Summary
マイクロ粒子画像流速（μPIV）が正確な速度プロファイルを与えるクロス相関である血流に播種したマイクロ粒子のペアのイメージを視覚化するために使用されます。臨床用途を有する各々が剪断速度、最大速度、速度プロファイルの形状、流量は、これらの測定値から導出することができる。
Abstract
ミクロ粒子画像流速（μPIV）は血流に播種微粒子の一対の像を可視化するために使用される。画像は、正確な速度プロファイルを与えるクロス相関している。プロトコルは、マイクロチャネル内の血流のμPIV測定のために提示される。微小スケールで、血液は、それが血漿、ニュートン流体中に懸濁さ可撓性粒子の懸濁液であるように、均質な流体とみなすことはできない。剪断速度、最大速度、速度プロファイルの形状、流量がこれらの測定値から導出することができる。例えば、焦点深度、粒子濃度、およびシステムコンプライアンスのようないくつかの重要なパラメータは、種々のヘマトクリット及び流量条件を実施例および代表的な結果と共に、正確なデータを確実にするために提示される。
Introduction
人間の体は、血液や組織間の主な交換サイトです直径50μm未満、と数多くの船が含まれています。これらの血管内の血流の研究は、測定の規模や血液の流体特性の両方のために相当な課題である。圧力勾配、壁にせん断し、動脈と静脈の速度プロファイルを含むこれらの測定は、生理的な反応とリンク重要な要因である。これらの測定の課題を解決するための前例のない機会、微小循環を研究し、このマルチスケール問題を解決するために、ミクロスケールでの新しい実験技術のおかげで今があります。
ミクロ粒子画像流速（μPIV）は、相互相関を介してマイクロチャネル内の血流の速度プロファイルを評価するために使用されるパーティクルベースの流れの可視化技術である。第チリらによって開発されたμPIVは、血液レオロジーで使用されている杉井らから研究が2001年に100μmの円形のガラス管に1,2血流を測定するための手法を使用していました。 μPIVへの異なるアプローチが存在する。高速カメラは赤血球（RBC）の動きを相関させるために使用することができ、パルス状の画像がトレーサー粒子の移動を相関させるために使用することができる。これらのオプションのどちらかは、アプリケーションに応じて、正立または倒立顕微鏡と結合することができる。両方の場合において、結果は、2D速度プロファイルである。別のアプローチは、2Dおよび3Dプロファイルを達成するために、共焦点顕微鏡を使用することである。この方法は、血液3,4,5に適用されている。
マクロPIVと比較した場合、マイクロスケールPIVは、いくつかの合併症を持っています。マクロPIVでは、データは光のシートを通じて単一の平面に限定することができますが、マイクロスケールの音量照明で必要である。赤血球自体はCに比べて大きいようにボリューム照明、マイクロ血流のイメージングのための大きい問題であるhannels、およびトレーサー粒子として赤血球を使用して大幅に相互相関結果6,7,8の精度を減少させることができ、相関の深さ（DOC）をもたらす。 1μmのトレーサー粒子とDOCは6.7程度である中に次Wereley ら （1998）トレーサーとしてRBCと40μmの背のチャネルに対するDOCは、8.8程度である。流路高さ、倍率を変更する際にこの差はより顕著になる。また、赤血球は不透明であり、流れの中で赤血球の密度を増加させる撮像困難を引き起こす。可能な最小の粒子を使用する際に第チリら （1998）によって使用される蛍光トレーサー粒子が、ピンボケ粒子の影響を減少するためのツールとして提唱されている。レーザーと相まって微粒子直径1μmの蛍光を使用すると、マイクロ血流イメージング10のフォーカス問題の深さを減少させることができる1つのアプローチである。 μPIVテックの状態のいくつかの現在の口コミがあります血流研究11,12にμPIVの重要性を強調して各々がhnology。血μPIVを使用する際にいくつかの重要な点を考慮しなければならない。ミクロレベルでは、微小規模は、血液は、それがニュートン流体（プラズマ）に懸濁し可撓性赤血球（RBC）、大型の白血球、血小板および他のタンパク質の懸濁液であるように、均質な流体とみなすことはできない。
ここで測定された速度プロファイルは、マイクロ血流の特定の特性を測定するために使用することができる。 microhemorheologyの重要な因子は、血液の流量、速度プロファイルの形状は、容器の壁におけるせん断応力である。微小循環は、体内の栄養交換のためのサイトですので、この情報は、臨床的意義を持っており、この交換は、せん断に依存します。微小循環の研究の状態に関するいくつかの現在のレビュー研究は、同様に13あります14,15。
ここで紹介するポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロチャネル内の血流のμPIV測定するためのプロトコルです。 PDMSチャネルはプロトコルのセクション1でソースに続く自社で作製した。ブタの血液サンプルが認定屠殺場から得られ、プロトコルのセクション2続いて洗浄した。プロトコルのセクション3に記載されているようにすべてのデータが、LaVision MITASμPIVシステムを用いて得た。 YAGレーザー（ニューウェーブリサーチ、USA）、プログラマブルトリガユニット、3つの軸で移動ステージと相まって、蛍光顕微鏡、およびコンピュータによって制御CCDカメラ（画像インテンス、Lavision）：セットアップのNdで構成されています高速度カメラ（ダルサ1M150、オランダ）に加えて、赤血球自体の可視化のために追加されました。両方のカメラを2ポートファイバーボックス（ツァイスによってカスタム、ドイツ）に接続されている。血流のin vivo測定における典型的には、正立顕微鏡で赤血球を追跡するために使用されますmselves、 インビトロ用途において典型的に倒立顕微鏡は、トレーサー粒子を追跡するために使用されている。セットアップこの独自のデュアルでは、光学箱は、両方のトレーサーは倒立顕微鏡を用いて画像化することができます。血液は高精度シリンジポンプ（Nexus3000、Chemyx社、USA）を介してマイクロチップに導入した。システムの図が、図の上部は、PDMSから製造さ40μmの矩形チャネルで140ミクロンを表す図1に示されており、底部には、両方のカメラ、レーザ、シリンジポンプとを含むシステム全体を表す顕微鏡。
通常、独自のソフトウェアで利用可能な現在のμPIVセットアップ、TSI、Dantecダイナミクス、およびLaVisionが含まれています。標準の相互相関アルゴリズムはMATLABを含む多数のソフトウェアオプション、によって達成することができる。ソフトウェアはキーではありません、ダイアログボックスが数学的に対応しているかを理解することは利用サービスを提供しますrははるかに良い。このプロトコルデイビス、LaVision独自のソフトウェアやMATLABが利用される。プロトコルは、特定のソフトウェアではありませんが、メニューオプションが異なるソフトウェアパッケージで異なる場所にあるかもしれない。
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Protocol
1。マイクロチップの作製
最初のステップは、マイクロチャネルを作成したり、購入することです。マイクロチップ材料のための多くのオプションがあります。
選択された最も一般的な材料の一つは、ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）である。ソフトリソグラフィ16,17,18を通じてPDMS製作のための方向性に関する多くの出版物があります。
PDMSチャネルが作製されると、その自然の疎水性を逆に利用可能ないくつかの表面処理がある。酸素プラズマ処理は、一般的な選択肢である。
周、エリス、そしてフェルカー（2009）表面処理の評価を与えると、彼らはPDMSにどのような影響を与えるか。これらの結果は、しかしながら、水用であり、血液は異なる特性を有する。その表面処理は、血液のために何を意味するのかについての研究は、ピッツらによって行われています（2012A）。
ここに示された結果については、マイクロチップの表面とガラスが彼らがいたスライド45秒間酸素プラズマに曝されると、その後しっかりと永久結合の結果一緒に押されたの両方に接着。
2。血の準備
- 認定施設から血液サンプルを収集します。たとえばブタ血液は抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸（EDTA）と共に使用することができる。水4mlで1グラムのEDTAを追加し、軽く10倍の混合、全血の1 Lにソリューションを追加。
血液サンプルを拾ったときに、彼らはRTにゆっくりと冷却することができます。血液サンプルは、新鮮で、理想的に、それらが血液のレオロジー特性を節約するために収集された日に使用してください。
サンプルは室温で一度冷蔵してもよいが抗凝固剤なしの全血は、冷凍した後に使用できなくなります。抗凝固剤に応じて、最高42日間のために赤血球は冷蔵保管することができ、全血を35日間冷蔵保管することができますが、汚染が非Mで可能でしょうedical施設21。
また、ウシやブタのサンプルと収集方法に注意して、骨髄による汚染を避ける。
- 10分毎に時間のために3,000 rpmで3倍の血液サンプルを遠心分離。最初の遠心分離後、破棄し、血漿およびバフィーコートを除去する。これは、第1のプラズマを除去するために、一般的に最も簡単です、その後単独のバフィーコートを除去するために、その後、破棄するか、将来の使用のために保管してください。
血液中に戻ってバフィーコートを混在させないように、ゆっくりとピペットをご紹介します。バフィーコートを除去した後、リン酸塩の約20 mlを加える緩衝生理食塩水（PBS）と、軽く遠心しを混ぜる。最後のステップを繰り返します。第三の遠心分離後、破棄し、PBS、残りのバフィーコートを除去する。
それは、血液の凝集性を維持したい場合は、代わりにPBSのネイティブプラズマを使用することも可能である。任意のバフィーコートや白を混ぜて使用しないようにしてください血漿中へ血液細胞。
- 清浄化赤血球（RBCの）を取り、（ヘマトクリット値）を所望の濃度でPBS又は血漿中に懸濁する。遠心（CritSpin FisherSci、USA）とヘマトクリットを確認してください。
10から20までパーセントヘマトクリットにおける血液は40または50％（生理ヘマトクリット値）よりも可視化することが容易でなければなりません。微小循環では、血液は一般的にマクロ循環の半分ヘマトクリットなので、H = 20は15で十分です。
- 血液サンプルに所望の濃度で蛍光トレーサー粒子を追加します。一般的なルールは、事前に算出することができる相関窓内の粒子10を有することである。
例えば、粒子の30μlをビデオに示されるセットアップのための血液溶液1mlを添加する。また、赤血球自体は蛍光標識することができます。
- さらに、水やインフルエンザに校正液を作る粒子をorescing。これは、ニュートン溶液にシステムを較正する必要がある。
例えば、100ミクロンのスケールでチャネルに10X対物レンズを使用する場合は、適当な濃度は、蒸留水15mlと混合した粒子を300μlである。別のオプションは、血液粘度のマクロに近い3CPの粘度に蒸留水で希釈した、グリセロールを使用することである。
3。 μPIV測定
- レーザーの安全性：温度と湿度をチェックしてください。適切なレーザー安全メガネを着用してください。レーザーのカーテンを閉めたり、研究室のドアさらされてから保護されていない人々を防ぐために上にレーザーのサインオンにします。
- デイビスソフトウェアと手順は、ビデオに示されています。詳細については、特定のシステムのユーザーマニュアルを参照してください。
- データを取得する前に、カメラは、マイクロメータースケールを使用して較正される必要がある。
- システムの適合性を低減するために、チューブの最短時間を使用dのような15または50μlのハミルトンガスタイトシリンジできるだけ最小剛性シリンジ。システム内に血液や吸気の漏れを減らすために、シリンジに、チップにチューブを密封。これは、接着剤、PDMSまたはワセリン（血液を汚染しないように注意しながら）で行うことができます。
マイクロシリンジの容量は通常埋めるために音量よりもはるかに小さいため、トレーサ粒子を混入水でマイクロシリンジを埋めるためには逆流メソッドを使用します。
我々の逆流法は、二次プラスチックシリンジを用いて、チャンネルの出力を介して一緒にマイクロシリンジと流路を埋めるために構成されている。すべてのマイクロバブルは、マイクロシリンジ、チューブや外になるまでそのためには、最初のマイクロシリンジのプランジャを取り外し、次にチャンネルの出口に接続されている古典的なプラスチック製の注射器を用いて液体を押し、マイクロシリンジからの液体の流れを聞かせてチップは、最終的にプランジャーバックを入れて、プラスチックの注射器を抜いてください。プレゼンスOマイクロバブルのR不在を顕微鏡で確認することができます。
- 水平配管を達成するために、シリンジポンプを平準。所望の流量にシリンジポンプをプログラム。
剛性のシステムや実際の流量を変更し、システムの適合性のための "ボトルネック効果"、などの可能性一時的な効果、注意してください。システムの特性時間は、システムの材料及び寸法の関数として推定することができる。 （第2集、pp 77-81、Tabeling、2005）
- 顕微鏡ステージ上でマイクロチップを置き、ポンプを起動します。真ん中の速度プロファイルにシステムを校正し（パルス画像間の時間）dTはを校正するために粒子と水を使用してください。
粒子は良好な相関関係11フレーム間の5〜10ピクセルを移動する必要があります。キャリブレーションすると、チャネルの途中で測定するように注意してください。中間の焦点面は、最高を有する速度8。
ラウンドチャネルを使用している場合、影響をシャドウイングのように注意してください。
サンプル画像は、上面映像が最初のパルスであり、ボトム画像秒パルスであるのに対し、パルスカメラを用いて、 図2に示されている。これは、最も明るい点が（蛍光粒子）合焦で最もであることを図から分かる。
- オプション：異なる高さでデータを取ることによって3次元速度プロファイルを単一の画像に異なるベクターを加えることによって再構成することができる。ビデオは、プロセスの自動化のために開発されたルーチンを提示します。
- 血でデータを取得する場合は、水と同じ方法で、血液の所望量で注射器を埋める。所望の流量にシリンジポンプをプログラムして、目的のデータを取る。得られた原画像の例を図2に示されている。同様に赤血球沈降に注意してください。シリンジを補充すべての実行または毎他のランは、RBCの沈降が削減されます。
- 画像を取得した後、相互相関は、画像間の速度ベクトル場を取得する画像対で行われる。それは良好な相関を持つように良好な画像を有することが重要である。相関の前に、前処理がバックグラウンドノイズを除去するために行うことができる。
相互相関は、相関に影響を与え大きさ及び形状に変化させることができる、隣接する画像ウィンドウ間で行われる。相互相関後、画像後処理は、誤ったベクターまたは外れ値を除去するために行うことができる。
別の使用可能なオプションとその精度の詳細な説明はピッツらで見つけることができます（2012B）、血のため最善の処理はウィンドウの長さが拡張され、流れに合わせて"重複画像"の方法であることが判明した場合に。これらの操作は、MATLABのような、またはあなたのシステムとソフトウェアパッケージ内のプログラムに手動で行うことができます。ザソフトウェアは重要ではありませんが、操作の背後に数学がより重要であり、各操作は、最終的な速度プロファイルの精度に影響を与えることができる。
得られたベクターは、瞬間速度プロファイルを得るために、チャネル間に領域で平均化した後、平均値、代表的な速度プロファイルを得るために、時間内に再度平均化することができる。 Kloosterman ら （2011）被写界深度が大きいμPIV測定における誤差の説明を与える。ここで提示されたデータ処理の誤りに関する議論は、高速測定のためのパルス測定とChayer ら （2012）のためにピッツら （2012B）で見つけることができます。
速度プロファイルの例は、 図3及び図4に示されている。 図3は、140μm幅のチャネルでH = 10でRBCを10μl/時の流れの中心に単一の速度プロファイルを示している。
テント ">この単一のプロファイルは速度プロファイルを得るために、チャネル両端の相関ベクトルを平均化することによって達成され、次いで、代表測定値を得るために時間内に平均化される。この場合、09031は、視野を横切って、即座に平均した。30μlの/ hrでプログラムされた流量と100μmの正方形チャネル内の水のキャリブレーションフローのために取ら3D再構成プロファイルの一例を図4に見られる。 図4において、プロファイルが1μmの間隔で測定される。
- オプション：セットアップ示さ高速画像、スイッチングカメラ（およびデータ·アクイジション·システム）で同じ条件で撮影することができる。これにより、チャネル内の無細胞層を可視化するため、および凝集を定量化するために有用であり得る。データ解析は、（Chayer ら 、2012）とは若干異なります。
RBCアグリゲーションとない白色光像の例としては、presaの複数形であるH = 20で図5にnted。トップ画像を1μl/時間で、集計にRBCの能力を除去し、PBSでH = 20を示している。一番下の画像は、0.5μL/時でのネイティブプラズマ中のH = 20である。一番下の画像では、集約が表示されます。
- 測定が完了した場合には、安全な方法でシステムをシャットダウンします。レーザ電源が完全にシャットダウンされるまで、適切なレーザーの安全手順を使用します。
