增加的深度，RBC和透镜之间的平面测量的量的增长，即使在低hematorcrit。以图像更高的的hematorcrit样本，或较大的信道，“鬼细胞”方法可以利用，而红细胞不透明的内部被替换为透明的液体的一部分红细胞（Goldsmith和Skalak的，1975）。第三，确保microsco线聚乙烯专注于中间平面的通道。知道信道的准确高度是非常重要的发现中间平面。请记住的颗粒的大小和通道的大小，并计算相关的深度（DOC）系统（Wereley 等人，1998）中。在DOC可以极大地影响要实现在找中间平面的准确性。相差一微米的精度可以产生不利影响。一旦的颗粒的数量，大小的通道，和DOC发现，脉冲的图像之间的时间差（dT）的需要来确定。确保在5到10像素的颗粒在窗口之间移动。粒子的运动必须融入第3.9节中列出的相关窗口。最后，决定前处理，处理或后处理的矢量数据的方法。有许多方法可以在文学，但也有一些比别人更成功时，适用于血。 “图像重叠”的方法，是副词ISED血流量（皮茨等人，2012B）。
牢记的另一个因素是“无细胞”层，这是有据可查的microhemodynamics。这是上面的信道或容器壁的红细胞缺乏。在后的荧光示踪粒子，在用户实际等离子体的运动。上面的中心的信道或船只，速度为最大时，两者都将被以相同的速度移动。在墙上，血浆仍然有运动，同时还会有很少或根本没有红细胞。 10X倍率在规模，无细胞层是不是可测量，但在更高的放大倍率，它必须考虑。高速视频允许的无细胞层的厚度的测定。
结论
μPIV血液流变学和生物医学研究已被用于后不久发展。当应用到血液流动的规模微循环障碍，血液的复杂行为必须占。这里提出了一个协议血流量的μPIV测量在微一起处理的复杂性血液的技巧。几种成像方案进行了概述，包括脉冲图像，高速图像和3D选项，以及数据处理信息。在使用μPIV的血液微流研究，药物，疾病和治疗处理的速度剖面的形状的效果进行分析。现代医学和工程以来，吸收的营养物质和药物有用的这些测量是剪切依赖。
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Disclosures
什么都没有透露。
Acknowledgments
笔者想苏拉的阿布Mallouh和弗雷德里克·法希姆用于测试的协议，理查德·普雷沃LaVision公司的技术支持，在初始运行，她的帮助，感谢NSERC（自然科学与工程理事会，加拿大）的资金，凯瑟琳Pagiatikis和Guy Cloutier联系蒙特利尔大学的贷款Dalsa公司高速摄像机。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| fluorescing micro particles | Microgenics/FisherSci | R900 | |
| glycerol (OPTIONAL) | Sigma Aldrich | G6279-500 ml | |
| microcentrifuge, i.e. CritSpin | FisherSci | 22-269-291 | |
| syringe, i.e. 50 μl Gastight | Hamilton | 80965 | |
| camera, i.e. Imager Intense, high speed | LaVision, Dalsa | Imager Intense | |
| microscope, i.e. MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| syringe pump, i.e. Nexus3000 | Chemyx, Inc. | Nexus-3000 | |
| flexible tubing, i.e. Tygon | FisherSci | 14-169-1A | |
| data processing software, i.e. DaVis | LaVision | DaVis | |
| centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F |
References
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