Måling af glomerulære filtrationshastighed (GFR) er den gyldne standard for nyrefunktionen vurdering. Her beskriver vi en high-throughput metode, der tillader bestemmelse af GFR i bevidste mus ved hjælp af en enkelt bolusinjektion, bestemmelse af fluoresceinisothiocyanat (FITC)-inulin i plasma og beregning af GFR ved en tofaset eksponentiel henfald model.
Målingen af glomerulære filtrationshastighed (GFR) er guld standard i nyrefunktionen vurdering. I øjeblikket efterforskere bestemme GFR ved at måle niveauet af det endogene biomarkør kreatinin eller eksogent anvendt radioaktivt mærket inulin (3H eller 14C). Kreatinin har den betydelige ulempe, at proximale tubulære sekretion udgør ~ 50% af den totale renale kreatinin udskillelse og dermed kreatinin ikke er en pålidelig GFR markør. Afhængig af den udførte eksperimentet kan inulin clearance bestemmes ved en intravenøs bolusinjektion eller kontinuerlig infusion (intravenøs eller osmotisk minipumpe). Begge tiltag kræver indsamling af plasma eller plasma og urin, hhv. Andre ulemper ved radioaktivt mærkede inulin omfatter brug af isotoper, tidskrævende kirurgisk forberedelse af dyrene, og kravet om en terminal eksperiment. Her beskriver vi en fremgangsmåde, der anvender en enkelt bolusinjektion affluoresceinisothiocyanat-(FITC)-mærket inulin og måling af dets fluorescens i 1-2 pi fortyndet plasma. Ved at anvende en to-kompartment model, med 8 blod samlinger pr mus, er det muligt at måle GFR i op til 24 mus pr dag ved hjælp af en særlig work-flow-protokol. Denne metode kræver kun kortvarig isofluran anæstesi med alle de blodprøver, der er indsamlet i en ikke-tilbageholdende og vågen mus. En anden fordel er, at det er muligt at følge mus over en periode på flere måneder og behandlinger (dvs. gøre parrede eksperimenter med kostomlægning eller narkotika programmer). Vi håber, at denne teknik for måling GFR er nyttigt at andre forskere studerer musen nyrefunktion og vil erstatte mindre præcise metoder til estimering nyrefunktionen, såsom plasma kreatinin og urinstof.
Satsen for dannelse af plasmaultrafiltrat ved glomerulus er blevet grundlaget for at vurdere nyrefunktionen (glomerulær filtrationsrate, GFR). Den ideelle markør til at bestemme GFR bør filtreres frit, hverken secerneres eller reabsorberes og metaboliseres ikke. En sådan adfærd viste sig at være sandt for inulin, og inulin clearance er blevet en gold standard for bestemmelse af GFR 3.. Hvorimod clearance af creatinin udstrakt grad bruges som et mål for GFR hos mennesker og dyr, er kreatinin ikke opfylder kravene i en ideel GFR markør. Omkring 10 – 40% af kreatininclearance hos mennesker er konsekvensen af aktiv tubulær sekretion 1, 11, og renal udskillelse af kreatinin er også fremtrædende i mus og rotter 4, 7, 9, 22. Renal dysfunktion vides at forøge den tubulære udskillelse af kreatinin, hvilket begrænser dens værdi som en markør for GFR 1, 2. Vi har tidligere vist, at organisk aniontransporter isoform3 (OAT3) bidrager til murine renal kreatinin sekretion 22.. Men inulin clearance typisk kræver brug af radioaktivt mærket inulin (3H eller 14C). Den radioaktive bestemmelse af inulin kan anvendes i både bedøvede og bevidst mus, men rummer ulemperne ved talrige sikkerhedsbestemmelser og strenge betjening.De er forbundet med brugen af radioaktive isotoper. Langs disse linjer, er kirurgiske clearance forberedelser til bestemmelse af GFR tidskrævende samt terminal i naturen. I 1999 Lorenz et al. 12. introducerede FITC-inulin som en markør for enkelt nephron GFR i bedøvede mus. Fem år senere Qi et al. 15. bestemmes hel nyre GFR i bevidste mus ved hjælp af FITC-inulin. Alternative protokoller er nu ved hjælp FITC-inulin som en udefrakommende markør til måling af GFR i bevidste og bedøvede mus. Disse protokoller bevarer følsomheden af radioaktivt inulin ved hjælp fluorescens detectipå og omgå ulemperne ved at arbejde med et radioaktivt mærket markør. FITC-inulin assay blev modificeret af andre 7, 8 og os 22, 23 for at tage fordel af den microvolume evne til NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Dette gør det muligt at reducere den samlede prøvevolumen nødvendig til <100 ul blod per GFR måling.
Med metoden og high throughput-protokol i denne publikation, viser vi muligheden for måling GFR i op til 24 bevidste mus per dag. Denne teknik kan være nyttige for andre efterforskere studerer murine GFR, og vi håber, at det vil erstatte mindre nøjagtige metoder som indeks for nyrefunktionen, såsom kreatinin og urinstof.