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Representative Results
全ての図面において、流れは、生画像と算出された速度プロファイルの上方で左から右です。ヘマトクリットH = 10を10μl/時で流れる血液とで得られた生データの一例を図2に示されている。生データは、速度プロファイルを達成するために任意のデータ処理なしでクロス相関させることができる。前処理およびデータ処理方法の影響はピッツら 、（2012B）によって議論されている。 hematorcrit Hで図2と同様のデータから得られた速度プロファイルの例は= 10、10μlの/時間の流量は、水キャリブレーションからの3Dプロファイルを図4に示し、 図3に示されている図3および図4は、標準的に含まデータ処理。これらの速度プロファイルは、チャネルの中心で最大速度、チャネル内の流速、および様々な流れ条件を壁でのせん断速度、チャネル共として測定を行うために使用することができnfigurations、及び生理学。 図5は、RBCの凝集の有無にかかわらず高速画像の例を示します。例えば、 図5のもののような高速画像も相互相関を用いた速度プロファイルを計算するために使用することができる。
図1。 （）左から右へ移動する流れにPDMSから製作40μmの長方形のチャネルで140程度を表しており、（b）は、システム全体を表します。μPIVセットアップのダイアグラム
図2。 10のプログラムされた流速でPBS中H = 10とμPIVシステムからの結果のRAWパルス画像データ（左から右へ流れる）HR /μL。トップ画像は最初のパルスである。
図3。 10μlの/ hrでプログラムされた流速でPBSでH = 10とμPIVシステムからの速度プロフィールを生じる。プロファイルは、上向きの流れを示すために回転させる。
図4。 1μmの解体、複数のプロファイルと100μmの正方形のチャネルにおける水校正の再構築された3次元速度分布の例。プロファイルは、上向きの流れを示すために回転させる。 クリックここで大きな図を表示します。
図5。高速画像どこにトップの例））H PBS中= 20を1μl/時（無アグリゲーション）と最下部には0.5μL/時（集合）でH =ネイティブ血漿中の20です。両方の画像で流れは左から右です。
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Discussion
微小スケールで血流測定のためμPIVを使用して、関連する、生物医学的、機械的及び化学工学プロセス多数の洞察を与えることができる。を考慮するために重要な要因のいくつかは、RBC自身、蛍光微粒子のRBC、凝集や運動の集約や変形、およびチャネルにおけるRBCの沈降の密度である。上にレイアウトされ、一般的なガイドラインに従っている場合は、これらのすべては、会計処理することができます。このシステムを使用して良い測定に心に留めておくべき基本的なチェックリストがあります。まず、コンプライアンス体制や提案システムでどの程度であるかを決定。コンプライアンスを最小限に抑えることが可能チューブの最短時間と可能な最小の注射器を使用しています。剛性のシステムはあまりコンプライアンスを持っていますが、ボトルネックが発生する可能性があります。測定の小規模にもかかわらず、重力はRBCに影響を与えます。同じ高さに注射器、チューブとチャネルを維持する私の理想。第二に、懸濁液の濃度を決定する。十分にある溶液中のトレーサ粒子を蛍光とRBCの濃度が高すぎていないことを確認。試料のトレーサー粒子の密度を増加させることRBCの固有の不透明度を克服することはありません。トレーサー粒子の量は相関関係に影響を与えるが、あまりにも多くの赤血球を有する画像に不透明な流体及びトレーサ粒子が難しくなる。サンプル全体のヘマトクリットは、チャネルの中央面が明確に画像化することができることを十分に低く抑える必要がある。これはヘマトクリットとチャネルサイズの間のトレードオフである。増加した深さで、レンズと測定面との間にRBCの量が低くてもhematorcritで、成長します。 RBCの不透明な内部はRBCの一部（ゴールドスミスとSkalak、1975）に対して透明な液体で置き換えられるのに対し、より高い画像hematorcritサンプル以上のチャンネルするために、 "ゴースト細胞"の方法を利用することができる。第三に、そのmicrosco確保PEは、チャネルの中央面に注力しています。