Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Summary

Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED) unterstützt die Analyse der intrazellulären Kalzium-Speicher der Dynamik von Fluoreszenz-Bildgebung. Das Verfahren stützt sich auf Targeting eines rekombinanten Carboxylesterase zum Endoplasmatischen Retikulum (ER), wo es verbessert die lokale Entlarvung von synthetischen niedriger Affinität Ca

Abstract

Visualisierung Kalziumdynamik ist wichtig, die Rolle von Calcium in der Zellphysiologie zu verstehen. Um Kalzium Dynamik zu untersuchen, wurden synthetische fluoreszierenden Ca ^{2 +} Indikatoren populär geworden. Hier zeigen wir, TED (= gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Laden), eine Methode, um die Freisetzung von Ca ^{2 +} zu verbessern Indikatorfarbstoffe in das ER-Lumen verschiedener Zelltypen. Bisher wurde in TED-Zelllinien, Gliazellen und Neuronen in vitro verwendet. TED basiert auf effizienten, rekombinanten Targeting von einer hohen Aktivität Carboxylesterase dem ER-Lumen mit Vektor-Konstrukte, die ausdrückliche Carboxylesterasen (CES). Die neuesten TED Vektoren enthalten ein Kernelement CES2 fusioniert an ein rot fluoreszierendes Protein, wodurch gleichzeitige zweifarbige Bildgebung. Die Dynamik des freien Calcium in der ER sind in einer Farbe abgebildet, während die entsprechende ER Struktur erscheint in rot. Zu Beginn des Verfahrens werden die Zellen mit einem Lentivirus transduziert. Anschließend werden die infizierten Zellen einere auf Deckgläsern ausgesät, um endlich ermöglichen Live Cell Imaging. Dann lebenden Zellen werden mit dem Acetoxymethylester (AM-Ester) Form niedriger Affinität Ca ^{2 +} inkubiert Indikatoren, zum Beispiel Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, oder Mag-Fura2-AM. Die Esterase-Aktivität im ER spaltet hydrophoben Seitenketten vom AM Form des Ca ^{2 +-Indikator} und einem hydrophilen fluoreszierenden Farbstoff / Ca ^{2 +-Komplex} gebildet wird, und eingeschlossen in das ER-Lumen. Nach Farbstoffbeladung, werden die Zellen mit einem invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop analysiert. Die Zellen werden kontinuierlich mit Ringer-ähnliche Lösungen perfundiert und die ER Calcium Dynamik direkt visualisiert Zeitraffer-Bildgebung. Calcium-Freisetzung aus dem ER wird durch eine Abnahme der Fluoreszenz-Intensität in Regionen von Interesse identifiziert, während das Nachfüllen der ER Calcium Speicher erzeugt eine Zunahme der Fluoreszenzintensität. Schließlich wird die Änderung in der Fluoreszenzintensität über die Zeit durch Berechnung der AF / F ₀ bestimmt.

Introduction

Um physiologischen Calcium Reaktionen des ER zu beheben, haben wir eine neue Strategie, um das Einfangen von synthetischen Calcium sensitiven Farbstoffen in die Notaufnahme zu verbessern. Das Verfahren ermöglicht die direkte, nicht-störende Echtzeit-Überwachung des freien ER Calcium in Gegenwart von extrazellulärem Calcium.

Funktion und Signalisierung von ER Calcium

Calcium-Signale werden in verschiedenen Zelltypen, zB Muskelzellen, Neuronen und Gliazellen und ihre Funktionen reichen von der Vermittlung Muskelkontraktion zu einer Beteiligung an der synaptischen Übertragung in Lernen und Gedächtnis ^1,2 gefunden. Änderungen im freien Calcium-Konzentration sind von hohem wissenschaftlichen Interesse, da Calcium in der Regulation der Gen-Transkription, Proliferation, neuronale Erregbarkeit, Zelltod und anderen Zelle Signalwege ^1-7 beteiligt ist. All diese zellulären Calcium-Signale sind funktional verbunden sind und dazu beitragen, Calcium intrazellulärestore Dynamik ^8-10.

Ein gemeinsames Merkmal aller Calcium-Signale ist der Fluss von Kalzium zwischen dem extrazellulären Raum, die Cytosol und Organellen, vor allem die ER und Mitochondrien. Dies bewirkt dynamische Änderungen der Calciumkonzentration innerhalb dieser Organellen, die von verschiedenen Signalkomponenten erfasst werden. Im Allgemeinen ist die Calcium-Konzentration in der ER zwischen 100 bis 800 um, in das Cytosol der Calcium-Konzentration in der Nähe von 100 nm und in den extrazellulären Raum die Konzentration etwa 1-2 mM. Dementsprechend gibt es eine hohe chemische Antriebskraft für Calcium Strömung zum Cytosol ^2,9,10.

Die am häufigsten untersuchten ER abgeleiteten Calcium Signale abhängig von der Stimulation der G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), die dann aktiviert Phospholipase C (PLC). PLC erzeugt wiederum Inositol 1,4,5-triphosphat (IP ₃₎ ^1. Bei der Bindung von IP ₃ seiner receptor (IP _3-Rec, Abbildung 1) in der ER-Membran, werden Kalzium-Ionen aus dem ER-Lumen freigesetzt. Historisch gesehen, war IP _{3-vermittelte} Calcium-Freisetzung aus dem ER ersten - obwohl indirekt - gemessen in acinar Zellen der Bauchspeicheldrüse durch Streb et al 1983 ^11.. Diese Veröffentlichung vorgeschlagen erstmals eine Signalkaskade mit Acetylcholin, Phospholipase C und IP _3. Diese Art der Calcium-Freisetzung wird allgemein als IP _{3-induzierten} Calcium-Freisetzung (IICR) (Abbildung 1). Kinase-abhängige Aktivierung von Phospholipase C &ggr; durch Rezeptor-Tyrosinkinasen Verbindungen die Wirkung von Wachstumsfaktoren und neurotrophe Faktoren ER Calciumsignaltransduktion nach IP ₃ Erhebung ^12. Neben IICR kann Calciumerhöhung durch ionotropen Calcium Eintrag vermittelt werden, zum Beispiel über spannungsabhängigen Calcium-Kanäle (Ca _V) und anschließender Calcium-induzierten Calcium-Freisetzung (IKRK) von ryanodine reRezeptoren (RyR). IICR und CICR sind physiologisch Calcium-Shop-Eintrag (SOCE) verknüpft. SOCE umfasst die Wirkung von STIM (Stroma interagierende Molekül), die ein Sensor für ER Calcium-Freisetzung ist. STIM hat sich gezeigt, extrazellulären Calcium Eintrag durch transient receptor potential-Kanäle (Trp) ^13, Orai Kalziumkanäle ¹⁴ und sogar spannungsabhängigen Calcium-Kanäle ¹⁵ (Abbildung 1) zu stimulieren. Loss of ER Calcium wird dynamisch durch die Wirkung der sarco-endoplasmatischen Retikulum Calcium ATPase (SERCA), die aktiv Pumpen Calcium in die ER gerettet. Das Blockieren der SERCA mit Medikamenten wie thapsigargin enthüllt einen kontinuierlichen Verlust von Kalzium ER zum Zytosol. Das ER Calcium "Leck" wird durch ER intramembrane Porenkomplexe wie Sec61 Protein-Komplex ^16,17 (Abbildung 1) verursacht.

In 1998 veröffentlichte Berridge ein Modell, das "Neuron innerhalb eines Neurons model", which schlägt ein Prinzip physiologische Rolle des ER bei der Integration von neuronalen ^Calcium-5. Dieses Modell berücksichtigt die Existenz eines kontinuierlichen ER-Membran-System bildet eine intrazelluläre "Bild" des neuronalen Plasmamembran ^5. Diese binäre eukaryotischen Membran-System wurde behauptet, eine Grundvoraussetzung für zeitliche und räumliche Integration von schnellen und langsamen Calcium-Signale in Neuronen. Calcium-Signale auftreten, die entweder gleichzeitig oder anschließend in verschiedenen Stacheln oder Dendriten des gleichen Neurons zu der Zelle soma oder Kern über das ER, wo sie bis ^5,18 summiert verliehen. Dann kann ihre Summe haben Auswirkungen auf die Erregbarkeit des Neurons, die Regulierung der Gen-Transkription oder Integration von Signalkaskaden. Somit unterstützt die ER die Integration von Calcium-Signale. Eine Voraussetzung für dieses Konzept ist die Kontinuität des ER in einer einzigen Zelle, die durch mehrere Studien in Anspruch genommen wurde und das hat zumindest für somato-d erwiesenendritic Bereichen und kurze Strecke axonalen Projektionen ^19-21. Ob es ER Kontinuität innerhalb langen axonalen Projektionen ist eine Angelegenheit der Debatte.

