微粒子图像测速法用于微小血流速度分布测量

摘要

微粒图像测速技术（μPIV）用于可视化血流中示踪微粒的成对图像，通过互相关分析获得精确的速度分布。剪切速率、最大流速、速度分布形态及流量等参数均可由这些测量结果推导得出，这些参数均具有临床应用价值。

摘要

微粒子图像测速技术（μPIV）用于可视化血液流动中示踪微粒的成对图像。通过对图像进行互相关分析，可获得精确的速度分布。本文介绍了一种在微通道中进行血液流动μPIV测量的实验方案。在微循环尺度下，血液不能被视为均质流体，因为它是由悬浮在牛顿流体——血浆中的柔性颗粒组成的悬浮液。通过这些测量，可推导出剪切速率、最大速度、速度分布形状以及流量等关键参数。为了确保获得准确且有用的数据，本文还介绍了若干关键参数，如焦深、示踪粒子浓度和系统顺应性，并提供了不同红细胞压积和流动条件下的示例及代表性结果。

引言

人体内含有大量直径小于50 μm的血管，这些血管是血液与组织之间进行物质交换的主要场所。由于测量尺度极小以及血液本身的流体特性，研究这些血管中的血流状况面临巨大挑战。包括微动脉和微静脉中的压力梯度、管壁剪切力以及速度分布在内的这些测量参数，是与生理反应密切相关的关键因素。得益于在微尺度上研究微循环的新实验技术，如今已前所未有地具备了解决这些测量难题的机遇，从而应对这一多尺度的科学问题。

微粒子图像测速技术（μPIV）是一种基于粒子的流动可视化方法，通过互相关分析来评估微通道中血液流动的速度分布。μPIV 最初由 Santiago et al. 开发，自 2001 年 Sugii et al. 首次将其用于测量 100 μm 圆形玻璃管中的血流以来，该技术已广泛应用于血液流变学研究^1,2。目前存在多种 μPIV 实现方式：可采用高速相机对红细胞（RBCs）的运动进行相关分析，也可利用脉冲图像对示踪粒子的运动进行相关分析。根据具体应用需求，上述任一方法均可与正置或倒置显微镜联用。在这两种情况下，均可获得二维速度分布图。另一种方法是结合共聚焦显微镜以获取二维和三维速度分布图，该方法已被应用于血液研究^3,4,5。

与宏观PIV相比，微尺度PIV存在若干技术难点。在宏观PIV中，可通过片状光将数据限制在单一平面内，但在微尺度下必须采用体照明。体照明在微....

方案

1. 微芯片制备

第一步是制备或购买微通道。微芯片材料有多种选择。

最常选用的材料之一是聚二甲基硅氧烷（PDMS）。已有大量文献报道了通过软光刻技术制备PDMS的操作方法^16,17,18。

PDMS 通道制备完成后，可通过多种表面处理方法逆转其天然的疏水性。其中，氧气等离子体处理是一种常用方法。

Zhou、Ellis 和 Voelcker（2009）综述了表面处理及其对 PDMS 的影响。然而，这些结果是针对水的，而血液具有不同的性质。Pitts 已开展研究，探讨该表面处理对血液的意义。 等 (2012a)

对于此处展示的结果，微流控芯片表面及其所键合的玻璃载片均经过45秒的氧气等离子体处理，随后被紧密压合，从而形成永久性键合。

2. 血液制备

1. 从经认证的机构采集血液样本。例如，可使用乙二胺四乙酸（EDTA）作为抗凝剂的猪血。将1 g EDTA溶于4 ml水中，然后将该溶液加入1 L全血中，轻轻混匀10次。

采集血样后，应让其缓慢冷却至室温。血样应保持新鲜，最好在采集当天使....

结果

在所有图中，原始图像中的流动方向为从左到右，计算得到的速度分布图中流动方向为从下到上。以下为红细胞压积 H=10 的血液流动时所获得原始数据的示例 10 μl/hr 如图所示 图2原始数据可直接进行互相关分析，无需任何数据预处理，即可获得速度分布曲线。Pitts 对预处理及数据处理方法的影响进行了讨论。 等，（2012b）。基于类似数据得到的速度分布剖面示例 图2 在血细胞比容 H=10 和流速为 10 μl/hr 如图所示 图3，显示了来自水校准的三维轮廓 图4. 图3 和 4 包含标准的数据处理。这些速度分布可用于测量不同流动条件、通道构型和生理状态下的通道中心最大流速、通道内的流量以及壁面处的剪切速率。 图5 展示了红细胞（RBC）聚集前后的一例高速图像。此类高速图像如 图5 也可用于通过互相关计算速度分布。

讨论

在微循环尺度上使用μPIV进行血流测量，可为大量相关的生物医学、机械工程和化学工程过程提供深入见解。需要考虑的一些关键因素包括红细胞（RBC）本身的密度、RBC的聚集性和变形能力、荧光示踪微粒的聚集或运动，以及RBC在通道中的沉降。只要遵循上述一般性指导原则，这些因素均可得到有效控制。使用该系统进行良好测量时，需牢记一个基本检查清单。首先，确定系统或拟用系统的顺应性程度。为最小化顺应性，应使用尽可能短的管路和尽可能小的注射器。刚性系统顺应性较低，但可能导致瓶颈效应。尽管测量尺度很小，重力仍会影响RBC。理想情况下，应使注射器、管路和通道处于同一高度。其次，确定悬浮液的浓度。确保溶液中存在足够数量的荧光示踪粒子，同时RBC浓度不宜过高。增加样品中示踪粒子的密度无法克服RBC本身固有的不透明性。示踪粒子的数量会影响互相关结果，但RBC过多会使流体变得不透明，导致示踪粒子难以成像。样品的整体红细胞压积（hematocrit）必须足够低，以确保能够清晰成像通道的中层平面。这需要在红细胞压积与通道尺寸之间进行权衡。即使红细胞压积较低，随着深度增加，物镜与测量平面之间的RBC数量也会增多。为了成像较高红细胞压积的样品或更大尺寸的通道，可采用“鬼细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS），即 Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma Aldrich	E9884-100G
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
荧光微粒	Microgenics/FisherSci	R900
甘油（可选）	Sigma Aldrich	G6279-500 ml
微量离心机，即 CritSpin	FisherSci	22-269-291
注射器，即 50 μl 耐压型	Hamilton	80965
相机，即 Imager Intense，高速	LaVision, Dalsa	Imager Intense
显微镜，即 MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG 激光器	New Wave Research	Solo-II
注射泵，即 Nexus3000	Chemyx, Inc.	Nexus-3000
柔性管路，即 Tygon	FisherSci	14-169-1A
数据处理软件，即 DaVis	LaVision	DaVis
离心机，即 Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F