チャンネルの正確な高さを知ることは、中央面を見つけることが重要です。心の中の粒子の大きさと、チャネルのサイズを維持し、あなたのシステムの相関（DOC）（Wereley ら 、1998）の深さを計算する。 DOCが大きく中間面を見つけることに達成するのに必要な精度に影響を与えることができる。 1ミクロン差精度に悪影響を及ぼす可能性があります。一旦粒子の量は、チャネルのサイズ、およびDOCが発見され、パルス状の画像（DT）との間の時間の差が決定する必要がある。ウィンドウ間の粒子の移動の5〜10ピクセルを確保する。粒子の移動は、セクション3.9に概説された相関ウィンドウに収まらなければなりません。最終的に、前処理、処理やベクタデータの後処理方法を決定。多くの方法が文献に利用可能ですが、血に適用されたときにいくつかは他よりも成功している。 "重複画像"の方法は、ADVです。血流（ピッツら 、2012B）のためised。
心に留めておくべきもう一つの要因は十分に微小血行動態に記載されて "無細胞"層である。これは、チャネルまたは血管壁における赤血球の欠如である。蛍光トレーサー粒子を次のように、ユーザは、実際には、プラズマの移動に追従される。チャネルまたは容器の中心で、速度が最大であり、両方とも同じ速度で移動することができる。現在、いくつかまたは全く赤血球があるでしょうしながら壁に、プラズマはまだ動きがあります。 10倍の倍率で、ここで提示さスケールでは、無細胞層が測定可能ではありませんが、高い倍率では考慮する必要があります。高速ビデオは、無細胞層の厚さの測定を可能にする。
結論
μPIVは、その現像した直後以降血液レオロジーおよび生物医学研究に使用されている。ときスケールで血流に適用微小循環のため、血液の複雑な挙動を考慮する必要があります。マイクロチャンネル内の血流のμPIV測定のためのプロトコルは、血液の複雑な性質に対処するためのヒントと一緒にここに提示された。複数の撮像画像のオプションは、パルス、高速画像と3Dオプションと同様に、データ処理情報を含む、概説した。血液マイクロ研究のためμPIVを使用して、速度プロファイルの形状の薬物、疾患および治療的処置の効果を分析することができる。栄養素と薬の摂取以来現代医学と工学に役立つこれらの測定は、せん断に依存しています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、テクニカルサポートにLaVision、社のリチャード·プレボ、プロトコルをテストするためのふくらはぎアブ·Mallouhとフレデリックファヒム、初期の実行で彼女の助けのための資金のためにNSERC（自然科学とカナダの技術評議会）、キャサリンPagiatikisに感謝したいと思い、とダルサ高速度カメラのローンのモントリオール大学のガイクルーティエ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| fluorescing micro particles | Microgenics/FisherSci | R900 | |
| glycerol (OPTIONAL) | Sigma Aldrich | G6279-500 ml | |
| microcentrifuge, i.e. CritSpin | FisherSci | 22-269-291 | |
| syringe, i.e. 50 μl Gastight | Hamilton | 80965 | |
| camera, i.e. Imager Intense, high speed | LaVision, Dalsa | Imager Intense | |
| microscope, i.e. MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| syringe pump, i.e. Nexus3000 | Chemyx, Inc. | Nexus-3000 | |
| flexible tubing, i.e. Tygon | FisherSci | 14-169-1A | |
| data processing software, i.e. DaVis | LaVision | DaVis | |
| centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F |
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