Strategien, um den Fluss der freien Calcium über die ER-Membran zu messen

Calcium-Signale werden am häufigsten in das Cytosol ^22,23 überwacht. Es kann daher nicht leicht zu unterscheiden, ob ^{Ca2 +} in das Cytosol von extrazellulären oder intrazellulären Speichern ^6,24 fließenden werden. Um diese Beschränkung zu überwinden, wurden methodische Strategien zur direkten ER Calcium Imaging entwickelt. Zusammenfassend sind die folgenden Strategien: (1) ER-Protein gezielt gentechnisch-Indikatoren ^25-27 Protein-basierten Low-Affinität Ca ^{2 +-Indikatoren} verwenden die Biolumineszenz Protein GFP Äquorin oder in Kombination mit einem Calcium-sensitiven Proteins.. Diese gentechnisch veränderten Ca ^{2 +-Indikatoren} (GeCIS) kannder ER mit Hilfe eines Signalpeptids ausgerichtet sein und sich aktiv an der ER mit einem Aufbewahren und Abrufen Motiv gehalten. Gemeinsame ER Ca ^{2 +-Indikatoren} basieren auf der Cameleon-Prinzip und sind die Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon Split YC7.3ER ²⁹ und ³⁰ Cameleon D1. (2) Direkter Esterase-basierte Farbstoff Laden von AM-Ester niedriger Affinität Ca ^{2 +} Indikatoren ^31,32. AM-Derivate der Indikatorfarbstoffe (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM oder Fluo5N-AM) gehen die biologischen Membranen in einem lipophilen, Calcium-und Kleinschreibung Zustand. Dann wird in das Cytosol und im ER freizugeben endogene Esterasen gespalten des AM-Estergruppe und die Ca ^{2 +-Indikator,} hinterlässt eine bestimmte Menge des aktiven Farbstoff im Cytosol und im ER. Daher ist dieser Ansatz unter den Bedingungen einer hohen Calcium-Konzentration in der ER nützlich, solange der cytosolischen Calciumkonzentration bleibt weit unter dem deNachweisgrenze der niedriger Affinität Indikatoren, insbesondere während der charakteristischen Calcium-Signale (zB nM bis niedrig uM). (3) AM-Ester Belastung in Kombination mit Plasmamembran Permeabilisierung ^32. Ein verbleibender zytosolischen Ca ^{2 +-Indikator} durch Plasmamembran Permeabilisierung mit geringen Mengen eines "mild" Reinigungsmittel (z. B. Saponin) in einem künstlichen intrazelluläre Puffer entfernt. Somit können die intrazellulären Membranen angeregt werden, zB mit IP ₃ in der intrazellulären Puffer direkt durch "Poren" in der Plasmamembran. (4) Dialyse des Cytosol unter Whole-Cell-Konfiguration und gleichzeitige Messungen von Ca ^{2 +} in das ER-Lumen und das Cytosol ^32,33. Zelle zuerst mit einer niedrigen Affinität Ca ^{2 +-Indikator} (zB Mag-Fura2 geladen AM, ratiometrischen, UV-Licht). Danach mit Hilfe eines Patch-Pipette, verbleibende cytosolic niedriger Affinität Ca ^{2 +-Indikator} aus dem Cytosol mit einem Puffer, der eine hohe Affinität Ca ^{2 +-Indikator} (zB Fluo-3, sichtbares Licht) dialysiert. Diese Strategie ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von zytosolischen und ER abgeleiteten Signale. (5) Gezielte-Esterase-induzierte Farbstoffbeladung ^8,34. A Carboxylesterase (CES) mit dem Lumen des ER gezielte und bietet eine hohe Esterase-Aktivität für eine effiziente Abfangen des AM-Ester Form niedriger Affinität Ca ^{2 +-Indikatoren.}

Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED)

Zur Verbesserung der Ausrichtung der niedriger Affinität Ca ^{2 +} Indikatoren zur ER-Lumen, wurde TED entwickelt. TED erfordert die Überexpression eines ER gezielte Maus Carboxylesterase (CES2) (Abbildung 2), die über Expressionskonstrukte erreicht wird. Zellen, die ein rekombinantes CES-Konstrukt mit dem AM-Ester Form eines Calcium inkubiertIndikator-Farbstoff (Fluo5N-AM, Abbildung 2). Dann wird in dem ER wird der Farbstoff auf die Ca ^{2 +} umgewandeltes empfindlich, undurchlässigen Membran Ca ^{2 +-Indikator-Komplex} (Fluo5N/Ca ^{2 +)} durch die hohe Esterase daher Einfangen der Farbstoff in einer hohen Konzentration in der ER-Lumen ^{8 , 34.} Die Methode ist besonders nützlich, um ER Calcium-Freisetzung über die IICR-Bahnen zum Beispiel untersuchen, über metabotropic, purinergen-oder Glutamat-Rezeptoren ^8,34 und ER Calciumentzug visualisieren über "Leck-Kanäle" direkt, zum Beispiel nach Blockade der SERCA ^{17 , 34.} Um unsere Erfahrungen die Low-Affinität Ca ^{2 +-Indikator} Fluo5N-AM ist derzeit die beste verfügbare Indikator mit dem TED Farbstoffbeladung Strategie zu verwenden. Fluo5N-AM hat eine geringe Affinität für Ca ^{2 +} (Dissoziationskonstante K _D ~ 90 pM, Abbildung 2), ist fast nicht fluoreszierenden in seine AM-Form, sondern bietet eine hohe Fluoreszenzemission auf Calcium Bindung ^8,34. Die Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplex} mit einer Standard-Lichtquelle von ~ 490 nm, die über die normalen Farbstoffen wie FITC, Alexa 488 oder eGFP entspricht angeregt werden. Cytosolic Calcium-Signale kaum erreichen eine Konzentration in den niedrigen pM-Bereich und werden daher kaum von Fluo5N im Cytosol ³⁵ erkannt.

Um die TED Leistung zu verbessern, wurden mehrere rekombinanten Vektor-Konstrukte entwickelt (Abbildung 3). Ursprünglich ist TED Vektoren auf der kodierenden Sequenz des CES2 (Refseq Zugangsnummer NM_145603, CES2c) und am besten TED Leistung bezogen mit stabilen Expression CES Konstrukte beobachtet. New TED Vektoren exprimieren ein Kernelement CES2 fusioniert mit dem roten fluoreszierenden Proteins TagRFP-T2 ^36. Diese Vektoren haben den Vorteil, dass sie verwendet werden, um zu identifizieren transduzierten Zellen und die rote Fluoreszenz als interne Kontrolle für die Normalisierung der Veränderungen in Fluo5N/Ca ² verwenden werden ⁺ Fluoreszenz. Die rote Fluoreszenz bietet auch die Möglichkeit, die strukturellen Verteilung der ER und ER Änderungen in Dynamik unter Stimulationsbedingungen visualisieren.

Protocol

Dieses Protokoll stellt TED angewendet, um Zelllinien, Neuronen im Hippocampus und kortikalen Gliazellen. TED Leistung ist am besten, wenn TED Vektoren sind stabil exprimiert, zum Beispiel durch lentivirale Vektoren. Ein schematischer Überblick über die TED Verfahren ist in Abbildung 4 dargestellt.

1. Herstellung von Lösungen

Die folgenden Lösungen werden vor Beginn hergestellt und gelagert werden können, wie angegeben. Wir verwenden in der Regel sterilisiert Glas und Kunststoff und autoklaviert Wasser.