Den foreliggende undersøgelse beskriver en teknik til bestemmelse af GFR i bevidste mus ved en enkelt bolus-injektion og analyse af fluorescens i 8 blodprøver ved tofaset eksponentiel henfald. En GFR måling i 1 mus tager 75 min. Ved hjælp af en speciel rutediagram, er det muligt at måle GFR af 6 mus i 130 min. Det er muligt at gentage denne blokdiagrammet protokol op til 4 gange om dagen og måle GFR i 24 mus. Modificerede vi denne metode, således at det er muligt at opsamle blod fra en lille hale klip snarere end halevene punktering, der er hurtigere og lettere for efterforskerne at udføre i forhold til halevenen punktering. Ved hjælp af 10 pi hæmatokrit kapillærer og en 1:10 fortynding, er det muligt at reducere den samlede mængde blod er nødvendig for at <100 gl. Endelig fluorescens måles ved hjælp af en NanoDrop 3300 fluorospectrometer, som tillader bestemmelse af fluorescens i 1-2 pi fortyndet prøve. Denne metode vil give de interesserede investigatora sande GFR værdi. I modsætning hertil har kreatinin målinger i mus flere svagheder, herunder "kreatinin blind høns" og vanskeligheder i forbindelse med specifik og følsom beslutsomhed. Den "kreatinin blind range" begrænser sin funktion som en markør for GFR fordi serumkreatinin forbliver i normalområdet, indtil 50% af nyrefunktionen er tabt 19. Da flere efterforskere udnytte genetisk modificerede mus i deres forskning at studere renal fysiologi og patofysiologi, dette er forsynet med følgende problem: under forudsætning af en knockout mus gen X ville have en betydeligt lavere GFR (med 40%) i forhold til en vildtype-mus, en simpel screening ved at sammenligne plasma kreatinin ikke ville opdage denne forskel. Behovet for en god præcis metode GFR bestemmelse bliver mere kritisk mindre forskelle i GFR blive.
Mus har høje koncentrationer af ikke-kreatinin chromagens i deres plasma og urin, der interfererer med kommercielttilgængelige kreatinin assays. Som en konsekvens, sammenlignet assays, der er baseret på den alkaliske picrat Jaffé reaktion overvurdering kreatinin koncentration i plasma med højtydende væskekromatografi (HPLC) bestemmelse 6, 13. En anden begrænsning er, at serumkreatinin er under detektionsgrænsen for flere kommercielt tilgængelige assays sammenlignet med HPLC-bestemmelse. Men ved hjælp af enzymatiske reaktioner efterforskere var i stand til at bestemme plasma kreatinin i mus 10 22..
GFR i en række lignende blev fundet i bevidste mus på en sammenlignelig enkelt bolusinjektion metode samt urin FITC-inulin clearance 14. I modsætning til deres protokol, er vores protokol hjælp hale snip ikke kræver særlige forholdsregler for at bevare skibet integritet i forhold til hale vene eller saphenavene punkterer. For urin / plasma baseret FITC-inulin clearance er det nødvendigt at kirurgisk implantere to osmotisk minipumps. To pumper er nødvendige for at opnå høje nok steady-state plasma FITC-inulin koncentrationer, der klart adskiller sig fra baggrunden. Dette kræver også brug af metaboliske bure for en komplet og tidsbestemte urinopsamling. Burene skal skylles at tage højde for et tab på 25-37% af FITC-inulin, som ellers forekommer uden skylning.
Faldgruberne ved at bruge denne FITC-inulin metode er begrænsede. Efterforskere skal være opmærksom på følgende: (i) sikre, at der ikke er nogen luftbobler i sprøjten anvendes til injektion af FITC-løsningen, skal (ii) komplet retrobulbær injektion opnås på grund den injicerede mængde bestemmer den beregnede GFR og ( iii) mus vil sandsynligvis urinere i 75 min GFR eksperiment, så undgå forurening blodprøver med urin, som vil have en meget høj FITC-inulin koncentration som følge af nyrerne koncentrationsevne.
Generelle fordele of denne FITC-inulin-metode omfatter følgende: (i) det er en ikke-radioaktiv teknik, (ii) at det er muligt at gentage målingerne flere gange på samme mus, (iii) assayet kan udføres i bevidste mus, ( iv) ingen urin samling er påkrævet, og (v) en high-throughput option kan udnyttes. Ulemper for den fælles bolusinjektion omfatte behovet for dialyse af FITC-inulin, som kan overvindes ved hjælp af en bedre FITC-markør, FITC-sinistrin, som er tilgængelig nu, og kan måles transcutant hjælp af en speciel miniaturiseret anordning 18. Selvom GFR måles, er det ikke muligt at måle brøkdele ekskreter af væske eller ioner med denne metode.
Tilsammen denne metode giver muligheden for en high-throughput metode til måling af GFR i bevidste mus. Således kan denne teknik være af interesse for andre forskere, der er interesseret i at bestemme nyrefunktion hos mus.
The authors have nothing to disclose.
Jeg takker Dr. Jessica Dominguez Rieg for kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), et Carl W. Gottschalk Research Grant i American Society of Nefrologisk, National Institute of Diabetes og Digestive og nyresygdomme O'Brien Center for akut nyreskade Research ( P30DK079337) og Department of Veterans Affairs.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |