Direkt avbildning av ER Kalcium med riktade-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Summary

Riktade-esteras inducerade färgämnesbelastning (TED) stödjer analys av intracellulära dynamik kalcium butik genom fluorescens avbildning. Metoden baserar på en inriktning av en rekombinant karboxylesteras till det endoplasmatiska retiklet (ER), där det förbättrar den lokala demaskera av syntetiskt låg affinitet Ca

Abstract

Visualisering av kalcium dynamik är viktigt att förstå betydelsen av kalcium i cellen fysiologi. För att undersöka kalcium dynamik, har syntetiska fluorescerande Ca ^{2 +} indikatorer blivit populär. Här visar vi TED (= riktade-esteras inducerade färgämnesbelastning), en metod för att förbättra frigörandet av Ca ^{2 +} indikatorfärgämnen i ER lumen hos olika celltyper. Hittills har TED används i cellinjer, gliaceller och nervceller in vitro. TED baser på effektiv, rekombinant inriktning av en hög karboxylesteras aktivitet till ER lumen med hjälp av vektor-konstruktioner som uttrycker Carboxylesterases (CES). De senaste TED vektorer innehåller en central del av CES2 sammansmält till ett rött fluorescerande protein, vilket möjliggör simultan två-färgbilder. Dynamiken i fritt kalcium i ER avbildas i en färg, medan motsvarande ER strukturen visas i rött. I början av förfarandet, celler omvandlas med en lentivirus. Därefter de infekterade cellerna enre ympades på täckglas att äntligen möjliggöra levande cell imaging. Därefter levande celler inkuberas med acetoximetylester (AM-ester) form av låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer, exempelvis Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, eller Mag-fura2-AM. Esterasaktiviteten i ER klyver utanför hydrofoba sidokedjor från AM formen av ^{Ca2 +-indikator} och en hydrofil fluorescerande färgämne / ^{Ca2 +} komplex bildas och fastnar i ER lumen. Efter färgämnesbelastning, cellerna analyseras på en inverterad konfokalt laserscanning mikroskop. Celler kontinuerligt perfusion med Ringer-liknande lösningar och ER kalcium dynamik är direkt visualiseras genom time-lapse avbildning. Kalcium frisättning från ER identifieras genom en minskning i fluorescensintensitet i regioner av intresse, medan påfyllning av ER kalcium butiken ger en ökning av fluorescensintensitet. Slutligen, är förändringen i fluorescerande intensitet över tiden bestäms genom beräkning av AF / F _0.

Introduction

För att lösa fysiologiska kalcium svaren från ER, utvecklade vi en ny strategi för att förbättra fångst av syntetiska kalcium känsliga färgämnen till ER. Metoden möjliggör direkta, icke-störande realtidsövervakning av fri ER kalcium i närvaro av extracellulärt kalcium.

Funktion och signalering av ER Kalcium

Kalcium-signaler finns i olika celltyper, t.ex. muskel-celler, neuroner och gliaceller och deras funktioner varierar från medla muskelkontraktion till ett engagemang i synaptisk transmission i inlärning och minne ^1,2. Förändringar i fritt kalcium koncentrationen är av hög vetenskaplig intresse eftersom kalcium är involverat i regleringen av genen transkription, celldelning, neuronala retbarhet, celldöd och andra cell signalering händelser ^1-7. Alla dessa cellulära kalcium signaler funktionellt anslutna och bidra till intracellulär kalciumlagra dynamik ^8-10.

Ett gemensamt drag hos alla kalcium signaler är flödet av kalcium mellan det extracellulära utrymmet, cytosolen och organeller, främst ER och mitokondrier. Detta orsakar dynamiska förändringar i kalciumkoncentrationen inom dessa organeller, som avkänns av olika signalsystem komponenter. I allmänhet kalciumkoncentrationen i ER varierar mellan 100 och 800 ^ M, i cytosolen kalciumkoncentrationen är nära till 100 nM och i det extracellulära utrymmet koncentrationen är cirka 1-2 mM. Följaktligen finns det en hög kemisk drivkraft för kalcium flöde mot cytosolen ^2,9,10.

De vanligast undersökta ER-härledda kalcium signaler beror på stimulering av G-proteinkopplade receptorer (GPCR), som sedan aktiverar fosfolipas C (PLC). PLC i sin tur producerar inositol 1,4,5-trifosfat _(IP3) ^1. Vid bindning av IP ₃ av sin receptor (IP _3-Rec, figur 1) i ER-membranet, kalciumjoner frigörs från ER lumen. Historiskt sett var IP _3-medierad kalciumfrisättning från ER först - även om indirekt - mätt i acinära bukspottkörtelceller från Streb et al 1983 ^11.. Denna publikation föreslås för första gången en signaleringskaskad involverar acetylkolin, fosfolipas C, och IP _3. Detta sätt att kalciumfrisättning generellt betecknas IP _3-inducerad kalciumfrisättning (IiCR) (Figur 1). Kinas-beroende aktivering av fosfolipas Cy genom receptortyrosinkinaser tyrosin länkar handlingen av tillväxtfaktorer och neurotrofiska faktorer till ER kalcium signalering efter IP ₃ höjd ^12. Förutom IiCR, kan kalcium höjd förmedlas genom jonotropisk kalcium posten, till exempel via spänningsstyrda kalciumkanaler (Ca _V), och efterföljande kalcium-inducerad kalcium frisättning (CICR) genom ryanodine receptors (Ryr). IiCR och CICR är fysiologiskt kopplade till affären-drivs kalcium Entry (SOCE). SOCE innefattar verkan av Stim (stroma interagerande molekyl), som är en sensor för ER kalciumfrisättning. Stim har visats stimulera extracellulärt kalcium inlägg via Transient Receptor Potential kanaler (Trp) ^13, Orai kalciumkanaler ¹⁴ och till och med spänningsstyrda kalciumkanaler ¹⁵ (Figur 1). Förlust av ER kalcium dynamiskt räddas genom inverkan av Sarco-endoplasmatiska nätverket kalcium ATPas (SERCA), som aktivt pumpar kalcium tillbaka till akuten. Blockering av SERCA med droger liksom thapsigargin lanserar en kontinuerlig förlust av ER kalcium till cytosola facket. Denna ER kalcium "läcka" är orsakad av ER-komplex intramembrane porstorlek såsom Sec61 proteinkomplexet ^16,17 (figur 1).

År 1998 publicerade Berridge en modell, den "neuron inom en neuron modell", which föreslår en princip fysiologisk roll för ER att integrera neuronala kalcium ^5. Denna modell anser att det finns ett kontinuerligt ER membran systemet bildar en intracellulär "bild" av den neuronala plasmamembranet ^5. Denna binära eukaryot membran system påstås vara en grundläggande förutsättning för tidsmässig och rumslig integration av snabba och långsamma kalcium signaler i nervceller. Kalcium signaler som uppträder antingen samtidigt eller senare i olika ryggar eller dendriter av samma neuron har tilldelats till cellens soma eller kärna via ER, där de summeras ^5,18. Då kan deras summa ha effekter på retbarhet av neuron, reglering av gentranskription eller integration av signalkaskader. Sålunda stöder ER integrationen av kalcium signaler. En förutsättning för detta koncept är kontinuiteten av ER i en enda cell, vilket har hävdats av flera studier och som har visat minst för somato-dendritic områden och korta avstånd axonal prognoser ^19-21. Huruvida det är ER kontinuitet inom långa axonal prognoser är en fråga för debatt.

Strategier för att mäta flödet av fritt kalcium över ER-membranet

Kalcium signaler oftast övervakas i cytosolen ^22,23. Därför kan det inte lätt särskiljas huruvida Ca ^{2 +} strömmar in i cytosolen från extracellulära eller från intracellulära förråd ^6,24. För att övervinna denna begränsning, har metodologiska strategier för direkt ER kalcium avbildning utvecklats. Sammanfattningsvis är följande strategier användas: (1) ER-riktade genmanipulerade protein-indikatorer ^25-27 Protein-baserade låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer använder bioluminescensprotein aequorin eller GFP i kombination med en kalciumavkännande protein.. Dessa genetiskt manipulerade ^{Ca2 +} indikatorer (GECIs) kanriktas till ER med hjälp av en signalpeptid och aktivt hålls i ER med hjälp av en kvarhållande och hämtning motiv. Gemensam ER Ca ^{2 +} indikatorer bas på Cameleon principen och är Cameleon YC4.3 ^26,28, Cameleon split YC7.3ER ^29, och Cameleon D1 ^30. (2) Direkt esterasalstrande baserad färgämne lastning av AM-ester med låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorerna ^31,32. AM-derivat av indikatorfärgämnen (Mag-fura2-AM, Mag-Fluo4-AM eller Fluo5N-AM) passera biologiska membran i en lipofil, kalcium-okänsliga tillstånd. Sedan, i cytosolen liksom i ER, endogena esteraser spjälkar av AM-estergruppen och släpp Ca ^{2 +} indikator och lämnar efter sig en viss mängd aktiv färgämne i cytosolen och i ER. Därför är denna metod användbar under betingelser av en hög kalciumkoncentration i ER, så länge som den cytosoliska kalciumkoncentrationen stannar långt under deskydd gränsen för låg affinitet indikatorer, särskilt under karakteristiska kalcium signaler (t.ex. nM till låga iM). (3) AM-ester lastning i kombination med plasmamembranet permeabilization ^32. Eventuellt kvarvarande cytosoliskt Ca ^{2 +} indikator avlägsnas genom plasmamembranet permeabilisering med små mängder av en "mild" rengöringsmedel (t.ex. saponin) i en artificiell intracellulär buffert. Således kan de intracellulära membran stimuleras, t.ex. med IP ₃ i den intracellulära buffert, direkt via "porer" i plasmamembranet. (4) Dialys i cytosolen i hela cellkonfiguration och samtidiga mätningar av ^{Ca2 +} i ER lumen och cytosolen ^32,33. En cell laddas först med en låg affinitet Ca ^{2 +} indikator (t.ex. Mag-fura2- AM, kvotmetriska, UV-ljus). Efteråt, med hjälp av en patch pipett, eventuella kvarvarande cytosolic låg affinitet Ca ^{2 +} indikator dialyseras ut ur cytosolen med en buffert innehållande en hög affinitet Ca ^{2 +} indikator (t.ex. Fluo-3, synligt ljus). Denna strategi möjliggör samtidig inspelning av cytosolic och ER härledda signaler. (5) Riktad-esterasalstrande inducerad färgämnesbelastning ^8,34. En karboxylesteras (CES) är riktad mot lumen av ER och ger en hög esterasaktiviteten för effektiv infångning av AM-ester form av låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer.

Riktade-esteras inducerade färgämnesbelastning (TED)

För att förbättra inriktning av låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer till ER lumen, var TED utvecklades. TED kräver överuttryck av en målinriktad ER mus karboxylesteras (CES2) (Figur 2), vilket uppnås via expressionskonstruktioner. Celler som uttrycker en rekombinant CES-konstruktionen inkuberas med AM-ester form av en kalcium iIndikatorn färgämne (Fluo5N-AM, figur 2). Sedan, i ER, är färgämnet omvandlas till Ca ^{2 +} känslig, membran impermeabelt Ca ^{2 +} indikator komplex (Fluo5N/Ca ^{2 +)} av den höga esterasaktiviteten därför fånga färgämnet i en hög koncentration i ER lumen ^{8 , 34.} Metoden är speciellt användbar för att undersöka ER kalcium-frisättning via IiCR-banor för exempel via metabotropiska, purinerga-eller glutamat-receptorer ^8,34 och att visualisera ER kalcium utarmning via "Läcka kanaler" direkt, exempelvis efter blockad av SERCA ^{17 , 34.} Till vår erfarenhet med låg affinitet Ca ^{2 +} indikator Fluo5N-AM är för närvarande den bästa tillgängliga indikatorn för användning med TED färgämnesbelastning strategi. Fluo5N-AM har en låg affinitet för ^{Ca2 +} (dissociationskonstant K _D ~ 90 ^ M, figur 2), är nästan icke-fluorescerande i sin AM-formen, men ger hög fluorescensemission vid Calcium bindning ^8,34. Den Fluo5N/Ca ^{2 +} komplexet kan exciteras med en vanlig ljuskälla med ~ 490 nm, vilket motsvarar vanliga färgämnen såsom FITC, Alexa 488, eller EGFP. Cytosoliska kalcium signalerna når knappast en koncentration i det låga pM intervallet och är därför knappt detekteras genom Fluo5N i cytosolen ^35.

För att förbättra prestanda TED har flera rekombinanta vektorkonstruktioner utvecklade (Figur 3). Ursprungligen är TED vektorer baserade på den kodande sekvensen för CES2 (RefSeq accessionsnummer NM_145603, CES2c) och bästa TED prestanda observerades med stabilt uttryck av CES konstruktioner. Nya TED vektorer uttrycker en central del av CES2 sammansmält med röda fluorescerande protein TagRFP-T2 ^36. Dessa vektorer har den fördelen att de kan användas för att identifiera omvandlade celler och att använda röd fluorescens som en intern kontroll för normalisering av förändringar i Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescens. Den röda fluorescens erbjuder också möjligheten att visualisera den strukturella fördelningen av ER och förändringar i ER dynamik enligt stimulering förhållanden.

Protocol

Detta protokoll introducerar TED tillämpas på cellinjer, hippocampus nervceller och kortikala gliaceller. TED prestanda fungerar bäst när TED vektorer uttrycks stabilt, exempelvis genom lentivirusvektorer. En schematisk översikt av TED metod visas i figur 4.

Ett. Beredning av lösningar

Följande lösningar skall beredas innan och kan lagras som anges. Vi använder vanligtvis steriliserad glas och plastmaterial och autoklaveras vatten.

1. Förbered HEPES-Ringer (i mM): 125 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 _H2O, 2 _CaCl2, 1,25 NaH ₂ PO _{4 H2O,} 10 glucose.H ₂ O.. Kalcium-fria HEPES-Ringer består av (i mM): 127 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 _H2O, 1,25 NaH ₂ PO _{4 H2O,} 10 glucose.H ₂ O och 0,1 EGTA.. Utan glukos dessa bildlösningar kan be lagrades vid 4 ° C. Den erforderliga mängden av D-glukos är nyligen tillsätts före användning.
2. För TED analys i hippocampus neuroner, är konstgjorda cerebrospinalvätska (ACSF) rekommenderas. ACSF är sammansatt av (i mM): 127 NaCl, 23 NaHCOs _3, 3 KCl, 2,5 NaHPO _{4 H2O,} 25 D-glucose.H ₂ O, 2 _CaCl2, 2 _MgCl2 0,7 H ₂ 0 i ddHaO. ₂ 0.
3. Förbered Fluo5N-AM till en koncentration av 5 mM. För att hjälpa solubilisering tillsätt 8,9 | il av 20% Pluronic F-127 (i DMSO, lagrad vid rumstemperatur, skyddad från fukt och ljus) till 50 ^ g av lyofiliserad Fluo5N-AM. Sedan solubilisera Fluo5N-AM genom en vatten-badsonikator under minst 2 minuter. Affär portioner à 0,5 l vid -20 ° C, skyddat från ljus och fukt.
4. Förbered antagonist och lager agonist efter behov. Till exempel: a) 10 mM ATP eller ADP (i _H2O, metabotropa aktivering av purinerga receptorer), b) 10 mM karbakol i _H2O (agonistav muskarinacetylkolinreceptorn), c) 30 mM Cyclopiazonic syra (CPA) i DMSO (blockerare av den SERCA), d) 50 mM DHPG i PBS (metabotrop glutamatreceptor agonist för mGluR _I och mGluR _5), e) 10 mM glutamat i H ₂ O, f) 1 mM jonomycin i DMSO (jonofor), g) 5 mM thapsigargin i DMSO (hög affinitet blockerare av den SERCA). Förvara alikvoter vid -20 ° C.
5. Lentiviral vektorer: Detta protokoll innefattar användning av lentivirala TED partiklar expressionsvektor. Deras produktion och lagring är inte en del av detta protokoll. Vi använder lentivirala vektorer av andra generationen för överföring av rekombinanta Carboxylesterases till cellinjer, gliaceller och neuroner. Våra lentivirala systemet baser på expressionsvektorn FUGW ^37, och plasmider förpackning pCMVΔR8.91 eller psPAX2 och pseudotypning plasmid pMD2.G ^38,39 VARNING:. Tänk på att arbetet med rekombinanta själv-inaktiverande lentivirusvektorer kräver noggrannBehandling av biosäkerhetskommittéer riktlinjer. I många länder är dessa vektorer klassas som Biohazard riskgrupp 2. För mer information hänvisas till http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Förberedelse och virusinfektion Mouse hippocampus nervceller

1. Tvätta täckglas i ett glas petriskål med 20 cm diameter (100 täckglas per maträtt) 1x i 70% etanol i ca 30 min. Slutligen lägger 100% etanol (pa) i 2 min. Avlägsna kvarvarande etanol och torka täckglasen under en steril huva.
2. Förbered två olika typer av media för hippocampus neuron kulturer: (a) Neurobasal medium med B27 1:50, (b) fullt medium: Neurobasal medium med B27 01:50, Glutamax 1:100 och N2 komplettera 1:100. Sterila filtratet media och förvara dem i cellen inkubator tills användning.
3. En dag före dissektion, är täckglasen framställes genom att först placera en steril 10 mm täckglas i varjebrunn i en 4-brunnars cellodlingsskål. Efteråt försiktigt pälsen varje täckglas med 80-100 l 0,1% Poly-L-lysin och förvara disken i en kuvös över natten.
4. På dagen för dissekering och cellodling, börja med att tvätta täckglasen tre gånger med 100 l HBSS och överföra 100 l Neurobasal medium till varje täckglas. Placera skålarna i en kuvös för jämvikt (t.ex. vid dissektion av möss).

Dissektion

Vi utför våra experiment med möss i enlighet med EU: s riktlinjer, som godkänts av vår Institutional Animal Care och användning kommittén.

5. Ta bort den totala hjärnan och dissekera hippocampi bilateralt.
6. Ta försiktigt bort eventuella hjärnhinnor och andra vävnader än hippocampus och placera en hippocampus var i ett 1,5 ml rör innehållande 450 ul HBSS. Förvara vävnaden på is tills ett tillräckligt antal hippocampi har isolerats.

<p class = "jove_step"> Cell kultur

7. Lägg 50 | il 1% trypsin (Worthington) till varje rör och inkubera dem i en 37 ° C vattenbad i 15 min. Skaka rören ibland. För att stoppa uppslutningsreaktionen, tillsätt 50 | il 1% trypsininhibitor till varje rör och invertera röret flera gånger.
8. Överför all vävnad på upp till 5 hippocampi till ett 15 ml Falcon-rör undviker överföring av vätska. Lägg B27-medium (a) till en slutlig volym av 5 ml.
9. Finfördela vävnaden med en brand polerat Pasteur glas pipett genom att försiktigt pipettera upp och ned VARNING:. Undvik luftbubblor!
10. Snurra med 400 xg under 3 min, aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten i 5 ml B27-medium (a).
11. Triturera vävnaden återigen med glaspipett, och sedan två gånger med hjälp av en 1000 | il plastfiltret dricks. Utför detta enligt steg 2.9 och 2.10.
12. Efter den sista centrifugeringen, resuspendera cellpelleten i 2 ml komplett medium (b) och finfördela celler med en 200 l plastfiltret dricks. Att separera återstående cellklumpar från encelliga fjädring, låt cellklumpar bosätta sig i 1-2 minuter.
13. Räkna celler och beräkna det totala antalet celler som behövs för viral infektion. För TED avbildning använder 25.000 celler per 10 mm täckglas.
14. Plätering ytterligare 25.000 icke-omvandlade celler som en kontroll rekommenderas vid denna punkt.

Viral infektion

15. Överför cellsuspensionen för viral infektion i en ny 15 ml Falcon-rör och centrifugera under 3 min vid 400 x g..
16. Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 300 | il medium (b)
17. Lägg en lämplig mängd av infektiösa lentivirala TED partiklar expressionsvektorsystem och låt falconrör stå vid rumstemperatur under 10 min.
18. Fyll röret med full medium (b) till den slutliga volymen som behövs för plätering (100 l för varje 10 mm täckglas), aspirera mediet från coverslip, och omedelbart placera 100 | il cellsuspension på varje täckglas.
19. Placera skålarna i inkubatorn tills alla celler har lugnat ner (ca 2 h) och fyll upp rätter tills de innehåller 2 ml medium (b).
20. Låt nervceller växer i minst en vecka. Ersätt 50% av mediet varje vecka.

Tre. Kultur och Viral-infektion av Mouse kortikala gliaceller

Framställning

1. Börja genom att förbereda basala Glia medium (01:01 blandning av DMEM/F12 med 10% FCS, 5% HS, 1% penicillin / streptomycin, 0,45% glukos) och överdragning av en T75 cellkultur kolv med 4 ml 0,5 ng / ml Poly -DL-ornitin-hydrobromid (PORN) (utspädd i 150 mM borsyra, pH 8,35). Efter inkubation vid 37 ° C under 2 h eller över natten, tvätta cellodling kolven tre gånger med HBSS och tillsätt 18 ml basal Glia medium innehållande B27 01:50 och 10 ng / ml EGF. Ekvilibrera kolven cellodling i inkubatorn (upp till 3 h).

<p class = "jove_step"> Dissection

1. Vi utför våra experiment med möss i enlighet med EU: s riktlinjer, som godkänts av vår Institutional Animal Care och användning kommittén.
2. Dissekera hjärnan av en P5-P7 mus och ta bort hippocampus och hjärnhinnorna från båda hjärnhalvorna enligt beskrivningen i 2.5.
3. Dissekera frontala cortex, skär den i flera små bitar och samla dem i en 1,5 ml rör innehållande HBSS. Förvara röret på is och fortsätt till cellkulturen delen.

Cellodling

4. Överför all vävnad från röret till en 15 ml Falcon-rör med hjälp av en brand polerat glaspipett.
5. Lägg basalmedium till en slutlig volym av 5 ml och mal sönder vävnaden genom att pipettera flera gånger upp och ned med en brand polerat glas pipett. Efter centrifugering vid 300 xg under 3 min, aspirera mediet, och återsuspendera cellpelleten i 5 ml basmedium.
6. Upprepa steg 3,5 gånger.
7. Efter Third centrifugering, resuspendera cellpelleten i 2 ml basal glia medium innehållande B27 (1:50) och 10 ng / ml EGF.
8. Titruate återigen och överför cellsuspensionen till den preparerade T75 cellodling kolv och låt cellerna växa under 3-4 dagar.

Tvättning av gliaceller (efter 3-4 dagar i kultur):

9. Tvätta cellerna en gång med 10 ml PBS och kraftfullt knacka eller försiktigt slå kolven några gånger med handen, samtidigt som du håller fast den andra sidan. Genom detta steg celldebris och kluster cell avlägsnas från kulturen.
10. Aspirera PBS och tillsätt färsk basala glia medium innehållande B27 (1:50) och 10 ng / ml EGF. Ytterligare odla kulturen i 5-7 dagar tills cellerna når 80% konfluens.

Uppdelning, transduktion och sista sådd av gliaceller:

11. Coat 10 mm täckglas med 100 | il Poly-D-lysin (Stamlösning: 0,1%, späddes 1/50 ad 20 ug / ml i PBS eller HBSS) och inkuberadem i en inkubator över natten. Tvätta täckglas tre gånger med HBSS och tillsätt 100 l basala glia medium. Ekvilibrera täckglas i inkubatorn (3 tim).
12. Tvätta gliaceller två gånger med 10 ml PBS, aspirera PBS och tillsätt 3 ml trypsin (TrypLE, outspädd). Trypsinize celler för upp till 1 minut VARNING:. Undvik att trypsinization. Vanligtvis mer än 80% av alla celler lösgörs efter 1 min och det är tillräckligt för att ha flera miljoner av friska celler.
13. Stoppa reaktionen genom att tillsätta 10 ml basal Glia medium, överför cellsuspensionen till ett 15 ml Falcon-rör, centrifugera vid 300 xg under 3 min. Aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten i 5 ml basal glia medium.
14. Återigen, snurra och aspirera så beskrivs i steg 3,15, sedan återsuspendera celler i 5 ml basala Glia medium.
15. Överför det erforderliga antalet celler till ett 1,5 ml rör. 10 ^{4-2x10 4} gliaceller är tillräckligt för en 10 mm täckglas. Vanligtvis, upphävandet volume att transducera celler för en 4-väl-skålen är mindre än 200 | il. Lägg en lämplig mängd lentivirala TED partiklar expressionsvektorsystem till cellerna och inkubera dem vid RT under 10 min. Fyll sedan upp suspensionen med basala glia medellång till sådd volym (100 l per täckglas).
16. Seed 100 | il av infekterade celler per täckglas och inkubera för ungefär 2 timmar, tillsätt sedan basala Glia medium innehållande B27 01:50 och 10 ng / ml EGF till en slutlig volym av 2 ml.
17. För idealiska odlingsbetingelser använder celler för experiment på dag 3-7 efter plätering.

4. Generation och kultur Reporter cellinje

TED reporter cellinjer etablerades på grundval av HeLa, BHK21, HEK293 och SH-SY5Y. Här ger vi protokollet för HeLa-celler, men protokollet kan överföras till någon annan cellinje också.

Generering av stabila HeLa cellinjen

1. Dela en vild typ HeLa cellinje och överföra 100.000 Cells i en volym av 200 | il till ett 1,5 ml rör.
2. Lägg en lämplig mängd lentivirala TED partiklar expressionsvektorsystem till röret och inkubera cell-virussuspension i 10 min vid RT. Sedan frö av cellerna i en total volym av 2 ml medium (DMEM, 10% FCS, 1% penicillin / streptomycin) i en 30 mm skål och inkubera i 3 dagar.
3. Efter tvättning en gång med PBS, aspirera mediet och tillsätt 500 l trypsin (TrypLE, 2:03 i PBS). Inkubera under ca. 3 min och sedan stoppa reaktionen genom tillsats av 3 ml medium. Överför suspensionen till ett 15 ml Falcon-rör och centrifugera vid 400 xg under 3 min.
4. Resuspendera cellpelleten i 200 ^ medellång och åter infektera cellerna med lentivirala partiklar som beskrivs i 4.2. Sedan, utsäde celler i en T25 cellodling kolv i 10 ml medium.
5. Odla cellerna tills en konfluens av 60-80% uppnås. Sedan dela kulturen.

TED reporter cellinjer

6. TED reporter cellinjer kan upprätthållaed i någon standard medium, t ex DMEM innehållande 5% eller 10% FCS och 1% penicillin / streptomycin används.
7. Plate ett lämpligt antal celler i ett 4-bra maträtt som innehåller sterila 10 mm täckglas (se ovan), t.ex. 10.000 till 20.000 celler per täckglas.
8. Odla cellerna i minst två dagar innan du använder dem för TED avbildning.

Fem. Förberedelse för Live avbildning förfarande vid ett inverterat mikroskop

1. 1. Förvärm HEPES-Ringer till rumstemperatur och tillsätt D-glukos.
   2. Förvärm ACSF (utan Ca ^{2 +} och Mg ^{2 +)} till rumstemperatur och tillsätt D-glukos. Vädra ACSF med karbogen i 5 minuter. Tillsätt sedan en M stamlösningar av _CaCl2 och _MgCl2 till slutkoncentrationer av 2 mM vardera.
2. Starta levande imaging mikroskop och alla datorprogram.
3. Starta perfusion på en "dummy" avbildning kammare och balansera rörsystemet.
4. Förvärm den inline lösningen värmaren och avbildning kammare i mikroskop scenen. Fäst avbildning kammare i ett värme-insats.
5. Jämvikta systemet till 32-37 ° C innan du börjar färgen laddningsproceduren VIKTIGT:. För att undvika oavsiktlig flöde av perfusion lösningen i mikroskop system vi använder hår band runt målen och elastiska ark silikon (1mm) för att skydda mikroskop scenen.

6. Dye Loading av Antingen Celltyp

1. Resuspendera 1 alikvot av Fluo5N-AM (se 1.3) i 100 pl förvärmd imaging lösning (HEPES-Ringer eller ACSF).
2. Solubilisera Fluo5N-AM i bildbehandling lösning (HEPES-Ringer eller ACSF) i en vatten-badsonikator för 90 sek.
3. Använd ett nytt 4 - eller 24-brunnar och överföring 400 l förvärmd bildbehandling lösning till en brunn. Tillsätt färgen lösningen till samma brunn att komma till 500 | il av en 5 | iM lösning.
4. Placera försiktigt ett täckglas med celler (t.ex.10-18 mm i diameter) i brunnen, celler uppåt.
5. Inkubera under en lämplig tidsperiod i en cellkultur inkubator vid 37 ° C (under tiden förbereda avbilda inställningar på mikroskop scenen). Typiska dye-laddningstiderna är för neuroner och gliaceller 7-15 min och för cellinjer 10-20 min.

CRUCIAL: Dye-laddningstid och färgämneskoncentration beror på celltyp, celltäthet, och experiment-specifika behov! Långa inkuberingstider i närvaro av färgämnet kan skada cellerna, speciellt primära neuroner och primära gliaceller och detta är avgörande för den lyhördhet för fysiologiska stimuli. Lång-inkubationstider (t.ex. 30 min) kommer endast att vara användbar för ER experiment kalcium lokalisering för att undersöka fördelningen av ER kalcium i små subcellulära strukturer, t.ex. fina neurites eller ryggar. I vissa experiment, kan en blandning av 1/3 odlingsmedium med bildbehandling lösning bidrar till att skydda cellerna under Fluo5N-AMlastning.

6. Genast överföra täckglas till en annan cell odlingsbrunn innehållande bildbehandling lösning (HEPES-Ringer eller ACSF) och börja montering av cellerna in avbildning kammaren.

7. ER-kalcium Levande cell imaging med en inverterad laserskanning konfokalmikroskop

1. Använd en pensel för att tillämpa hög vakuum fett till en avbildning kammare. Fettet behövs för att fixera täckglas på botten av perfusionskammaren. Vi använder self-made avbildning kammare för 10-12 mm täckglas med en liten volym, vilket möjliggör hög perfusion hastigheter på upp till 15-faldig buffert utbyte per minut. En kommersiellt tillgänglig perfusionskammare för 18 mm täckglas, kan köpas från Warner instrument (RC-49FS). Denna kammare möjliggör också fältstimulering av neuroner.
2. Plocka upp täckglas med Fluo5N-laddade celler och lägg en liten droppe bildbehandling lösning (50-100 l) på cellerna för att hålla cellerna täckta med bildbehandling lösning.Vänd täckglas upp och ned och montera celler till avbildning kammaren. Att trycka på täckglas i kisel-lim, använd en bomullspinne (t.ex. Q-tips).
3. Torka bort resterande buffert från botten av glaset täckglas med bomullspinnar VARNING:. Torka försiktigt bort kvarvarande fukt när du använder en olja-objektiv med hög numerisk apertur för högupplösta bilder. Kvarvarande salt avlägsnas bäst genom vatten. Oavsiktlig utstryk av fett kan avlägsnas med aceton eller ren etanol.
4. Byt ut "dummy" avbildning kammare med den experimentella avbildning kammaren. Tvätta cellerna i 5-10 min med kontinuerlig perfusion.
5. Tvätta cellerna i 5 - 10 min med kontinuerlig perfusion.
6. För cellselektion använda en minimal mängd laserbelysning, höga svephastigheter (2-4 Hz), en liten bildstorlek och en hög förstärkning.
7. VARNING: För val av Fluo5N-märkta celler använder inte överskott av ljus eller direkt belysning med epifluorescent ljus. Ljus belysning av Fluo5N/Ca ^{2 +} komplex orsakar total förlust av ER-specifik fluorescens inom 2-4 sek (Figur 5).
8. Ställ upp Mikroskop enligt den planerade experimentet. För orientering är representativa inställningar för avbildning med olika TED vektorer ges i tabell 1. För inverterad laserskanning konfokalmikroskopi, använder vi en Olympus IX81 mikroskop kombinerat med en Fluoview 1000 konfokalt system som är utrustat med diodlaser (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 mW) och en spektrala detektor-system.
9. I början av experimentet dokumentet cellerna av intresse med högupplösande x, yz bildstaplar.
10. Utför x, yt imaging att övervaka ER kalcium dynamiken i de särskilda experimentella betingelser. Typiska inställningar för vårt system är listade i tabell 2.
11. Övervaka förändringar i ER kalcium under kontinuerlig perfusion med bildbehandling lösning. Typiska buffert växelkurser är exemplarily: (a) cell tvättning och lagra-utarmning av SERCA block: 1,5 ml / min, (b) ATP / DHPG stimulering: 3 ml / min.
12. Förvärva digitala bilder företrädesvis med 12-bitars (4096 gråvärden). För parallell avbildning av Fluo5N/Ca ^{2 +} och RFP, 8-bitars bilder (256 gråvärden) kan rädda ditt system från dataspill.
13. Affär levande cellbilder tidsserie (x, yt) eller 3D-staplar bild (x, yz) (för cellulär fördelning av Fluo5N/Ca ^{2 +-komplex)} i en ImageJ kompatibelt format (t.ex. TIFF).

8. Bildbehandling och dataanalys

1. Öppna bilden stacken i ImageJ programmet. Vid multicolor avbildning, dela RGB-kanalerna då den av ImageJ.
2. Identifiera din region (er) av intresse (ROI) genom en noggrann undersökning av bildstaplar (t.ex. med hjälp av en intensitet som funktion av tiden plot)
3. Använd Time-serien Analyzer plugin för att läsa ut den genomsnittliga pixelintensiteten i en ROI (F _raw). Depending flit, rita ROI runt antingen hela ER eller små regioner i ER t.ex. ER av dendriter av perifera celler regioner. Också omfatta 1-3 ROI i områden utan celler för bakgrundssubtraktion.
4. Beräkna medelvärdet bakgrundsfluorescensen (F _b) genom att beräkna medelvärdet fluorescens värdet av bakgrunden ROI och subtrahera bakgrunden _b-värdet F från F _råvärden att få värdet F _roi.
5. Beräkna F _0, som är den basala fluorescens av cellerna, genom att beräkna medelvärdet av tio till 30 fluorescerande värden för varje ROI i ett vilande tillstånd.
6. Beräkna bakgrund-korrigerade relativa förändringar i fluorescens från AF / F ₀ av formeln:

7. Presentera relativa förändringar i fluorescerarnce som ett spår med AF / F ₀ för Y-axeln och tid för X-axeln.

Representative Results

Detta protokoll ger en icke-störande metod för direkt avbildning av fri ER kalcium. Låg affinitet syntetisk Ca ^{2 +} indikatorer släpps och fångade i ER lumen med hjälp av en riktad ER, rekombinant esteras enzymaktivitet. Förbättrad lastning av ^{Ca2 +} indikatorfärgämnen till ER lumen möjliggör en direkt och snabb avbildning av ER dynamik kalcium butik.

Celltyper för TED

Genomförbarheten av metoden har visat i de cellinjer BHK21, HEK293 ^{34, 17} HeLa, SH-SY5Y, odlade astrocyter ^8,40 och primära hippocampus och kortikala neuroner ^8,34,41. I våra försök fungerar TED bra när TED konstruktioner stabilt uttrycks, helst genom själv-inaktiverande lentivirusvektorer ^37,39 med användning av en relativt svag promotor (t.ex. ubikitinpromotorn) ^35. Andra, starkare promotorer är under utredning.

Lyckad TED lastning med Fluo5N erbjuder en klar och ljus färgning av ER lumen, som skonas från det nukleära området ^34,41. Vid vila påstår, representerar Fluo5N/Ca ^{2 +} komplex etikett lokalisering av kalcium då bunden av Fluo5N därmed representerar den regionala fördelningen av fritt kalcium i ER lumen. I figur 6, ^+-komplex och Tag-RFP-T2 etiketter från Red-CES2 konfokala bilder av Fluo5N/Ca ² visas i HeLa-celler, kortikala astrocyter och hippocampusneuroner. Figur 6C visar den fluorescerande Ca ^{2 +} indikator komplex i cellen kroppen samt neurites av hippocampus nervceller. Detta möjliggör undersökning av ^{Ca2 +-signaler} i ganska små processer (se även ^34,35).

Viss erfarenhet behövs för att särskilja den typiska ER etiketten från en cytosolisk etikett som ska observeras when celler är skadade eller ohälsosamt. Cytosoliska, endogena esteraser frisläpper också Fluo5N, vilket leder till en mycket ljus färgning av cytosolen och kärnan när kalcium läcker genom plasmamembranet. Cytosolisk färgning av Fluo5N/Ca ^{2 +} observeras också när TED-märkta cellerna behandlas med jonoforen jonomycin, i närvaro av extracellulärt kalcium (Figur 7).

Direkt avbildning av kalcium frisättning från ER

En viktig tillämpning av TED är direkt visualisering av ER Store utarmning ^17,34. I figur 8, visar vi ett representativt experiment utfört med hippocampus nervceller, uttrycker Röd-CES2. Nervceller med Red-CES2 berika höga mängder Fluo5N i perinukleära regionen (pilarna i figur 8). När SERCA blockerare CPA appliceras genom perfusion, är en snabb utarmning av ER kalcium Store observeras (Figur 8B). Här presenterar vi deråa värden (y-axel) som erhålls när nervceller avbildade med 12-bit. Imaging betingelser anges i tabell 2. Notera den enorma förändringen i medelfluorescens täthet per ROI som observeras när TED appliceras på nervceller. För andra experiment analyserar ER kalcium release i nervceller som använder TED, skulle vi vilja hänvisa till tidigare experiment, som redan hade diskuterats i detalj ^8,34,35. I korthet är TED in neuron in vitro används för att visualisera SERCA-känsliga ER kalcium butik i detalj genom inverterad konfokala laserskanning mikroskopi ^8,34 och framgångsrikt tillämpats för snabb avbildning (15 Hz) av mGluR1 / 5 inducerade IiCR ^34.

Figur 9 visar ett typiskt experiment med mus kortikala astrocyter in vitro, stimulerad av 200 pM ATP genom perfusionssystemet med låg upplösning med hjälp av en 20x vatten mål. Efter lentiviral infektion, de celler som visas här uttryckte Röd-CES2, som drivs av en ubiquitin-promotor. Scanning hastighet var ~ 2 Hz och båda kanalerna (Fluo5N/Ca ^{2 +} och röda CES2 fusionsprotein) samtidigt avbildades (i linje). I början av experimentet gliaceller visade god infektion med expressionskonstruktionerna och bra laddning med Fluo5N-AM. Den ROI som analyserades är markerade i fig. 9A. En ROI var inställd att mäta bakgrundsfluorescensen (bg), ROI 1-2 mäta fluorescens av kompletta celler, täcker ROI 3 bara ER av cellen och ROI 4 drogs runt om hela synfältet. Strax efter stimulering med ATP fluorescensen hos Fluo5N/Ca ^{2 +} komplexen sjönk abrupt ner på grund av Ca ^{2 +} frisättning från ER. Slutligen, är det ER delvis fyllas med kalcium igen. Samtidigt minskar fluorescensen av RFP kontinuerligt som en följd av svag blekning (figur 9B, undre panelen). Spår som representerar förändringar i fluorescer het intensitet (figur 9C) pekar på en viktig nackdel TED. I många (inte alla) experiment höga halter av Fluo5N-komplex förlorade under stimulering. Som en konsekvens, kom de fluorescensvärdena inte tillbaka till den ursprungliga fluorescens intensitetsnivå.

Figur 10 visar en CES2-infekterad BHK21 cell med hög upplösning, märkt genom Fluo5N/Ca ^{2 +} och stimulerades med ATP. BHK21 celler fungerade som en tidig modell cellsystem för ER kalcium analys ^31. Observera att ER kalciumfrisättning och lagra-påfyllning är visualiseras i fina strukturer av ER tubuli. Strukturerna hade avbildats vid låg hastighet (~ 0,2 Hz), med 512 x 512 pixel, Airy disc 1 inställning för konfokala hål, och med en 63x olja mål.

"/>
Figur 1. Översikt av ER kalcium signalering. ER kalciumfrisättning orsakas av "läcka" kanaler såsom ER intramembrane por komplex Sec61. G-proteinkopplade receptorer (GPCR) stimulerar _IP3 produktion, som sedan orsakar IP _3-inducerad kalciumfrisättning (IiCR). ER kalciumfrisättning avkänns av de STIM komplexen och inducerar store-operated kalciuminträde (SOCE) genom jonkanaler av trp-familjen och / eller Orai kalciumkanaler. Spänningsstyrda kalciumkanaler (Ca _V) medla snabb kalcium-inducerad kalciumfrisättning (CICR) genom ryanodine receptorer (Ryr) antingen genom direkt protein interaktion (skelettmuskulatur) eller fysiologisk interaktion (hjärtmuskelceller, neuroner). Förlusten av ER kalcium dynamiskt räddas genom inverkan av SERCA pumpen (sarkoplasmatiskt-endoplasmatiska nätverket kalcium ATPas).

res.jpg "src =" / files/ftp_upload/50317/50317fig2.jpg "/>
Figur 2. Principen om målinriktad-esteras inducerade färgämnesbelastning (TED). Riktad överuttryck av en karboxylesteras ger en hög esterasaktiviteten (CES2) i ER. Esteraset omvandlar acetoxymethylester färgämnet Fluo5N-AM till en kalcium-känsliga, fluorescerande färg som förblir instängd i ER. Fluo5N har en låg affinitet till kalciumjoner. Därför, under vilobetingelser, är fluorescerande Fluo5N/Ca ^{2 +} komplexen företrädesvis bildas i ER, där kalciumkoncentrationen är ca 1000-faldigt högre än i cytosolen.

Figur 3. Representativa TED vektorkonstruktioner CES2.: Native version av mus CES2. CES2 ^{OPT 43:} ERsignalpeptiden utbyttes och omfattar nu ett intron, medan ER behålla motivet ändrades till den klassiska KDEL-ER lagring och hämtning motiv av lösliga ER-proteiner. En myc taggen ger en epitop för protein detektion med indirekt immunofluorescens märkning och Western blot-analys. Röd-CES2 ^8,43: En röd fluorescerande protein tillsattes rakt bakom aminoterminala signalpeptiden. Röd ^LK CES2 ^43: A glycin-serin-linker har införts för att upprätta ett flexibelt gångjärn mellan RFP och CES2 elementet.

Figur 4. Arbete flöde för direkt ER kalcium avbildning med TED. Cellsuspensioner av primära celler eller cellinjer transduceras med ett virus innehållande en TED expressionskonstruktionen. Celler ympas sedan på coverslips. Vid användning av RFP-CES2 konstruktioner, omvandlade celler kan identifieras med hjälp av röd fluorescens. Target-esteras inducerad färgämnesbelastning utförs genom inkubering av cellerna i en avbildning innehållande en AM-kopplad låg affinitet Ca ^{2 +} indikator, såsom Fluo5N-AM eller Mag-fura2-AM. ER kalcium imaging utförs med ett inverterat laserskanning mikroskop (se protokollet) eller någon annan kompatibel bildenhet. Under levande avbildning cellerna är under kontinuerlig perfusion med en avbildning lösning såsom artificiell cerebrospinalvätska (ACSF). Cell stimulering utförs antingen genom perfusion eller genom lokalt tryck-utmatning.

Figur 5. Stark epifluorescens belysning förstör ER-specifika Fluo5N TED etikett inom några sekunder. Bilderna är från en video, avbildas med en upprätt avbildning mikroskop. Här, gliaceller exprEssing RFP-CES2 laddades med Fluo5N-AM. Först den röda fluorescensen hos en infekterad cell avslöjades med en CCD-kamera. Därefter sträcktes Fluo5N/Ca ^{2 +} signal belysta med en LED-ljuskälla. En första tydlig ER lokalisering av Fluo5N/Ca ^{2 +-komplex} (gula pilar) snabbt förstörs av stark belysning med en 470 LED-ljuskälla och en förskjutning i fluorescens distributionen blir synlig på det kärntekniska området (gula pilar, 12,46 sek).

Figur 6. TED lastning med Fluo5N-AM i olika celltyper Övre panel:. HeLa-celler med stabil RED-CES2 uttryck mittpanelen:. Kortikala astrocyter efter lentiviral transduktion med Red-CES2 Lower Panel:. Hippocampusneuroner med RED-CES2 på DIV 8. Alla celler odlades på täckglas och färgades med Fluo5N-AM som beskrivs i metodavsnittet. Den Fluo5N/Ca ^{2 +} etikett representerar också lokalisering av kalcium när den är bunden till Fluo5N. Skala bar 40 um.

Figur 7. Fluo5N färgämne i cytosolen blir synlig efter ionomycin behandling. Gliaceller infekterades med Red-CES2, märkt med Fluo5N-AM, och behandlades med SERCA-blockerare thapsigargin att utarma ER kalcium. Ionomycin behandling framkallade ett starkt inflöde av extracellulärt kalcium. (Övre panel) celler visar en drastisk ökning av Fluo5N/Ca ^{2 +-medierad} fluorescens. (Nedre fältet) Den genomsnittliga intensitet projektion bild av Fluo5N/Ca ^{2 +-märkningen} visar en typisk cytosolisk märkning av fluorescerande kalcium komplex Blå pil:. En ljust märkt cell indikerar att denna cell har höga halter av kalcium i the cytosolen. Förmodligen är denna cell skadad Lila pil:. Celler blir ljust märkts i cytosolen vid ionomycin behandling.

Figur 8. ER kalcium lagra utarmning i neuroner genom att blockera SERCA. (A) hippocampus neuroner (DIV 9) uttrycker Röd-CES2 (A, röd) och är märkta med Fluo5N-AM (A, grön). Pilarna pekar på två analyserade celler. Bilden (maximal intensitet projektion) är en beskuren del av yxa, yz-bild som förvärvades i början av experimentet. (B) Raw spår representerar ER utarmning kalcium butik efter perfusion med 30 iM CPA. Här 1.000 bilder togs med 1 Hz och 12-bitars. De råa värden medelfluorescensen tätheten per ROI (Y-axeln) av de två cellerna som visas i A ärplottas över tiden (röd och blå spår). Bakgrunden värden (svarta spår) förblir konstant. AU = godtyckliga enheter gråvärden representerar fluorescens densitet.

Figur 9. ER kalciumfrisättning på ATP stimulering av gliaceller. Gliaceller infekterades med Red-CES2 och laddad med Ca ^{2 +} indikator Fluo5N-AM. Cellerna stimulerades med 200 | iM ATP via perfusion i 10 sek. (A) Gliaceller uttrycker Röd-CES2 (mitten) är märkta med Fluo5N-AM (vänster). Den ROI är markerade. (B) Enstaka bilder extraherade från time-lapse-sekvens. (Övre panel) Fluorescensintensiteten är hög på 0 sek och 71 sek innan cellerna reagerar. Det droppar abrupt (80 sek) och når ett minimum vid 86 SEc, är innan det stiger igen (160 sek) som kalcium pumpas tillbaka in i ER. (nedre panelen) minskar långsamt och kontinuerligt över tiden på grund av blekning. Fluorescensintensitet av RFP (C) Tid spår som visar AF / F _0-värden för den ROI som anges i A. fluorescens, vilket indikerar kalciumkoncentrationen, sjunker ner efter ATP-stimulering och delvis återvinner. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 10. Högupplöst avbildning av ATP-inducerad kalcium release i BHK21 celler. Cellerna laddas med Fluo5N-AM och avbildas i närvaro av extracellulärt kalcium. (A) Bild serie som visar förändringar i Fluo5N/Ca ^{2 +-härledda} fluorescens under ATP-stimulering. (B) Genomsnittlig intensitet projektionsbild indikerar ROI visas i C. (C) ATP inducerad kalciumfrisättning och påfyllning av ER kalcium butiken analyseras i små delområden med ER. Spåren representerar förändringar i fluorescens.

Excitation laser [nm]	Detection range [nm]
TED med Red-CES2 vektorkonstruktionerna
473 (Fluo5N/Ca 2 +)	507-545
559 (Tag-RFP-T2)	> 570
TED med CES2 bara vektorkonstruktionerna
473 nm (Fluo5N/Ca 2 +)	> 507

Tabell 1. Inställningar för den spektrala detektor.

Experiment	ER utarmning med en röd-CES2	Stimulering av nervceller med hjälp av en CES2 konstruktion	Hög rumslig upplösning avbildning, CES2
Mål (NA)	20x vatten (0,7)	20x vatten (0,7)	40x oil/63x olja (≥ 1,3)
473 nm Laser
Effekt	1%		1%
HV A	600-780	600-780	400-780
Gain B	0-1%	1-2%	0%
Offset	0	0	0
559 nm Laser
kraft	1%	OptioNALC	optionalC
HV A	600-780	optionalC	optionalC
Gain B	0-1%	optionalC	optionalC
Offset	0	optionalC	optionalC
Scanningshastighet	1-2Hz	Fri körning	Fri körning
Bildstorlek	320x320 pixel	240x240 pixel	512x512 pixel
Scanning typ	I linje	Dubbelriktad	Nyquistcriterion (2 bildpunkter / element)
Stimulering	100-200 iM ATP :5-15 sek, 200-500 iM glutamat för 5-15 sek	100-200 iM Agonist: 5-15 sek
Pinhole	2-5 luftiga skivor	2-5 luftiga skivor	En luftig skiva

Tabell 2. Exempel på mikroskop inställningar enligt den typ av experiment A:. HV = ström till fotomultiplikatom detektorn, B: gain = förstärkning av PMT signalen, C: Tillval: kanalen är fri för användning med andra röda fluorescerande färgämnen (t.ex. CMX-Ros för visualisering av mitokondriell potential) eller andra röda fluorescerande proteiner.

Discussion

Fördelarna och nackdelarna med TED metoden har diskuterats flitigt de senaste publikationerna ^34,35. Jämfört med andra metoder som beskrivs ovan, kringgår TED problemet att störa och perfusion av cellerna. Dessutom två aspekter måste understrykas. Principen om TED för ER kalcium avbildning kräver (1.) Den riktade uttryck för en aktiv karboxylesteras i ER lumen med hjälp av TED vektorkonstrukt och (2.) En effektiv och förmånlig frisättning av låg affinitet syntetiska AM-estrar av kalcium färgämnen i ER lumen.

Ett. TED vektorkonstruktionerna

Figur 3 sammanfattar utvecklingen av TED vektorkonstrukt. TED har utvecklats på grundval av CES familj proteiner (EC 3.1.1.1). Dessa proteiner är bosatta medlemmar i ER lumen. För in vitro-studier på rekombinanta administrering av CES proteiner fungerar bäst efter stabilt uttryck avprotein eller efter virusinfektion med måttliga expressionsnivåer. I dagsläget är det okänt om andra proteiner med esterasaktivitet kan ersätta CES proteiner för TED avbildning. Det rekommenderas inte att använda transient transfektion av TED vektorer för dynamisk ER kalcium analys eftersom cellerna är mindre känsliga efter transfektionsförfarandet. CES proteiner behöver ordentlig inriktning till ER lumen och det här steget behöver en effektiv klyvning av ER signalpeptiden. Dessutom är kvarhållande och hämtning av CES proteiner i ER lumen medieras av deras aminoterminal KDEL-liknande motiv. Dessa mekanismer kan vara mättad när höga uttryck nivåer produceras av TED vektorer efter transient transfektion. Detta kan orsakar en falsk lokalisering av CES-proteiner och stöder bildandet av proteinaggregat.

2. Låg affinitet ^{Ca2 +} Indikatorer för TED

Den viktigaste nackdelen med TED orsakas av begränsningar i tillgängligkunna indikatorfärgämnen för icke-störande analys av ER kalcium. ER kalcium avbildning med TED kräver indikatorfärgämnen med en hög K _D (vilket betyder en låg affinitet) och en låg fluorescens i frånvaro av kalcium. Basera på vår erfarenhet Fluo5N-AM fungerar bäst, men detta indikatorfärgämnet inte blekmedel-resistent. Den låg affinitet ^{Ca2 +} indikatorer Mag-fura2-AM (K _D ~ 25-50 iM) ³⁴ och Mag-Fluo4 (K _D ~ 20-25 iM) testades också. Båda färgämnen är väl laddad i ER strukturer från TED, men risken för att producera "blandade signaler" vid stimulering av ER utgåvan är hög. En "mixed signal" representerar först en snabb ökning av fluorescens i cytosolen följt av minskning av fluorescens i ER. För att övervinna denna begränsning, kan störande metoder för ER kalcium avbildning hjälpa ^32,35. Mag-Fluo4 (K _D ~ 20-25 iM) visar en stark TED-medierad etikett Golgi cisternae, vilket är mindre uttalad när Fluo5N-är jags används.

Program och framtidsutsikter

Här fokuserar vi på inverterad laserskanning konfokala analys av ER kalcium dynamik med Ted. TED mätningar kan också anpassas till alla vanliga konfokala systemet eller brett fält systemet med lämplig excitationskällan (laser, LED, metall Halid lampor, monokromatorn), filter och fluorescensdetektering systemet ^6.

TED är särskilt användbart i de celler som inte uttrycker tillräcklig endogen CES aktivitet i ER. Vi observerade att t.ex. BHK21 celler ger tillräcklig endogen esterasaktiviteten i ER att släppa lågaffinitets indikatorer. I våra händer, är detta inte fallet med många andra cellinjer (HEK293, SH-SY5Y, HeLa, PC12), primär glia, och primära neuroner. Här möjliggör TED metoden en framgångsrik icke-störande färgämnesbelastning till ER.

Framtida TED vektorer kan utsträckning sin ansökan från ER lumen tillandra subcellulära fack eller cellulära mikrodomäner. Principen för TED metoden är oberoende av indikatorfärgämnet, och kan därför användas med AM-ester av något färgämne, t.ex. för avbildning av intracellulära pH-dynamik. Nyligen beskrev laboratoriet för Lukas D. Lavis att den rekombinanta svinleveresteras (PLE) CES1 bildar en selektiv esterasalstrande ester par med cyclopropylester färgämnen ^42. Cyclopropylester agenter befanns vara resistent mot hydrolys av endogena esteraser och den selektiva avslöjande av den rekombinanta CES aktiverat aktivitet cellspecifik molekyl targeting ^42. Det ska bli intressant att undersöka om kalciumindikatorer basera på den nya tekniken kommer att förbättra den subcellulära inriktning specificitet syntetiska indikatorer.

TED fungerar bäst i cellinjer när TED proteiner uttrycks stabilt. Inrättandet av en samling med stabila TED cellinjer skulle vara fördelaktigt.

Transgena TED musmodeller är också ett viktigt mål för vårt arbete och det kommer att göra det möjligt för TED i specifika vävnader preparat från specifika neuronala kretsar, skelettmuskel, hjärta, eller beredningar av kärlsystemet. Denna musmodell kommer att bidra till att överföra analysen av ER kalcium dynamik från cellnivå till mer fysiologisk vävnad sammanhang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycine)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, ATP disodium salt hydrate	Sigma	A26209-1G
B-27 supplement,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholine chloride (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonic acid (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM with Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco's PBS without Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fetal calf serum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μg	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham's F12 nutrients mixture	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) without Ca,without Mg, with Phenol Red, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Horse serum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ salt	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasal medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, low UV absorbance,2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-ornithine hydrobromide PORN	Sigma	P8638
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor from Glycine MAX (soybean)	Sigma	T6522
Materials
Confocal system: inverted laser scanning microscope: FV1000 with IX81	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: laser combiner FV10 and diode lasers (405, 473, 559, 635)	Olympus		user-specific configuration
Confocal system: scan head FV10-SPD with spectraldetector	Olympus		user-specific configuration
Heater controller TC-344B	Warner Instruments	64-0101	to control in line solution heater
NIH ImageJ software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Objective: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Objective: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Objective: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusion chamber, inverse	custom-made
Perfusion chamber, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusion tube: PT-49	Warner Instruments	64-1730	for perfusion
Peristaltic pump MiniPlus 3 (4 channels)	Gilson	n.a.	perfusion pump
Single inline solution heater SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controlled by heater controller
Suction tubes: ST3R	Warner Instruments	64-1407	for perfusion
Heating insert: Tempocontrol 37-2 digital 2-channel	Pecon	n.a.