Mätning av glomerulär filtrationshastighet (GFR) är den gyllene standarden för njurfunktionen bedömning. Här beskriver vi en hög genomströmning metod som medger bestämning av GFR hos vakna möss genom användning av en enda bolusinjektion, bestämning av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-inulin i plasma och beräkning av GFR med två fas exponentiell avklingning modell.
Mätningen av glomerulär filtrationshastighet (GFR) är den högsta standarden inom njurfunktion bedömning. För närvarande utredare bestämma GFR genom att mäta nivån av den endogena biomarkör kreatinin eller exogent applicerad radioaktiv märkt inulin (3 H eller 14 C). Kreatinin har den betydande nackdelen att proximala tubulära sekretion står för ~ 50% av totala renala kreatinin i urinen och därför kreatinin är inte en pålitlig GFR markör. Beroende på det utförda experimentet, kan inulin clearance bestämmas genom en intravenös bolusinjektion eller kontinuerlig infusion (intravenös eller osmotisk minipump). Båda tillvägagångssätten kräver insamling av plasma eller plasma och urin, respektive. Andra nackdelar med radioaktivt märkt inulin inkluderar användning av isotoper, tidskrävande kirurgisk beredning av djuren, och kravet på en terminal experiment. Här beskriver vi en metod som använder en enda bolusinjektion påfluoresceinisotiocyanat-(FITC) märkt inulin och mätning av dess fluorescens i 1-2 il utspädd plasma. Genom att tillämpa en tvåkompartmentmodell, med 8 blodsamlingar per mus, är det möjligt att mäta GFR i upp till 24 möss per dag med en särskild arbets-flöde protokollet. Denna metod kräver endast korta isoflurananestesi med alla blodprover samlas in i ett icke-återhållsam och vaken mus. En annan fördel är att det är möjligt att följa möss under en period av flera månader och behandlingar (dvs. göra parade experiment med kostförändringar eller program läkemedel). Vi hoppas att denna teknik för mätning GFR är användbar för andra forskare studerar funktion mus njure och kommer att ersätta mindre noggranna metoder för att skatta njurfunktionen, såsom plasma kreatinin och urea.
Hastigheten för bildning av plasma ultrafiltrat glomerulus har blivit grunden för utvärdering njurfunktion (glomerulär filtrationshastighet, GFR). Den idealiska markör för att bestämma GFR bör filtreras fritt, varken utsöndras eller resorberas och inte metaboliseras. Ett sådant beteende befanns vara sant för inulin, och inulin clearance har blivit en gyllene standarden för bestämning av GFR 3. Medan clearance av kreatinin i stor utsträckning används som ett mått på GFR hos människor och djur, uppfyller kreatinin inte kraven för en ideal GFR markör. Omkring 10 – 40% av kreatininclearance hos människa är en följd av aktiv tubulär sekretion 1, 11, och renal utsöndring av kreatinin är också framträdande i möss och råttor 4, 7, 9, 22. Nedsatt njurfunktion är känt för att öka den tubulära utsöndringen av kreatinin vilket begränsar dess värde som en markör av GFR 1, 2. Vi har tidigare visat att ekologiska isoform anjontransportör3 (OAT3) bidrar till murina nedsatt kreatinin sekretion 22. Emellertid kräver inulin clearance typiskt användningen av radioaktivt märkt inulin (3 H eller 14 C). Den radioaktiva bestämning av inulin kan användas i både sövda och medvetna möss, men hyser nackdelarna med många säkerhetsföreskrifter och strikta frågor hantering inneboende med användning av radioaktiva isotoper. Längs dessa linjer, kirurgiska clearance preparat för bestämning av GFR är tidskrävande samt terminal i naturen. I 1999 Lorenz et al. 12 introducerade FITC-inulin som en markör för enstaka nefron GFR i bedövade möss. Fem år senare Qi et al. 15 bestäms hel njure GFR hos vakna möss genom att använda FITC-inulin. Alternativa protokoll använder nu FITC-inulin som en exogen markör för att mäta GFR i medvetna och sövda möss. Dessa protokoll behåller känsligheten av radioaktivt inulin genom fluorescens detectipå och kringgå nackdelarna med att arbeta med en märkt radioaktiv markör. Den FITC-inulin analysen modifierad av andra 7, 8 och oss 22, 23 för att dra nytta av den microvolume förmåga NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Detta gör det möjligt att minska den totala provvolymen som behövs för att <100 | il blod per GFR mätning.
Med förfarandet och hög kapacitet protokollet tillhandahållet i denna publikation visar vi möjligheten att mäta GFR i upp till 24 medvetna möss per dag. Denna teknik kan vara till nytta för andra forskare studerar murina GFR och vi hoppas att det kommer att ersätta mindre exakta metoder som index för njurfunktion såsom kreatinin och urea.
