Glomerular निस्पंदन दर (GFR) का मापन गुर्दे समारोह के मूल्यांकन के लिए स्वर्ण मानक है. यहाँ हम एक दो चरण घातीय क्षय मॉडल के आधार पर प्लाज्मा और जीएफआर की गणना में एक ही सांस में इंजेक्शन, fluorescein आइसोथियोसाइनेट के निर्धारण (FITC) inulin का उपयोग करके जागरूक चूहों में जीएफआर के निर्धारण की अनुमति देता है जो एक उच्च throughput विधि का वर्णन है.
glomerular निस्पंदन दर (GFR) की माप के गुर्दे समारोह के मूल्यांकन में स्वर्ण मानक है. वर्तमान में, जांचकर्ताओं अंतर्जात biomarker के क्रिएटिनिन या exogenously लागू रेडियोधर्मी लेबल inulin (3 एच या 14 सी) के स्तर को मापने के द्वारा जीएफआर निर्धारित करते हैं. क्रिएटिनिन ~ 50 कुल गुर्दे क्रिएटिनिन उत्सर्जन का% और इसलिए क्रिएटिनिन के लिए समीपस्थ ट्यूबलर स्राव खातों एक विश्वसनीय जीएफआर मार्कर नहीं है कि पर्याप्त कमी है. प्रदर्शन प्रयोग पर निर्भर करता है, inulin निकासी एक अंतःशिरा ही सांस में इंजेक्शन या निरंतर प्रेरणा (नसों या आसमाटिक minipump) द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. दोनों दृष्टिकोण क्रमशः, प्लाज्मा या प्लाज्मा और मूत्र के संग्रह की आवश्यकता होती है. रेडियोधर्मी लेबल inulin के अन्य कमियां आइसोटोप का उपयोग, पशुओं का समय लेने वाली शल्य चिकित्सा की तैयारी, और एक टर्मिनल प्रयोग की आवश्यकता शामिल हैं. यहाँ हम का एक ही सांस में इंजेक्शन का उपयोग करता है जो एक विधि का वर्णनfluorescein आइसोथियोसाइनेट-(FITC) लेबल inulin और पतला प्लाज्मा 1-2 μl में अपनी प्रतिदीप्ति की माप. माउस प्रति 8 रक्त संग्रह के साथ, एक दो डिब्बे मॉडल को लागू करके, यह एक विशेष कार्य प्रवाह प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रति दिन 24 चूहों में जीएफआर के लिए उपाय करने के लिए संभव है. यह पद्धति केवल एक गैर रोका और जाग माउस में एकत्र की जा रही सभी रक्त के नमूनों के साथ संक्षिप्त isoflurane संज्ञाहरण की आवश्यकता है. एक और लाभ यह है कि यह कई महीनों और उपचार (यानी आहार में परिवर्तन या दवा अनुप्रयोगों के साथ रखा प्रयोग कर) की अवधि में चूहों का पालन करने के लिए संभव है. हम माप जीएफआर की इस तकनीक माउस गुर्दे समारोह के अध्ययन के अन्य जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी है और ऐसे प्लाज्मा क्रिएटिनिन और रक्त यूरिया नाइट्रोजन के रूप में गुर्दे समारोह, आकलन से कम सही तरीके बदल देगा उम्मीद है.
ग्लोमेर्युल्स में प्लाज्मा अल्ट्राफिल्ट्रेट के गठन की दर गुर्दे समारोह (glomerular निस्पंदन दर, जीएफआर) के मूल्यांकन के लिए आधार बन गया है. जीएफआर निर्धारित करने के लिए आदर्श मार्कर आज़ादी, फ़िल्टर स्रावित या reabsorbed न तो और metabolized नहीं किया जाना चाहिए. इस तरह एक व्यवहार inulin के लिए सच हो पाया था, और inulin निकासी जीएफआर 3 के निर्धारण के लिए एक सोने का मानक बन गया है. क्रिएटिनिन की निकासी बड़े पैमाने पर मानव और जानवरों में जीएफआर के एक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है जबकि, क्रिएटिनिन एक आदर्श जीएफआर मार्कर की आवश्यकताओं को पूरा नहीं करता है. लगभग 10 – मनुष्य में क्रिएटिनिन की मंजूरी के 40% सक्रिय ट्यूबलर स्राव 1, 11 का परिणाम है, और क्रिएटिनिन का गुर्दे स्राव भी चूहों और चूहों 4, 7, 9, 22 में प्रमुख है. वृक्क रोग जीएफआर 1, 2 के एक मार्कर के रूप में अपने मूल्य सीमा है, जो क्रिएटिनिन की ट्यूबलर स्राव बढ़ जाता है. हम पहले कि जैविक आयनों ट्रांसपोर्टर isoform से पता चला है3 (OAT3) murine गुर्दे क्रिएटिनिन स्राव 22 के लिए योगदान देता है. हालांकि, inulin मंजूरी आम तौर पर रेडियोधर्मी लेबल inulin (3 एच या 14 सी) के उपयोग की आवश्यकता है. inulin के रेडियोधर्मी दृढ़ संकल्प anesthetized और होश दोनों चूहों में प्रयोग किया जाता है, लेकिन कई सुरक्षा नियमों और रेडियोधर्मी आइसोटोप के उपयोग के साथ निहित सख्त से निपटने के मुद्दों का नुकसान बंदरगाहों किया जा सकता है. उन पंक्तियों के साथ, जीएफआर के निर्धारण के लिए शल्य चिकित्सा की निकासी की तैयारियाँ समय लेने के साथ ही प्रकृति में टर्मिनल हैं. 1999 में लोरेन्ज एट अल. 12 anesthetized चूहों में एक नेफ्रॉन जीएफआर के एक मार्कर के रूप FITC-inulin की शुरुआत की. पांच साल बाद क्यूई एट अल. 15 FITC-inulin का उपयोग करके जागरूक चूहों में पूरे गुर्दे जीएफआर निर्धारित की. वैकल्पिक प्रोटोकॉल अब जागरूक और anesthetized चूहों में जीएफआर को मापने के लिए एक exogenous मार्कर के रूप FITC-inulin के प्रयोग कर रहे हैं. इन प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति detecti का उपयोग करके रेडियोधर्मी inulin के संवेदनशीलता को बनाए रखनेपर और एक रेडियोधर्मी लेबल मार्कर के साथ काम करने का नुकसान circumventing. FITC-inulin परख NanoDrop 3300 fluorospectrometer की microvolume क्षमता का लाभ लेने के लिए दूसरों 7, 8 और हमें 22, 23 के द्वारा संशोधित किया गया था. इस जीएफआर माप प्रति <100 μl रक्त की जरूरत के लिए कुल नमूना मात्रा को कम करने की अनुमति देता है.
विधि और इस प्रकाशन में प्रदान की उच्च throughput प्रोटोकॉल के साथ, हम प्रति दिन 24 सचेत चूहों में मापने जीएफआर की व्यवहार्यता का प्रदर्शन. इस तकनीक murine जीएफआर का अध्ययन अन्य जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है और हम इसे ऐसे क्रिएटिनिन और रक्त यूरिया नाइट्रोजन के रूप में गुर्दे समारोह के लिए सूचकांक के रूप में कम सटीक तरीकों को बदल देगा उम्मीद है.
वर्तमान अध्ययन दो चरण घातीय क्षय द्वारा 8 रक्त के नमूनों में रोशनी की एक सांस में इंजेक्शन और विश्लेषण द्वारा सचेत चूहों में जीएफआर के निर्धारण के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है. 1 माउस में एक जीएफआर माप 75 मिनट लगते हैं. एक विशेष प्रवाह चार्ट का उपयोग करके, यह 130 मिनट में 6 चूहों की जीएफआर मापने के लिए संभव है. यह प्रति दिन 4 बार इस प्रवाह चार्ट प्रोटोकॉल को दोहराने और 24 चूहों में जीएफआर मापने के लिए संभव है. यह तेज और जांचकर्ताओं पूंछ नस पंचर की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए आसान है, जो एक छोटे पूंछ कटाव बजाय पूंछ नस पंचर, से रक्त एकत्रित करने के लिए संभव है कि इसलिए हम इस पद्धति को संशोधित किया. 10 μl हेमाटोक्रिट केशिकाओं और एक 1:10 कमजोर पड़ने का उपयोग करके, यह <100 μl के लिए आवश्यक रक्त की कुल मात्रा को कम करने के लिए संभव है. अंत में, प्रतिदीप्ति पतला नमूना 1-2 μl में प्रतिदीप्ति के निर्धारण की अनुमति देता है जो एक NanoDrop 3300 fluorospectrometer, का उपयोग कर मापा जाता है. इस विधि दिलचस्पी investigato दे देंगेआर ए सच जीएफआर मूल्य. इसके विपरीत, चूहों में क्रिएटिनिन माप "क्रिएटिनिन अंधा रेंज" और विशिष्ट और संवेदनशील दृढ़ संकल्प से संबंधित कठिनाइयों सहित कई कमजोरियों है. गुर्दे समारोह के 50% से 19 खो दिया है जब तक सीरम क्रिएटिनिन सामान्य श्रेणी में रहता है क्योंकि "क्रिएटिनिन अंधा श्रृंखला" जीएफआर के लिए एक मार्कर के रूप में अपने कार्य को सीमित करता है. जीन एक्स के एक पीटकर माउस संभालने के एक जंगली प्रकार माउस की तुलना में काफी कम जीएफआर (40%), एक होता है: कई जांचकर्ताओं गुर्दे शरीर विज्ञान और pathophysiology के अध्ययन के लिए अपने अनुसंधान में आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का उपयोग करने के बाद, यह निम्न समस्या भालू प्लाज्मा क्रिएटिनिन की तुलना द्वारा सरल स्क्रीनिंग इस अंतर का पता नहीं लगा होगा. जीएफआर दृढ़ संकल्प का एक अच्छा सही विधि के लिए की जरूरत GFR में मतभेद बनने के छोटे और अधिक महत्वपूर्ण हो जाता है.
चूहे व्यावसायिक रूप से हस्तक्षेप कि उनके प्लाज्मा और मूत्र में गैर क्रिएटिनिन chromagens की उच्च सांद्रताउपलब्ध क्रिएटिनिन assays है. एक परिणाम के रूप में, प्लाज्मा में क्षारीय picrate Jaffe प्रतिक्रिया अत्यधिक क्रिएटिनिन एकाग्रता पर आधारित हैं जो assays के उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) दृढ़ संकल्प 6, 13 के साथ तुलना. एक और सीमा है कि सीरम क्रिएटिनिन HPLC के दृढ़ संकल्प की तुलना में नीचे कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध assays की सीमा का पता लगाने है. हालांकि, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं जांचकर्ताओं का उपयोग करके चूहों 10, 22 में प्लाज्मा क्रिएटिनिन का निर्धारण करने में सक्षम थे.
इसी तरह की एक रेंज में जीएफआर एक तुलनीय एकल सांस में इंजेक्शन विधि के साथ ही मूत्र FITC-inulin निकासी 14 का उपयोग कर जागरूक चूहों में पाए गए. उनके प्रोटोकॉल के विपरीत, पूंछ कटाव का उपयोग कर हमारे प्रोटोकॉल विशेष सावधानियों पूंछ नस या saphenous नस पंचर की तुलना पोत अखंडता की रक्षा करने की आवश्यकता नहीं है. FITC-inulin के आधार पर मूत्र / प्लाज्मा निकासी के लिए यह शल्य चिकित्सा द्वारा दो आसमाटिक मील प्रत्यारोपण करने के लिए आवश्यक हैnipumps. दो पंपों पृष्ठभूमि से स्पष्ट रूप से अलग पहचाना जाता है जो उच्च पर्याप्त स्थिर राज्य प्लाज्मा FITC-inulin सांद्रता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. यह भी एक पूर्ण और समय पर मूत्र संग्रह के लिए चयापचय पिंजरों के उपयोग की आवश्यकता है. पिंजरों अन्यथा rinsing के बिना होता है, जो FITC-inulin के 25-37% की एक हानि के लिए खाते में rinsed करने की आवश्यकता है.
इस FITC-inulin विधि का उपयोग कर के नुकसान सीमित हैं. जांचकर्ता निम्नलिखित के बारे में पता होना चाहिए: (I) FITC के समाधान के इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल सिरिंज में कोई हवाई बुलबुले हैं विश्वास दिलाता हूं कि, (ख) पूरा पश्चनेत्रगोलकीय इंजेक्शन इंजेक्शन राशि की गणना जीएफआर निर्धारित करता है क्योंकि हासिल की है, और किया जाना चाहिए ( ग) चूहों, तो गुर्दे एकाग्रता की क्षमता का एक परिणाम के रूप में एक बहुत ही उच्च FITC-inulin एकाग्रता होगा जो मूत्र के साथ रक्त के नमूने संदूषित 75 मिनट जीएफआर प्रयोग के दौरान सबसे अधिक संभावना पेशाब से बचना होगा.
जनरल फायदे ओच इस FITC-inulin विधि निम्नलिखित शामिल हैं: (क) यह (ii) यह (तीन) परख, होश में चूहों में किया जा सकता है, एक ही माउस में माप कई बार दोहराने के लिए संभव है, एक गैर रेडियोधर्मी तकनीक है ( iv) कोई मूत्र संग्रह की आवश्यकता है, और (v) एक उच्च throughput विकल्प का उपयोग किया जा सकता है. एक सांस में इंजेक्शन के लिए नुकसान अब उपलब्ध है और एक विशेष छोटी डिवाइस 18 का उपयोग कर transcutaneously मापा जा सकता है जो एक बेहतर FITC के मार्कर, FITC-sinistrin, का उपयोग करके दूर किया जा सकता है जो FITC-inulin के डायलिसिस की जरूरत है, शामिल हैं. जीएफआर मापा जाता है, भले ही यह इस विधि के साथ तरल पदार्थ या आयनों का आंशिक उत्सर्जन को मापने के लिए संभव नहीं है.
साथ में ले ली, इस विधि जागरूक चूहों में जीएफआर को मापने के लिए एक उच्च throughput विधि की व्यवहार्यता प्रदान करता है. इस प्रकार, इस तकनीक चूहों में गुर्दे समारोह का निर्धारण करने में रुचि रखते हैं, जो अन्य जांचकर्ताओं के लिए ब्याज की हो सकती है.
The authors have nothing to disclose.
मैं इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. जेसिका डोमिंग्वेज़ Rieg धन्यवाद. इस काम अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (वैज्ञानिक विकास अनुदान 10SDG2610034), नेफ्रोलोजी के अमेरिकन सोसायटी की एक कार्ल डब्ल्यू Gottschalk अनुसंधान अनुदान, मधुमेह के राष्ट्रीय संस्थान और तीव्र गुर्दे की चोट अनुसंधान के लिए पाचन और गुर्दा रोग ओ 'ब्रायन (केंद्र द्वारा समर्थित किया गया P30DK079337), और दिग्गजों मामलों के विभाग.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
FITC-inulin | Sigma-Aldrich | F3272 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7706 | |
Isoflurane | Webster Veterinary | 78366551 | |
Dialysis membrane (MWCO 1000) | Spectrum Laboratories | 132636 | |
Membrane closure | Spectrum Laboratories | 132736 | |
80 μl Hematocrit capillaries | Drummond Scientific | 22362566 | |
Hematocrit centrifuge | IEC | Micro-MB | |
10 μl Na+-Heparin minicaps | Hirschmann | 9000210 | |
Syringe (100 μl) | Hamilton | 80601 | |
Fluorospectrometer | Thermo-Fisher Scientific | NanoDrop 3300 | |
Filter (0.22 μm) | Spectrum Laboratories | 880-26464-UE | |
Sealant | Châ-seal | 510 | |
Needles (G26 ½ and G30 ½) | Becton Dickinson | 305111 & 305106 |