1. Bereiten HEPES-Ringer (in mm): 125 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 2 CaCl _2, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O.. Calcium-freien HEPES-Ringer besteht aus (in mM): 127 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O und 0,1 EGTA.. Ohne Glukose diese Imaging-Lösungen können bE bei 4 ° C. Die erforderliche Menge an D-Glucose vor Gebrauch frisch zugesetzt.
2. Für TED Analyse in Neuronen im Hippocampus, wird künstliche Liquor (ACSF) empfohlen. ACSF aus (in mM) aus: 127 NaCl, 23 NaHCO _{3, 3} KCl, 2,5 NaHPO ₄ H ₂ O, 25 D-glucose.H ₂ O, 2 CaCl _{2, 2} MgCl ₂ 0,7 H ₂ 0 in ddH. ₂ 0.
3. Bereiten Fluo5N-Uhr zu einer Konzentration von 5 mM. Um Solubilisierung hinzuzufügen 8,9 ul 20% Pluronic F-127 (in DMSO bei Raumtemperatur gelagert, geschützt vor Feuchtigkeit und Licht) bis 50 ug lyophilisierten Fluo5N-AM. Dann lösen Fluo5N-AM mittels eines Wasser-Ultraschallbad für mindestens 2 min. Shop Aliquots à 0,5 ul bei -20 ° C, vor Licht und Feuchtigkeit geschützt.
4. Bereiten Antagonisten und Agonisten Bestände nach Bedarf. Zum Beispiel: a) 10 mM ATP oder ADP (in H ₂ O, metabotropic Aktivierung von Adenosin-Rezeptoren), b) 10 mM Carbachol in H ₂ O (Agonistvon muskarinischen Acetylcholin-Rezeptor), c) 30 mM Cyclopiazonsäure (CPA) in DMSO (Blocker des SERCA), d) 50 mM DHPG in PBS (metabotropen Glutamat-Rezeptor-Agonisten für mGluR _I mGluR und _5), e) 10 mM in H Glutamate ₂ O, f) 1 mM Ionomycin in DMSO (Ionophor), g) 5 mM thapsigargin in DMSO (hochaffine Blocker des SERCA). Shop Aliquots bei -20 ° C.
5. Lentivirale Vektoren: Dieses Protokoll schließt die Verwendung von lentiviralen TED Expressionsvektor Teilchen. Ihre Herstellung und Lagerung ist nicht Bestandteil dieses Protokolls. Wir verwenden lentiviralen Vektoren der zweiten Generation für die Übertragung von rekombinanten Carboxylesterasen Zelllinien, Gliazellen und Neuronen. Unsere lentiviralen System basiert auf dem Expressionsvektor FUGW ^37, und die Verpackung Plasmide pCMVΔR8.91 oder psPAX2 und Pseudotypisierung Plasmid pMD2.G ^38,39. ACHTUNG: Bedenken Sie, dass die Arbeit mit rekombinanten selbst inaktivierenden lentiviralen Vektoren erfordert die sorgfältigeBerücksichtigung der Biosicherheit Richtlinien. In vielen Ländern sind diese Vektoren als Biohazard Risikogruppe 2 eingestuft. Weitere Informationen finden Sie in http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Vorbereitung und Viral Infection of Mouse Hippocampusneuronen

1. Waschen Deckgläschen in einem Glas Petrischale von 20 cm Durchmesser (100 Deckgläser pro Schale) 1x in 70% Ethanol für ca. 30 min. Schließlich, fügen Sie 100% Ethanol (pa) für 2 min. Rückstände von Ethanol und trocknen Sie die Deckgläser unter einer sterilen Haube.
2. Bereiten Sie zwei verschiedene Arten von Medien für Hippocampus Kulturen: (a) Neurobasalmedium mit B27 1.50 (b) volle Medium: Neurobasalmedium mit B27 1:50 Glutamax 1:100, 1:100 und N2 Ergänzung. Sterile Filtrat der Medien und speichern sie in der Zelle Inkubator bis zur Verwendung.
3. Einen Tag vor der Präparation werden die Deckgläser, indem zunächst eine sterile 10 mm Deckglas in jeder hergestelltenund einer 4-Well-Zellkulturschale. Danach speichern sorgfältig Mantel jedes Deckglas mit 80-100 ul 0,1% Poly-L-Lysin und die Gerichte in einem Inkubator über Nacht.
4. Am Tag der Präparation und Zellkultur, mit dem Waschen der Deckgläschen dreimal mit 100 ul HBSS beginnen und dann 100 ul Neurobasalmedium jedem Deckglas. Die Schalen werden in einem Inkubator für Gleichgewicht (z. B. bei der Präparation von Mäusen).

Dissection

Wir führen unsere Experimente mit Mäusen in Übereinstimmung mit Richtlinien der Europäischen Union, von unseren institutionellen Tierpflege und Nutzung Ausschuss genehmigt.

5. Entfernen Sie das gesamte Gehirn und sezieren die hippocampi bilateral.
6. Entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhaut und anderem Gewebe als der Hippocampus und Ort einer Hippocampus jeweils in ein 1,5 ml Röhrchen mit 450 ul HBSS. Bewahren Sie das Gewebe auf Eis, bis eine ausreichende Anzahl von hippocampi isoliert worden ist.

<p class = "jove_step"> Zellkultur

7. In 50 ul 1% Trypsin (Worthington) zu jedem Röhrchen und Inkubation sie in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Schütteln Sie die Rohre gelegentlich. Um die Verdauung Reaktion zu stoppen, fügen Sie 50 ul 1% Trypsin-Inhibitor in jedes Röhrchen und das Röhrchen mehrmals.
8. Übertragen Sie alle Gewebe von bis zu 5 hippocampi einem 15 ml Falcon-Röhrchen Vermeidung der Übertragung von Flüssigkeit. In B27-Medium (a) bis zu einem Endvolumen von 5 ml.
9. Man reibt das Gewebe mit einem Feuer polierten Pasteur Glaspipette durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. VORSICHT: Vermeiden Sie Luftblasen!
10. Spin mit 400 xg für 3 min, absaugen Überstand und Zellpellet in 5 ml B27-Medium (a).
11. Man reibt das Gewebe wieder mit der Glaspipette, und dann zweimal mit Hilfe eines 1.000 ul Kunststoff-Filter Spitze. Führen Sie diese wie in den Schritten 2.9 und 2.10 beschrieben.
12. Nach der letzten Zentrifugation Zellpellet in 2 ml volle medium (b) und verreiben Zellen mit einer 200 ul Kunststoff-Filter Spitze. Um restlichen Zellklumpen aus dem Single-Zell-Suspension zu trennen, lassen Zellklumpen niederlassen für 1-2 min.
13. Zählen von Zellen und die Berechnung der Gesamtzahl von Zellen, die für die virale Infektion benötigt. Für TED Bildgebung nutzen 25.000 Zellen pro 10 mm Deckglas.
14. Überzug zusätzlich 25.000 nicht-transduzierten Zellen als Kontrolle wird an dieser Stelle empfohlen.

Viral Infection

15. Übertragen Sie die Zellsuspension für die virale Infektion in ein frisches 15 ml Falcon-Röhrchen und Zentrifuge für 3 min bei 400 x g.
16. Saugen Sie den Überstand und die Zellen in 300 ul Medium (b)
17. In eine entsprechende Menge an infektiösen lentiviralen Expressionsvektor TED Teilchen und lassen Sie die Falcon-Röhrchen bei Raumtemperatur stehen für 10 min.
18. Füllen Sie das Rohr mit Vollmedium (b) auf das Endvolumen für die Beschichtung (100 ul für jede 10 mm Deckglas) brauchte, Saugen Sie das Medium aus dem coverslip und sofort legen 100 ul Zellsuspension auf jedes Deckglas.
19. Die Schalen werden in den Brutschrank, bis alle Zellen nach unten (ca. 2 Std.) niedergelassen haben und sorgfältig füllen die Gerichte, bis sie 2 ml Medium (b) enthalten.
20. Lassen Neuronen für mindestens eine Woche wachsen. Ersetzen Sie 50% des Mediums jede Woche.

3. Kultur und Viral-Infektion der Maus kortikale Gliazellen

Vorbereitung

1. Beginnen Herstellung basalen Glia Medium (1:1-Gemisch aus DMEM/F12 mit 10% FCS, 5% HS, 1% Penicillin / Streptomycin, 0,45% Glucose) und Beschichten eines T75 Zellkulturflasche mit 4 ml 0,5 ng / ml Poly -DL-Ornithin Hydrobromid (PORN) (verdünnt in 150 mM Borsäure, pH 8,35). Nach Inkubation bei 37 ° C für 2 Stunden oder über Nacht, waschen Zellkulturkolben dreimal mit HBSS und fügen Sie 18 ml basalen Glia-Medium mit B27 01.50 und 10 ng / ml EGF. Equilibrieren die Zellkulturflasche im Brutschrank (bis zu 3 Std.).

<p class = "jove_step"> Dissection

1. Wir führen unsere Experimente mit Mäusen in Übereinstimmung mit Richtlinien der Europäischen Union, von unseren institutionellen Tierpflege und Nutzung Ausschuss genehmigt.
2. Präparieren Sie das Gehirn einer P5-P7 Maus und entfernen Sie den Hippocampus und Hirnhäute aus beiden Hemisphären wie in 2.5 beschrieben.
3. Präparieren Sie die frontalen Kortex, schneiden Sie sie in mehrere kleine Stücke und sammeln sie in einem 1,5 ml Röhrchen mit HBSS. Bewahren Sie die Röhrchen auf Eis und gehen zum Teil Zellkultur.

Zellkultur

4. Übertragen Sie alle Gewebe aus dem Rohr in ein 15 ml Falcon-Röhrchen mit einem Feuer polierte Glaspipette.
5. In Basalmediums auf ein Gesamtvolumen von 5 ml und verreiben das Gewebe durch Pipettieren mehrmals nach oben und unten mit einer feuerpolierten Glaspipette. Nach Zentrifugation bei 300 xg für 3 min, saugen Sie den mittleren und Zellpellet in 5 ml Basismedium.
6. Wiederholen Sie Schritt 3,5 zweimal.
7. Nach der third Zentrifugation Zellpellet in 2 ml Medium mit basalen Glia B27 (1:50) und 10 ng / ml EGF.
8. Titruate erneut und übertragen Sie die Zellsuspension auf die vorbereitete T75 Zellkulturflasche und lassen Zellen wachsen für 3-4 Tage.

Waschen von Gliazellen (nach 3-4 Tagen in Kultur):

9. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml PBS und energisch tippen oder leicht schlagen den Kolben ein paar Mal mit der Hand, und halten Sie ihn fest, in der anderen Hand. Durch diesen Schritt Zelltrümmer und Zellhaufen aus der Kultur entfernt.
10. Saugen Sie die PBS und fügen Sie frisches basalen Glia-Medium mit B27 (1:50) und 10 ng / ml EGF. Weitere pflegen die Kultur für 5-7 Tage, bis die Zellen 80% Konfluenz erreichen.

Splitting, Transduktion und letzte Aussaat von Gliazellen:

11. Coat 10 mm Deckgläschen mit 100 ul Poly-D-Lysin (Stammlösung: 0,1%, verdünnt 1/50 ad 20 ug / ml in PBS oder HBSS) und Inkubationsie in einem Inkubator über Nacht. Waschen Deckgläschen dreimal mit HBSS und 100 ul basalen Glia Medium. Equilibrieren Deckgläser in den Inkubator (3 h).
12. Waschen Sie die Gliazellen zweimal mit 10 ml PBS absaugen PBS und 3 ml Trypsin (TrypLE, unverwässert). Trypsinize Zellen für bis zu 1 min. VORSICHT: Vermeiden Sie zu Trypsinierung. Regel mehr als 80% der Zellen nach 1 min gelöst und das ausreichend ist, um mehrere Millionen von gesunden Zellen haben.
13. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 10 ml basalen Glia Medium, übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Falcon-Röhrchen, bei 300 g zentrifugiert für 3 min. Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in 5 ml Medium basalen Glia.
14. Wieder drehen und saugen Sie wie in Schritt 3.15 beschrieben, dann Zellen in 5 ml Medium basalen Glia.
15. Übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein 1,5-ml-Tube. 10 ^{4-2x10 4} Gliazellen sind ausreichend für ein 10 mm Deckglas. Normalerweise wird die Suspension volume, um Zellen für eine 4-Well-Schale ist weniger als 200 ul Transduktion. Dazu wird eine geeignete Menge des lentiviralen TED Expressionsvektor Partikel in die Zellen und inkubieren bei RT für 10 min. Dann füllen Sie das Fahrwerk mit basalen Glia Medium zur Aussaat Volumen (100 ul pro Deckglas).
16. Seed 100 ul von infizierten Zellen pro Deckglas und Inkubation für etwa 2 Stunden, dann fügen basalen Glia-Medium mit B27 01.50 und 10 ng / ml EGF zu einem endgültigen Volumen von 2 ml.
17. Für optimale Kulturbedingungen verwenden Zellen für Experimente an Tag 3-7 nach der Beschichtung.

4. Generierung und Kultur von Reporter-Zelllinie

TED Reporter-Zelllinien wurden auf der Grundlage von HeLa-, BHK21-, HEK293-und SH-SY5Y etabliert. Hier bieten wir Ihnen das Protokoll für HeLa-Zellen, aber das Protokoll kann an jeden anderen Zelllinie übertragen als gut.

Erzeugung stabiler HeLa-Zelllinie

1. Aufteilen einer Wildtyp HeLa-Zelllinie und Transfer 100.000 cEllen in einem Volumen von 200 ul einer 1,5-ml-Tube.
2. Dazu wird eine geeignete Menge des lentiviralen TED Expressionsvektor Teilchen auf das Rohr und die Platte die Zell-Virus-Suspension für 10 min bei RT. Dann Saatgut der Zellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml Medium (DMEM, 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin) in einer 30 mm Schale und Inkubation für 3 Tage.
3. Nach einmaligem Waschen mit PBS, Medium absaugen und fügen Sie 500 ul Trypsin (TrypLE, 2:3 in PBS). Inkubation für ca.. 3 min und dann stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 3 ml Medium. Übertragen Sie die Suspension in einem 15 ml Falcon-Röhrchen und Zentrifuge bei 400 xg für 3 min.
4. Zellpellet in 200 ul Medium wieder infizieren die Zellen mit lentiviralen Partikel wie in 4.2 beschrieben. Dann Samenzellen in einer T25 Zellkulturflasche in 10 ml Medium.
5. Wachsen Zellen bis zu einer Konfluenz von 60-80% erreicht ist. Dann teilen Sie die Kultur.

TED Reporter-Zelllinien

6. TED Reporter-Zelllinien werden beibehaltened in jedem Standard-Medium, zB DMEM, 5% oder 10% FCS und 1% Penicillin / Streptomycin verwendet wird.
7. Platte eine entsprechende Anzahl von Zellen in einer 4-Well-Platte mit steriler 10 mm-Deckgläschen (siehe oben), z. B. 10000 bis 20000 Zellen pro Deckglas.
8. Wachsen Zellen für mindestens zwei Tage vor ihrer Verwendung für TED Bildgebung.

5. Vorbereitung für die Live-Imaging Verfahren bei einem inversen Mikroskop

1. 1. Vorwärmen HEPES-Ringer auf Raumtemperatur und fügen D-Glucose.
   2. Regulieren Sie den ACSF (ohne Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +)} auf Raumtemperatur und fügen D-Glucose. Lüften Sie den ACSF mit Carbogen für 5 Minuten. Dann fügen Sie 1 M Stammlösungen von CaCl ₂ und MgCl _2, um Endkonzentrationen von je 2 mm.
2. Starten Sie die Live-Aufnahmen Mikroskope und alle Computerprogramme.
3. Starten Perfusion auf einem "Dummy"-Bildgebung Kammer und Gleichgewicht des Rohrsystems.
4. Regulieren Sie den Inline-Lösung Heizung und die Imaging-Kammer im Mikroskop Bühne. Befestigen Sie den Imaging-Kammer in einem Heizeinsatz.
5. Equilibrieren das System auf 32-37 ° C, bevor Sie den Ladevorgang starten Farbstoff. VORSICHT: Um ein versehentliches Fluss der Perfusion Lösung in die Mikroskop-System verwenden wir Haargummis um die Ziele und Elastomer-Silikon-Blatt (1mm), um die Mikroskoptisches schützen zu vermeiden.

6. Dye Loading entweder Zelltyp

1. Resuspendieren 1 Aliquot Fluo5N-AM (siehe 1.3) in 100 ul vorgewärmte Imaging-Lösung (HEPES-Ringer oder ACSF).
2. Löslich Fluo5N-Uhr in der Imaging-Lösung (HEPES-Ringer oder ACSF) in einem Wasser-Ultraschallbad für 90 sec.
3. Verwenden Sie eine frische 4 - oder 24-Well-Platte und Transfer 400 ul vorgewärmte Imaging-Lösung zu einem gut. Fügen Sie die Farbstoff-Lösung auf die gleiche auch auf 500 ul einer 5 uM Lösung zu kommen.
4. Vorsichtig ein Deckglas mit Zellen (z. B.10-18 mm im Durchmesser) in den Brunnen, Zellen nach oben.
5. Inkubieren für einen angemessenen Zeitraum in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C (mittlerweile vorzubereiten Bildgebung Einstellungen am Mikroskop Stufe). Typische Farbstoff-Ladezeiten sind für Neuronen und Gliazellen 7-15 min und für Zelllinien 10-20 min.

Entscheidend: Dye-Ladezeiten und Farbstoffkonzentration nach Zelltyp, Zelldichte und Experiment-Bedürfnisse ab! Lange Inkubationszeit in Anwesenheit des Farbstoffs kann schädlich für die Zellen, insbesondere primäre Neuronen und Gliazellen primäre und das ist entscheidend für die physiologische Reaktion auf Reize. Lange Inkubationszeiten (z. B. 30 min) wird nur für ER Calcium Lokalisierung Experimente nützlich, um die Verteilung von ER Calcium in kleinen subzellulären Strukturen, z. B. feine Neuriten oder Stacheln zu untersuchen. In einigen Experimenten kann ein Gemisch aus 1/3 Wachstumsmedium mit bildgebenden Lösung helfen Zellen während Fluo5N-AM schützenLaden.

6. Augenblicklich übertragen das Deckglas in eine andere Zelle Kultur gut mit Imaging-Lösung (HEPES-Ringer oder ACSF) und starten Sie die Montage der Zellen in der bildgebenden Kammer.

7. ER-Calcium Live Cell Imaging mit einem Inverted Laser konfokalen

1. Verwenden Sie einen Pinsel zu Hochvakuumfett einem bildgebenden Kammer beantragen. Das Fett wird benötigt, um das Deckglas auf dem Boden der Perfusionskammer fixieren. Wir verwenden selbstgemachte Bildgebung Kammern für 10-12 mm Deckgläser mit einem kleinen Volumen, wodurch hohe Perfusion Geschwindigkeiten von bis zu 15-fach Puffer Austausch pro Minute. Ein kommerziell erhältliches Perfusionskammer für 18 mm Deckgläser, können von Warner Instrumente (RC-49FS) erworben werden. Diese Kammer kann auch Feld-Stimulation der Nervenzellen.
2. Pick-up das Deckglas mit den Fluo5N-beladenen Zellen und fügen Sie einen kleinen Tropfen Imaging-Lösung (50-100 ul) auf die Zellen, Zellen mit Imaging-Lösung bedeckt zu halten.Schalten Sie das Deckglas auf den Kopf und montieren Sie die Zellen in der Bildgebung Kammer. Um das Deckglas in das Silizium-Kleber drücken, verwenden Sie ein Wattestäbchen (zB Q-Tips).
3. Wischen Sie verbleibende Puffer aus dem Boden des Deckglas mit Wattestäbchen. ACHTUNG: Vorsichtig abwischen Restfeuchte bei Verwendung eines Öl-Objektiv mit hoher numerischer Apertur für hochauflösende Bildgebung. Restliches Salz wird am besten durch Wasser entfernt. Unbeabsichtigter Abstrich von Fett kann mit Aceton oder reinem Ethanol entfernt werden.
4. Tauschen Sie den "Dummy"-Bildgebung Kammer mit dem experimentellen Bildgebung Kammer. Waschen Sie die Zellen für 5-10 min durch kontinuierliche Perfusion.
5. Waschen der Zellen für 5 - 10 min durch kontinuierliche Perfusion.
6. Für Zellauswahl verwenden eine minimale Menge an Laserbeleuchtung, hohe Abtastraten (2-4 Hz), ein kleines Bild Größe und eine hohe Verstärkung.
7. ACHTUNG: Bei der Auswahl der Fluo5N-markierten Zellen nicht verwenden Überschuss von Licht oder direkte Beleuchtung mit epifluorescent Licht. Helle Beleuchtung der Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplexe} bewirkt, dass der komplette Verlust der ER-spezifische Fluoreszenz innerhalb von 2-4 Sekunden (Abbildung 5).
8. Richten Sie das Mikroskop nach dem geplanten Experiment. Zur Orientierung sind repräsentativer für die Abbildung mit verschiedenen TED Vektoren in Tabelle 1 angegeben. Für invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, verwenden wir ein Olympus IX81 Mikroskop mit einer FluoView 1000 konfokale System, das mit Diodenlaser (473 nm, 15 mW; 559 nm, 20 mW) ausgestattet ist, kombiniert und einer spektralen Detektor-System.
9. Zu Beginn des Experiments dokumentieren die Zellen von Interesse durch hochauflösende x, yz Bildstapeln.
10. Führen x, yt Bildgebung ER Calcium Dynamik unter den spezifischen experimentellen Bedingungen zu überwachen. Typische Einstellungen für unser System sind in Tabelle 2 aufgeführt.
11. Überwachen Sie Änderungen in ER Calcium unter kontinuierlicher Perfusion mit Imaging-Lösung. Typische Puffer Wechselkurse sind exemplarily: (a) Waschen der Zellen und store-Depletion durch SERCA Block: 1,5 ml / min, (b) ATP / DHPG Stimulation: 3 ml / min.
12. Erwerben Sie digitale Bilder bevorzugt mit 12-Bit (4096 Graustufen). Für parallele Bildgebung Fluo5N/Ca ^{2 +} und RFP, 8-Bit-Bilder (256 Grauwerte) können Sie Ihr System von Datenüberlauf retten.
13. Lagern leben Zelle Zeitreihe Bilder (x, yt) oder 3D-Bild Stapel (x, yz) (für die zelluläre Verteilung von Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplexe)} in einem kompatiblen Format ImageJ (zB tiff).

8. Bildverarbeitung und Datenanalyse

1. Öffnen Sie das Bild Stapel in der ImageJ Programm. Bei mehrfarbigen Bildgebung, teilen Sie die RGB-Kanäle, wenn sie von ImageJ gefragt.
2. Identifizieren Sie Ihre Region (en) von Interesse (ROI) durch eine sorgfältige Prüfung der Bildstapeln (z. B. mit Hilfe einer Intensität gegen Zeit-Diagramm)
3. Nutzen Sie die Zeit-Series Analyzer Plugin zum Auslesen der durchschnittlichen Pixel-Intensität in einer ROI (F _roh). Depending auf Zweck ziehen ROIs um entweder die komplette ER oder kleine Regionen des ER ER zB von Dendriten der peripheren Zelle Regionen. Auch gehören 1-3 ROI in Gebieten ohne Zellen für Hintergrundsubtraktion.
4. Berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz (F _b) durch Berechnung der mittleren Fluoreszenz des Hintergrundes ROI und subtrahieren den Hintergrund Wert F _b aus den F _Rohwerte, die F _roi Wert zu erhalten.
5. Berechnen F _0, welche die basale Fluoreszenz der Zellen ist, durch Berechnen des Mittelwerts von zehn bis 30 Fluoreszenzwerte für jeden ROI in einem Ruhezustand.
6. Berechnen Sie die Hintergrund-korrigierten relativen Veränderungen in der Fluoreszenz durch AF / F ₀ durch die Formel:

7. Anwesend relativen Veränderungen in fluoreszierenNCE als Spur mit AF / F ₀ für den Y-Achse und die Zeit für die X-Achse.

Representative Results

Dieses Protokoll stellt eine unterbrechungsfreie Ansatz für die direkte Bildgebung der freien ER Calcium. Low-Affinität synthetischen Ca ^{2 +} Indikatoren gelöst und eingeschlossen in das ER-Lumen mit Hilfe eines ER gezielt rekombinanten Esterase Enzymaktivität. Verbesserte Belastung der Ca ^{2 +-Indikator} Farbstoffe zum ER-Lumen ermöglicht eine direkte und schnelle Darstellung von ER Kalzium-Speicher der Dynamik.

Zelltypen für TED

Die Durchführbarkeit des Verfahrens wurde in den Zelllinien BHK21, HEK293 ^34, HeLa ^17, SH-SY5Y, kultivierte Astrozyten ^8,40 und primären hippokampalen und kortikalen Neuronen ^8,34,41 gezeigt worden. In unseren Experimenten funktioniert gut, wenn TED TED Konstrukte stabil exprimiert werden, vorzugsweise durch Selbst-inaktivierenden lentiviralen Vektoren ^37,39 mit einem relativ schwachen Promotor (z. B. Ubiquitin-Promotor) ^35. Andere, stärkere Promotoren werden derzeit untersucht.

Erfolgreiche TED Beladung mit Fluo5N bietet eine klare und helle Färbung des ER-Lumen, die aus der Kernregion ^34,41 verschont. Bei ruhenden Staaten stellt die Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplex} Etikett die Lokalisierung von Calcium, wenn es durch Fluo5N gebunden, daher ist es die regionale Verteilung der freien Calcium in das ER-Lumen darstellt. In 6 konfokalen Bildern von Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplexe} und Tag-RFP-T2 Etiketten von Red-CES2 in HeLa-Zellen, kortikale Astrozyten und Neuronen im Hippocampus gezeigt. 6C zeigt die Fluoreszenz-Ca ^{2 +-Indikator-Komplex} in die Zelle Körper sowie Neuriten von hippocampalen Neuronen. Dies ermöglicht Prüfung von Ca ^{2 +-Signale} in kleineren Prozessen (vgl. ^34,35).

Einige Erfahrung erforderlich, um die typischen ER-Label von einem cytosolischen Etikett, wohin beobachtet werden unterschiedenn Zellen werden beschädigt oder ungesund. Cytosolic, endogene Esterasen auch loslassen Fluo5N, was zu einer sehr hellen Färbung des Cytosol und Zellkern, wenn Kalzium durch die Plasmamembran undicht führt. Cytosolic Färbung Fluo5N/Ca ^{2 +} wird auch beobachtet, wenn TED-markierten Zellen mit dem Ionophor Ionomycin in Gegenwart von extrazellulärem Calcium (7) behandelt werden.

Direkte Abbildung von Calcium-Freisetzung aus dem ER

Eine wichtige Anwendung von TED ist die direkte Visualisierung von ER store Erschöpfung ^17,34. In Abbildung 8 zeigen wir einen repräsentativen Experiment mit Hippocampusneuronen durchgeführt, mit dem Ausdruck Red-CES2. Neuronen mit Red-CES2 bereichern hohe Mengen an Fluo5N im perinukleären Region (Pfeile in Abbildung 8). Wenn die SERCA Blocker CPA durch Perfusion angelegt wird, wird eine schnelle Entleerung des ER Calciumspeicher beobachtet (Abbildung 8B). Hier präsentieren wir dieRohwerte (y-Achse), die erhalten wird, wenn Neuronen mit 12-Bit abgebildet werden. Imaging sind in Tabelle 2 aufgeführt. Notieren Sie sich den enormen Wandel in mittlere Fluoreszenz Dichte pro ROI, die beobachtet werden, wenn TED Neuronen angelegt wird. Bei anderen Experimenten analysiert ER Calcium-Freisetzung in Neuronen mit TED, möchten wir auf frühere Experimente, die bereits ausführlich diskutiert worden ^8,34,35 beziehen. In Kürze wird TED in Neuronen in vitro verwendet, um die SERCA-sensitive ER Calcium Speicher im Detail durch invertierte konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie ^8,34 visualisieren und wurde erfolgreich für schnelle Bildgebung (15 Hz) von mGluR1 / 5 induziert IICR ³⁴ angelegt.

Abbildung 9 zeigt ein typisches Experiment mit Maus kortikale Astrozyten in vitro, durch 200 uM ATP durch die Perfusion bei niedriger Auflösung mit einem 20x Wasser Ziel stimuliert. Nach lentiviralen Infektion, die Zellen hier gezeigten Red-AusdruckCES2, die durch eine Ubiquitin-Promotor angetrieben wird. Scangeschwindigkeit betrug ~ 2 Hz und beide Kanäle (Fluo5N/Ca ^{2 +} und Red-CES2 Fusionsprotein) wurden gleichzeitig abgebildet (in line). Zu Beginn des Experiments wurden die Gliazellen zeigten gute Infektion mit dem Ausdruck Konstrukte und gute Beladung mit Fluo5N-AM. Die ROIs, die analysiert wurden, sind in Abbildung 9A hervorgehoben. Eine ROI gesetzt wurde, um die Hintergrund-Fluoreszenz (bg), messen ROI 1-2 die Fluoreszenz von kompletten Zellen zu messen, deckt gerade die ROI 3 ER der Zelle und ROI 4 wurde um das komplette Gesichtsfeld gezogen. Kurz nach Stimulation mit ATP der Fluoreszenz des Fluo5N/Ca ^{2 +} Komplexe abrupt fallengelassen unten durch Ca ^{2 +-Freisetzung} aus dem ER. Schließlich wird das ER teilweise mit Calcium wieder aufgefüllt. Gleichzeitig wird die Fluoreszenz des RFP kontinuierlich abnimmt als Folge der geringen Bleichen (9B, unteres Bild). Spuren, die Änderungen in fluoresz ENCE Intensität (9C) weisen auf einen wichtigen Nachteil TED. In vielen (nicht allen) Experimente hohe Mengen an Fluo5N-Komplexe werden während der Stimulation verloren. Als Folge müssen die Fluoreszenz-Werte nicht wieder auf die ursprüngliche Fluoreszenz Intensität.

Abbildung 10 zeigt eine CES2-infizierten BHK21 Zelle bei hoher Auflösung, von Fluo5N/Ca ^{2 +} beschriftet und stimuliert mit ATP. BHK21 Zellen diente als frühes Modell Zelle für ER Calcium Analyse ^31. Beachten Sie, dass ER Calcium-Freisetzung und store-Nachfüllen visualisiert in feinen Strukturen der ER Tubuli ist. Die Strukturen waren bei langsamer Geschwindigkeit (~ 0,2 Hz) abgebildet worden, mit 512 x 512 Pixel, Airy Disc 1 Einstellung für die konfokale Blende und mit einem 63x Öl-Objektiv.

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Abbildung 1. Übersicht der ER Calcium-Signalisierung. ER Calcium-Freisetzung wird durch "Leck" Kanäle wie das ER intramembrane Porenkomplex Sec61 verursacht. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) stimuliert IP _{3-Produktion,} die dann bewirkt IP _{3-induzierten} Calcium-Freisetzung (IICR). ER Calcium-Freisetzung wird durch die STIM Komplexe erfasst und induziert Calcium-Shop-Eintrag (SOCE) durch Ionenkanäle der Trp Familie und / oder Orai Kalziumkanäle. Voltage-Kalziumkanäle (Ca _V) vermitteln schnellen Calcium-induzierten Calcium-Freisetzung (IKRK) von Ryanodinrezeptoren (RyR) entweder durch direkte Protein-Interaktion (Skelettmuskel) oder physiologische Interaktion (Herzmuskelzellen, Neuronen). Der Verlust von Calcium ER wird dynamisch durch die Wirkung der SERCA Pumpe (sarcoplasmic-endoplasmatischen Retikulum Calcium ATPase) gerettet.

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Abbildung 2. Prinzip der zielgerichteten-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED). Gezielte Überexpression eines Carboxylesterase bietet eine hohe Esterase-Aktivität (CES2) in der Notaufnahme. Die Esterase wandelt die Acetoxymethylester Farbstoff Fluo5N-Uhr zu einem Calcium-sensitiven, fluoreszierenden Farbstoff, der gefangen in der ER bleibt. Fluo5N hat eine geringe Affinität zu Kalzium-Ionen. Daher ist unter Ruhebedingungen sind fluoreszierende Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplexe} bevorzugt in der ER gebildet, wobei die Calcium-Konzentration etwa 1000-fach höher als im Cytosol.

Abbildung 3. Repräsentative TED Vektorkonstrukte CES2.: Native Version von Maus CES2. CES2 ^{OPT 43:} Die ERSignalpeptid wurde ausgetauscht und nun auch ein Intron, während der ER Retention Motiv der klassischen KDEL-ER Aufbewahren und Abrufen Motiv der löslichen Proteine ​​ER geändert wurde. Ein myc tag bietet ein Epitop für Protein-Nachweis durch indirekte Immunfluoreszenz Kennzeichnung und Western-Blot-Analyse. Red-CES2 ^8,43: Ein rot fluoreszierende Protein wurde direkt hinter dem aminoterminalen Signalpeptid aufgenommen. Red ^LK CES2 ^43: A Glycin-Serin-Linker wurde eingeführt, um ein flexibles Gelenk zwischen dem RFP und dem CES2 Element zu etablieren.

Abbildung 4. Der Ablauf für direkte ER Calcium Bildgebung mittels TED. Zellsuspensionen von Primärzellen oder Zelllinien sind mit einem Virus, das eine TED Ausdruck Konstrukt transduziert. Die Zellen werden dann auf coversli ausgesätps. Bei der Verwendung von RFP-CES2 Konstrukten transduzierten Zellen identifiziert werden mit der roten Fluoreszenz werden. Ziel-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung wird durch Inkubation der Zellen in einer Imaging-Lösung, die eine AM-gekoppelt mit geringer Affinität Ca ^{2 +-Indikator,} wie Fluo5N-AM oder Mag-Fura2-AM durchgeführt. ER Calcium Imaging wird mit einem invertierten Laser Scanning Mikroskop (siehe Protokoll) oder einem anderen kompatiblen Imaging-Gerät durchgeführt. Im Echtzeit-Bildgebung die Zellen unter kontinuierlichen Perfusion mit einem Imaging-Lösung wie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF). Zellstimulationsgerät entweder durch Perfusion oder durch lokale Druck-Ausstoß durchgeführt wird.

Abbildung 5. Starke Epifluoreszenz Beleuchtung zerstört die ER-spezifischen Fluo5N TED Label innerhalb von Sekunden. Repräsentative Bilder aus einem Video, mit einem aufrechten Mikroskop Bildgebung abgebildet. Hier Gliazellen exprEssing RFP-CES2 wurden mit Fluo5N-AM geladen. Zuerst wird die rote Fluoreszenz von einer infizierten Zelle wurde mit einer CCD-Kamera offenbart. Anschließend wurde die Fluo5N/Ca ^{2 +-Signal} mit einer LED-Lichtquelle beleuchtet wird. Eine erste klare ER Lokalisation Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplexe} (gelbe Pfeile) wird schnell durch starke Beleuchtung mit 470 LED-Lichtquelle und einer Verschiebung der Fluoreszenz Verteilung wird im nuklearen Bereich sichtbar (gelbe Pfeile, 12,46 sec) zerstört.

Abbildung 6. TED Beladung mit Fluo5N-AM in verschiedenen Zelltypen Oberes Feld:. HeLa-Zellen mit stabiler RED-CES2 Ausdruck Mitteltafel:. Kortikalen Astrozyten nach lentivirale Transduktion mit Red-CES2 Lower Panel:. Hippocampusneuronen mit RED-CES2 bei DIV 8. Alle Zellen wurden auf Deckgläsern gezüchtet und gefärbt mit Fluo5N-Uhr wie im Verfahren beschrieben. Die Fluo5N/Ca ^{2 +} Label repräsentieren auch die Lokalisierung von Calcium, wenn es Fluo5N gebunden. Maßstab 40 um.

Abbildung 7. Fluo5N Farbstoff in das Cytosol sichtbar nach Ionomycin Behandlung. Gliazellen wurden mit Red-CES2 infiziert, bedruckt mit Fluo5N-AM, und mit der SERCA-Blocker thapsigargin ER Calcium führen. Ionomycin Behandlung induziert einen starken Zustrom von extrazellulären Kalzium. (Oberes Feld) Zellen zeigen einen drastischen Anstieg in Fluo5N/Ca ^{2 +-vermittelten} Fluoreszenz. (Unteres Bild) Die durchschnittliche Intensität Projektion Bild des Fluo5N/Ca ^{2 +-Label} zeigt eine typische cytosolischen Kennzeichnung durch die fluoreszierende Kalzium-Komplex Blauer Pfeil:. Ein hell markierten Zelle zeigt an, dass diese Zelle hohe Mengen an Kalzium hat in the Cytosol. Vermutlich wird diese Zelle beschädigt Lila Pfeil:. Zellen werden hell im Cytosol auf Ionomycin Behandlung bezeichnet.

Abbildung 8. ER Kalzium-Speicher der Erschöpfung in Neuronen durch die Blockierung der SERCA. (A) Hippocampusneuronen (DIV 9) express Red-CES2 (A, rot) und sind mit Fluo5N-AM (A, grün) markiert. Die Pfeile zeigen auf zwei Zellen analysiert. Das Bild (Maximum Intensity Projection) ist ein Element abgeschnitten Axt, yz-Bild, das am Anfang des Experiments übernommen wurde. (B) Raw Spuren, die die ER Kalzium-Speicher der Erschöpfung nach Perfusion mit 30 uM CPA. Hier 1.000 Bilder wurden mit 1 Hz und 12-Bit gemacht. Die Rohdaten der mittleren Fluoreszenz Dichte pro ROI (Y-Achse) der beiden Zellen in A gezeigt sindüber der Zeit aufgetragen (rote und blaue Kurve). Die Hintergrund-Werte (schwarze Kurve) konstant bleiben. AU = willkürlichen Einheiten von Grauwerten, die die Fluoreszenz-Dichte.

Abbildung 9. ER Calcium-Freisetzung auf ATP Stimulation von Gliazellen. Gliazellen wurden mit Red-CES2 infiziert und beladen mit der Ca ^{2 +-Indikator} Fluo5N-AM. Die Zellen wurden mit 200 uM ATP über Perfusion für 10 sec stimuliert. (A) Gliazellen exprimiert Red-CES2 (Mitte) mit Fluo5N-AM (links) markiert sind. Die ROIs werden hervorgehoben. (B) Einzelne Bilder aus der Zeitraffer-Sequenz. (Oberes Feld) Die Intensität der Fluoreszenz extrahiert hoch ist bei 0 sec und 71 sec, bevor die Zellen reagieren. Es abrupt (80 sec) und erreicht ein Minimum bei 86 sec, wird, bevor sie wieder ansteigt (160 sec) wie Calcium zurück in den ER gepumpt. (unteres Bild) Fluoreszenz Intensität des RFP sinkt langsam und kontinuierlich über die Zeit aufgrund Bleichen. (C) Zeit Spuren, AF / F _0-Werte für der ROI angegeben in A. Die Fluoreszenz, die den Calcium-Konzentration, fällt nach ATP Stimulation und teilweise erholt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 10. Hochauflösende Bildgebung von ATP-induzierte Calcium-Freisetzung in BHK21 Zellen. Die Zellen wurden mit Fluo5N-AM beladen und abgebildet in Gegenwart von extrazellulärem Calcium. (A) Bild-Serie, die Änderungen in Fluo5N/Ca ² Fluoreszenz während ATP-Stimulation ^{+-abgeleitet.} (B) Mittlere Intensität Projektionsbild zeigt die ROIs in C (c) ATP induzierten Calcium-Freisetzung und Nachfüllen des ER Calciumspeicher in kleine Teilbereiche des ER analysiert. Die Spuren stellen Veränderungen in der Fluoreszenz.

Anregungslaser [nm]	Erfassungsbereich [nm]
TED mit Red-CES2 Vektor-Konstrukte
473 (Fluo5N/Ca 2 +)	507-545
559 (Tag-RFP-T2)	> 570
TED mit CES2 nur Vektor-Konstrukte
473 nm (Fluo5N/Ca 2 +)	> 507

Tabelle 1. Einstellungen für die spektrale Detektor.

Experiment	ER Erschöpfung mit einem Red-CES2	Stimulation von Neuronen mit einem CES2 Konstrukt	Hohe räumliche Auflösung Bildgebung CES2
Ziel (NA)	20x Wasser (0.7)	20x Wasser (0.7)	40x oil/63x Öl (≥ 1,3)
473 nm Laser
Leistung	1%		1%
HV A	600-780	600-780	400-780
Gewinnen B	0-1%	1-2%	0%
Offset	0	0	0
559 nm Laser
Macht	1%	optioNALC	optionalC
HV A	600-780	optionalC	optionalC
Gewinnen B	0-1%	optionalC	optionalC
Offset	0	optionalC	optionalC
Scangeschwindigkeit	1-2Hz	Freie Sicht	Freie Sicht
Bildgröße	320x320 Pixel	240x240 pixel	512x512 pixel
Scannen Typ	Im Einklang	Bidirektionale	Nyquistcriterion (2 Pixel / Element)
Stimulation	100-200 pM ATP :5-15 sec; 200-500 pM Glutamat für 5-15 sec	100-200 um Agonist: 5-15 sec
Lochkamera	2-5 luftigen Scheiben	2-5 luftigen Scheiben	1 luftigen Disc

Tabelle 2. Beispiele für Mikroskop-Einstellungen entsprechend der Art des Experiments A:. HV = Strom an den Photomultiplier, B: Verstärkung = Verstärkung der PMT-Signal, C: optional: Kanal frei ist für die Verwendung mit anderen roten Fluoreszenzfarbstoffe (zB CMX-Ros zur Sichtbarmachung der mitochondrialen Potential) oder andere rote fluoreszierende Proteine.

Discussion

Die Vor-und Nachteile des TED Verfahren wurden ausgiebig in den letzten Publikationen ^34,35 diskutiert. Im Vergleich zu anderen oben beschriebenen Verfahren umgeht das Problem der TED zu stören und Perfusion der Zellen. Darüber hinaus müssen zwei Aspekte hervorgehoben werden. Das Prinzip der TED für ER Calcium Imaging erfordert (1.) Die gezielte Expression eines aktiven Carboxylesterase in das ER-Lumen mit Hilfe von TED Vektor-Konstrukte und (2.) Die effiziente und bevorzugte Freisetzung von niedriger Affinität synthetischer AM-Ester Calcium Farbstoffe in das ER-Lumen.

1. TED Vektorkonstrukte

Abbildung 3 fasst die Entwicklung der TED Vektor-Konstrukte. TED wurde auf der Grundlage der CES Familie Proteine ​​(EC 3.1.1.1) entwickelt. Diese Proteine ​​werden ansässigen Mitglieder in das ER-Lumen. Für in-vitro-Studien das rekombinante Proteine ​​Verabreichung von CES funktioniert am besten nach stabiler Expression desProtein oder nach der viralen Infektion mit mäßiger Expression. Derzeit ist nicht bekannt, ob auch andere Proteine ​​mit Esterase-Aktivität kann CES Proteine ​​für TED Bildgebung ersetzen. Es wird nicht empfohlen, um transiente Transfektion von TED Vektoren für dynamische ER Calcium Analyse zu verwenden, da die Zellen weniger empfindlich sind nach der Transfektion Verfahren. CES Proteine ​​brauchen richtige Ausrichtung auf das ER-Lumen und dieser Schritt muss eine effiziente Abspaltung der ER-Signalpeptid. Darüber hinaus ist Aufbewahren und Abrufen von CES Proteine ​​in das ER-Lumen durch ihre aminoterminalen KDEL-ähnlichen Motiv vermittelt. Diese Mechanismen können gesättigt, wenn hohe Expression von TED-Vektoren nach der transienten Transfektion hergestellt werden. Dies kann bewirkt eine falsche Lokalisierung der CES-Proteine ​​und unterstützt die Bildung von Protein-Aggregaten.

2. Low-Affinität Ca ^{2 +} Indikatoren für TED

Der wichtigste Nachteil TED wird durch Beschränkungen der verfügbaren verursachtLage Indikatorfarbstoffen für die unterbrechungsfreie Analyse ER Calcium. ER Calcium Imaging mit TED erfordert Indikatorfarbstoffe mit einem hohen K _D (dh eine geringe Affinität) und eine niedrige Fluoreszenz in Abwesenheit von Calcium. Basierend auf unserer Erfahrung Fluo5N-AM funktioniert am besten, aber das Indikator-Farbstoff ist nicht bleichen-beständig. Die Low-Affinität Ca ^{2 +} Indikatoren Mag-Fura2-AM (K _D ~ 25-50 pM) ³⁴ und Mag-Fluo4 (K _D ~ 20-25 uM) wurden ebenfalls getestet. Beide Farbstoffe sind in ER Strukturen von TED geladen, aber das Risiko der Produktion von "gemischte Signale" nach Stimulation der ER Release ist hoch. A "Mixed-Signal" stellt zunächst einen schnellen Anstieg der Fluoreszenz im Cytosol durch eine Abnahme der Fluoreszenz im ER gefolgt. Um diese Einschränkung zu umgehen, können störende Ansätze für ER Calcium Imaging helfen ^32,35. Mag-Fluo4 (K _D ~ 20-25 pM) zeigt eine starke TED-vermittelte Etikett des Golgi-Zisternen, die weniger stark ausgeprägt ist, wenn Fluo5N-Uhr is verwendet.

Anwendungen und Perspektiven

Hier haben wir auf inverse konfokale Laser-Scanning-Analyse der ER Calcium mit dynamischen TED konzentrieren. TED-Messungen können auch auf jedem Standard-konfokale System oder Weitfeld-System mit der entsprechenden Anregung Quelle (Laser, LED-, Metall-Halid-Lampen, Monochromator), Filtern und Fluoreszenzdetektionssystem ⁶ angepasst werden.

TED ist besonders nützlich in solchen Zellen, die nicht exprimieren, ausreichend endogenen CES Aktivität im ER. Wir beobachteten, dass zB BHK21 Zellen genug endogene Esterase Aktivität im ER zu geringe Affinität Indikatoren Freisetzung bereitzustellen. In unseren Händen, das ist nicht der Fall mit vielen anderen Zelllinien (HEK293, SH-SY5Y, HeLa, PC12), primäre Glia und primären Neuronen. Hier ermöglicht die TED-Methode eine erfolgreiche unterbrechungsfreie Farbstoffbeladung dem ER.

Zukünftige TED Vektoren können Ausmaß ihrer Anwendung aus dem ER-Lumen zuanderen subzellulären Kompartimenten oder zelluläre Mikrodomänen. Das Prinzip der TED Verfahren ist unabhängig von der Indikator-Farbstoff, und kann daher mit dem AM-Ester von einem Farbstoff, beispielsweise für die Abbildung des intrazellulären pH Dynamik verwendet werden. Kürzlich beschrieb das Labor von Luke D. Lavis, dass das rekombinante Schweineleber-Esterase (PLE) CES1 eine selektive Esterase-Ester Paar mit cyclopropylester Farbstoffe ⁴² bildet. Cyclopropylester Mittel erwiesen sich als resistent gegen Hydrolyse durch endogene Esterasen und der selektiven Entlarvung durch die rekombinante CES Aktivität aktiviert zellspezifischen Targeting Molekül ^42. Es wird interessant sein zu untersuchen, ob Kalzium-Indikatoren basierend auf dieser neuen Technik wird die subzelluläre Zielspezifität synthetischer Indikatoren verbessern.

TED funktioniert am besten in Zelllinien wenn TED Proteine ​​stabil exprimiert werden. Die Einrichtung einer Sammlung mit stabilen TED Zelllinien von Vorteil wäre.

Transgene Maus TED Modelle sind auch ein wichtiges Ziel unserer Arbeit, und dies wird TED in spezifischen Gewebe Vorbereitungen von spezifischen neuronalen Schaltkreisen, Skelettmuskel, Herz oder Zubereitungen des Gefäßsystems zu ermöglichen. Diese Maus-Modell wird dazu beitragen, die Analyse der ER Kalziumdynamik von zellulärer Ebene zu übertragen, um mehrere physiologische Gewebe Kontext.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham's F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.