Den aktuella studien beskriver en teknik för bestämning av GFR hos vakna möss genom en enda-bolusinjektion och analys av fluorescens i 8 blodprov genom två-fas exponentiell avklingning. En GFR mätning i en mus tar 75 min. Genom att använda en speciell flödesschema, är det möjligt att mäta GFR av sex möss i 130 min. Det är möjligt att upprepa detta flödesschema protokoll upp till 4 gånger per dag och mäta GFR i 24 möss. Vi ändrade denna metod så att det är möjligt att samla in blod från en liten svans klipp istället svansvenen punktering, som är snabbare och enklare för forskare att utföra jämfört med svans venpunktion. Genom att använda 10 ^ il hematokrit kapillärer och en 1:10 spädning, är det möjligt att minska den totala mängden blod som behövs till <100 | il. Slutligen fluorescens mäts med en NanoDrop 3300 fluorospectrometer, vilket möjliggör bestämning av fluorescens i 1-2 il utspätt prov. Denna metod kommer att ge berörda investigatora sann GFR värde. Däremot kreatinin mätningar i möss har flera svagheter inklusive "kreatinin blinda sortiment" och svårigheter i samband med specifika och känsliga beslutsamhet. Den "kreatinin blinda område" begränsar dess funktion som en markör för GFR eftersom serumkreatinin kvar i det normala intervallet fram till 50% av njurfunktionen förlorat 19. Sedan flera forskare använder genetiskt modifierade möss i sin forskning att studera renal fysiologi och patofysiologi, bär det följande problem: antar en knockout-mus av genen X skulle ha en betydligt lägre GFR (med 40%) jämfört med en vild-typ mus, ett enkel screening genom att jämföra plasma kreatinin skulle inte detektera denna skillnad. Behovet av en bra exakt metod för bestämning GFR blir mer kritisk ju mindre skillnaderna i GFR blivit.
Möss har höga halter av icke-kreatinin chromagens i sin plasma och urin som stör handelntillgängliga kreatinin analyser. Som en följd av analyser som är baserade på den alkaliska pikrat Jaffé reaktion överskattning kreatinin koncentration i plasma jämfört med högupplösande vätskekromatografi (HPLC) bestämning 6, 13. En annan begränsning är att serumkreatinin ligger under detektionsgränser flera kommersiellt tillgängliga analyser jämfört med HPLC-bestämning. Men genom att använda enzymatiska reaktioner utredare kunde bestämma plasmakreatinin hos möss 10, 22.
GFR i ett liknande område hittades i medvetna möss med användning av en jämförbar enda bolusinjektion metoden samt urin FITC-inulin clearance 14. I kontrast till deras protokoll, kräver våra protokoll med svans klipp inte särskilda försiktighetsåtgärder för att bevara fartyget integriteten jämfört med svansven eller safenusvenen punktering. För urin / plasma baserad FITC-inulin clearance är det nödvändigt att kirurgiskt implantera två osmotiska minipumps. Två pumpar är nödvändiga för att uppnå tillräckligt höga steady-state plasmakoncentrationen FITC-inulin koncentrationer som är tydligt från bakgrunden. Detta kräver också användning av metaboliska burar för en komplett och tidsbestämda urin samling. Burarna måste sköljas att redovisa en förlust på 25-37% av FITC-inulin, vilket annars sker utan sköljning.
De fallgropar med att använda denna FITC-inulin metod är begränsade. Utredarna bör vara medveten om följande: (i) säkerställa att det inte finns några luftbubblor i sprutan som används för injektion av FITC-lösningen, måste (ii) fullständig retrobulbär injektion uppnås eftersom mängden injicerat bestämmer beräknat GFR, och ( iii) möss kommer sannolikt urinera under 75 min GFR experiment, så undvika att kontaminera blodprov med urinen, vilket kommer att ha en mycket hög FITC-inulin koncentration som en följd av njurarna koncentrationsförmåga.
Allmänna fördelar of detta FITC-inulin metod innefattar följande: (i) Den är en icke-radioaktiv teknik, (ii) det är möjligt att upprepa mätningar flera gånger i samma mus, (iii) analys kan utföras i medvetna möss, ( iv) ingen urinsamlingen krävs, och (v) en hög genomströmning alternativ kan utnyttjas. Nackdelar för bolusinjektion är behovet av dialys av FITC-inulin, som kan övervinnas med hjälp av en bättre FITC-markör, FITC-sinistrin, som är tillgänglig nu och kan mätas transkutant med en speciell miniatyriserad enhet 18. Även om GFR mäts, är det inte möjligt att mäta bråkdelar utsöndringar av vätska eller joner med denna metod.
Sammantaget ger denna metod det är möjligt att en hög genomströmning förfarande för mätning av GFR i medvetna möss. Således kan denna teknik vara av intresse för andra forskare som är intresserade av att bestämma njurfunktionen hos möss.
The authors have nothing to disclose.
Jag tackar Dr Jessica Dominguez Rieg för kritisk läsning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), en Carl W. Gottschalk forskningsstipendium för American Society of Njurmedicin, National Institute of Diabetes and Digestive och njursjukdomar O'Brien Center for Acute Kidney Injury Research ( P30DK079337), och Department of Veterans Affairs.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |