Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En hög genomströmning metod för mätning av glomerulär filtration Rate i medveten möss

doi: 10.3791/50330 Published: May 10, 2013

Summary

Mätning av glomerulär filtrationshastighet (GFR) är den gyllene standarden för njurfunktionen bedömning. Här beskriver vi en hög genomströmning metod som medger bestämning av GFR hos vakna möss genom användning av en enda bolusinjektion, bestämning av fluoresceinisotiocyanat (FITC)-inulin i plasma och beräkning av GFR med två fas exponentiell avklingning modell.

Abstract

Mätningen av glomerulär filtrationshastighet (GFR) är den högsta standarden inom njurfunktion bedömning. För närvarande utredare bestämma GFR genom att mäta nivån av den endogena biomarkör kreatinin eller exogent applicerad radioaktiv märkt inulin (3 H eller 14 C). Kreatinin har den betydande nackdelen att proximala tubulära sekretion står för ~ 50% av totala renala kreatinin i urinen och därför kreatinin är inte en pålitlig GFR markör. Beroende på det utförda experimentet, kan inulin clearance bestämmas genom en intravenös bolusinjektion eller kontinuerlig infusion (intravenös eller osmotisk minipump). Båda tillvägagångssätten kräver insamling av plasma eller plasma och urin, respektive. Andra nackdelar med radioaktivt märkt inulin inkluderar användning av isotoper, tidskrävande kirurgisk beredning av djuren, och kravet på en terminal experiment. Här beskriver vi en metod som använder en enda bolusinjektion påfluoresceinisotiocyanat-(FITC) märkt inulin och mätning av dess fluorescens i 1-2 il utspädd plasma. Genom att tillämpa en tvåkompartmentmodell, med 8 blodsamlingar per mus, är det möjligt att mäta GFR i upp till 24 möss per dag med en särskild arbets-flöde protokollet. Denna metod kräver endast korta isoflurananestesi med alla blodprover samlas in i ett icke-återhållsam och vaken mus. En annan fördel är att det är möjligt att följa möss under en period av flera månader och behandlingar (dvs. göra parade experiment med kostförändringar eller program läkemedel). Vi hoppas att denna teknik för mätning GFR är användbar för andra forskare studerar funktion mus njure och kommer att ersätta mindre noggranna metoder för att skatta njurfunktionen, såsom plasma kreatinin och urea.

Introduction

Hastigheten för bildning av plasma ultrafiltrat glomerulus har blivit grunden för utvärdering njurfunktion (glomerulär filtrationshastighet, GFR). Den idealiska markör för att bestämma GFR bör filtreras fritt, varken utsöndras eller resorberas och inte metaboliseras. Ett sådant beteende befanns vara sant för inulin, och inulin clearance har blivit en gyllene standarden för bestämning av GFR 3. Medan clearance av kreatinin i stor utsträckning används som ett mått på GFR hos människor och djur, uppfyller kreatinin inte kraven för en ideal GFR markör. Omkring 10 - 40% av kreatininclearance hos människa är en följd av aktiv tubulär sekretion 1, 11, och renal utsöndring av kreatinin är också framträdande i möss och råttor 4, 7, 9, 22. Nedsatt njurfunktion är känt för att öka den tubulära utsöndringen av kreatinin vilket begränsar dess värde som en markör av GFR 1, 2. Vi har tidigare visat att ekologiska isoform anjontransportör3 (OAT3) bidrar till murina nedsatt kreatinin sekretion 22. Emellertid kräver inulin clearance typiskt användningen av radioaktivt märkt inulin (3 H eller 14 C). Den radioaktiva bestämning av inulin kan användas i både sövda och medvetna möss, men hyser nackdelarna med många säkerhetsföreskrifter och strikta frågor hantering inneboende med användning av radioaktiva isotoper. Längs dessa linjer, kirurgiska clearance preparat för bestämning av GFR är tidskrävande samt terminal i naturen. I 1999 Lorenz et al. 12 introducerade FITC-inulin som en markör för enstaka nefron GFR i bedövade möss. Fem år senare Qi et al. 15 bestäms hel njure GFR hos vakna möss genom att använda FITC-inulin. Alternativa protokoll använder nu FITC-inulin som en exogen markör för att mäta GFR i medvetna och sövda möss. Dessa protokoll behåller känsligheten av radioaktivt inulin genom fluorescens detectipå och kringgå nackdelarna med att arbeta med en märkt radioaktiv markör. Den FITC-inulin analysen modifierad av andra 7, 8 och oss 22, 23 för att dra nytta av den microvolume förmåga NanoDrop 3300 fluorospectrometer. Detta gör det möjligt att minska den totala provvolymen som behövs för att <100 | il blod per GFR mätning.

Med förfarandet och hög kapacitet protokollet tillhandahållet i denna publikation visar vi möjligheten att mäta GFR i upp till 24 medvetna möss per dag. Denna teknik kan vara till nytta för andra forskare studerar murina GFR och vi hoppas att det kommer att ersätta mindre exakta metoder som index för njurfunktion såsom kreatinin och urea.

Protocol

Ett. Lösningar

  1. 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl / 1 l DDH 2 O (8,5 g / L).
  2. 0,5 mol / L HEPES pH 7,4 (Lös 59,6 g HEPES i 0,5 L av DDH 2 0 och justera pH till 7,4 med 10 N NaOH).

2. Framställning av FITC-inulin injektionslösning

  1. Väg FITC-inulin för framställning av en 5% lösning och lös i 0,85% NaCl (vanligen 100 mg / 2 ml 0,85% NaCl) genom upphettning till 90 ° C till fullständig upplösning.
  2. Väg löst FITC-inulin lösning och notera vikten.
  3. Skär en 20 cm bit dialysmembran (molekylvikt cut-off: 1,000) och sätta i DDH 2 O i 30 min för att avlägsna rester NaN 3 från membranet och spola några gånger efteråt.
  4. Fyll upplöst FITC-inulin i dialysmembran och täta ordentligt med nedläggningar.
  5. Väg hela dialysmembran.
  6. Sätt dialysmembranet i en L 0,85% NaCl-lösning och rör om långsamt ljus-skyddad under 24 h vid roOM temperatur.
  7. Väg hela dialysmembranet igen och beräkna den nya koncentrationen (vatten osmotiskt flytta in i membranet och obundet FITC, eller bunden FITC-inulin <1,000 molekylvikt kommer att flytta ut ur membranet, alltså, kommer koncentrationen av FITC-inulin minska avsevärt) .
  8. Den nya FITC-inulin koncentration (c) beräknas med hjälp av följande formel: c = n / V, där n = initial FITC-inulin belopp, V = ny volym (skillnad i vikt dialysslang före och efter dialys plus volym initial FITC-Inulin lösning).
  9. Före användning sterilisera dialyserad FITC-inulin lösning genom filtrering genom ett 0,22 fim sprutfilter.
  10. Keep FITC-inulin skyddades från ljus (aluminiumfolie) vid 4 ° C. Dialyserades och steriliseras FITC-inulin kan användas i upp till 2 veckor. Deltagit FITC-inulin kan upplösas genom att åter-upphettning vid 90 ° C under några minuter.

Obs: om du använderFITC-sinistrin 16-18, vilket inte kräver dialys, kan alla steg som krävs för dialys hoppas över.

Tre. Injektion och Blood Collection

  1. Ta kroppsvikt (BW) av mössen före experimentet.
  2. Söva möss kort med isofluran.
  3. För hög genomströmning av 6 möss följ protokoll ges i figur 3.
  4. Injicera 2 pl / g kroppsvikt av dialyserat FITC-inulin i retroorbital plexus 24 genom att använda en G30 ½ i nålen (ta bort luftbubblor från 100 xl Hamilton sprutan genom att först använda en G26 ½ i nålen och sedan byta till en G30 ½ nål för injektion).
  5. Klipp 1 mm av mus svans med sax gång och samla blod vid 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 och 75 minuter efter injektion i Na-Heparin minicapillaries. Seal minicapillaries Efter blodtappning med cha-tätning.
  6. Håll prover skyddas från ljus.
  7. Put förseglade minicapillaries inuti hematokrit kapillärer och centrifugera under 5 min.
  8. Break minicapillaries med hjälp av en diamant cutter och överföring hela plasma genom pipettering i en 0,2 ml tub.
  9. Gör en 1:10 spädning med användning av 2 | il plasma och 18 | il 0,5 mol / l HEPES (pH 7,4) i nya 0,2 ml rör (prov kunde lagras över natten vid 4 ° C under fluorescensmätningar).
  10. Mät 2 pl utspätt prov med NanoDrop 3300 i dubbletter. Beskrivningen och användning av instrumentet beskrivs här 5.

4. Beredning av standarder

  1. Samla blod från möss av samma bakgrund stam i heparin belagd hematokrit kapillärer, spinn ner och späd 1:10 med 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), vanligen 80 ^ plasma + 720 pl HEPES.
  2. Späd FITC-inulin injektionslösning med utspädd musplasma att få följande standardfunktioner utspädningar:
    01:10: 10 pl outspädd FITC-inulin-lösning + 90 pl utspädd musplasma
    1:100: 10 & mu, L (1:10) + 90 pl utspädd musplasma
    1:1000: 10 pl (1:100) lösning + 90 pl utspädd musplasma
    1:2000: 30 pl (01:01) lösning + 30 pl utspädd musplasma
    1:10.000: 10 pl (01:05) lösning + 40 pl utspädd musplasma
    1:20.000: 20 ^ (1:01) lösning + 20 pl utspädd musplasma
    1:100,000: 10 pl (01:05) lösning + 40 pl utspädd musplasma
    Koncentrationen av standarderna kommer att bero på dialys och kommer alltid att vara olika för varje beredning av FITC-inulin. Det är nödvändigt att ange koncentrationen för standardkurva nytt varje gång.
  3. Analysera data för att beräkna GFR med lämplig programvara (t.ex. GraphPad Prism) med hjälp av en två-fas exponentiellt avtagande funktion som beskrivs här 15, 20 och visas i representativa avsnittet Resultat.

Representative Results

GFR beräknas enligt följande formel:

GFR = n / (A/K1 + B/K2), där

n = injicerade mängden (n = c • V, där c = FITC-inulin koncentration, V = injicerad volym)
A = Span1, y-skärningspunkten för eliminering
K1 = sönderfallskonstant för eliminering
B = Span2, y-skärningspunkten för distributionen
K2 = sönderfallskonstant för distribution

Anmärkning: A, K1, B och K2 är förkortningar som ges av GraphPad Prism, varje programvara som kan analysera två-fas exponentiell avklingning kan användas, dock kan andra vetenskapliga program använder olika förkortningar.

Genom att använda ett två-fas exponentiell anpassning avklingningskurvan, som är baserat på plasma-FITC-inulin koncentrationer bör en kurva kan jämföras med den som visas i figur 1 erhållas. Beräkning GFR genom ovan formel (och som beskrivs i här <sup> 20) gör det möjligt att upptäcka nedsatt njurfunktion 15 eller glomerulär hyperfiltrering 8, 23 som funnit i möss med typ 1 diabetes mellitus (Figur 2).

Figur 1
Figur 1. För att mäta GFR i medvetna möss, är kinetiken FITC-inulin efter en enstaka dos intravenös injektion används. För beräkning av GFR, är en två-kompartment-modell användes. I tvåkompartmentmodell, representerar den initiala snabba sönderfallet fas omfördelning av FITC-inulin från det intravaskulära rummet till den extracellulära vätskan. Den senare fasen, med långsammare förfall i FITC-inulin koncentration, speglar huvudsakligen systemiskt clearance från plasma.

Figur 2
Figur 2. Detection av diabetisk hyperfiltrering i vildtyp möss. typ I-diabetes mellitus inducerades genom intraperitoneal tillämpning av streptozotocin (STZ, 50 mg / kg för 5 på varandra följande dagar). GFR bestämdes före (basal) och 5 veckor efter induktion av diabetes. På grund tubuloglomerular återkoppling, orsakar en primär ökning proximal reabsorption tidigt diabetiker hyperfiltrering 21 ett konstaterande som är reproducerbara i vildtyp möss (n = 10, p <0,01 vs basal samma mus).

Figur 3
Figur 3. Flödesschema för mätning av GFR i en uppsättning av 6 möss. För att mäta hela njuren GFR genom bolusinjektion metod, måste 8 blodprov samlas in på 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 och 75 min efter FITC-inulin injektion. Siffror indikerar tidpunkter. Siffror inom parentes anger antalet stickprov. Tidpunkter vänster om den vertikala röda linjen indikerar injektiontidpunkter (vid 0, 11, 22, 33, 44 och 55 min). Varje mus är märkt med en annan färg. För att få sekventiella blodsamlingar följa pilarna. Grå rutor indikerar när nästa musen måste vara beredd på isoflurananestesi före injektion. Med hjälp av detta protokoll den minsta tiden mellan två blodsamlingar från olika möss är 1 min.

Discussion

Den aktuella studien beskriver en teknik för bestämning av GFR hos vakna möss genom en enda-bolusinjektion och analys av fluorescens i 8 blodprov genom två-fas exponentiell avklingning. En GFR mätning i en mus tar 75 min. Genom att använda en speciell flödesschema, är det möjligt att mäta GFR av sex möss i 130 min. Det är möjligt att upprepa detta flödesschema protokoll upp till 4 gånger per dag och mäta GFR i 24 möss. Vi ändrade denna metod så att det är möjligt att samla in blod från en liten svans klipp istället svansvenen punktering, som är snabbare och enklare för forskare att utföra jämfört med svans venpunktion. Genom att använda 10 ^ il hematokrit kapillärer och en 1:10 spädning, är det möjligt att minska den totala mängden blod som behövs till <100 | il. Slutligen fluorescens mäts med en NanoDrop 3300 fluorospectrometer, vilket möjliggör bestämning av fluorescens i 1-2 il utspätt prov. Denna metod kommer att ge berörda investigatora sann GFR värde. Däremot kreatinin mätningar i möss har flera svagheter inklusive "kreatinin blinda sortiment" och svårigheter i samband med specifika och känsliga beslutsamhet. Den "kreatinin blinda område" begränsar dess funktion som en markör för GFR eftersom serumkreatinin kvar i det normala intervallet fram till 50% av njurfunktionen förlorat 19. Sedan flera forskare använder genetiskt modifierade möss i sin forskning att studera renal fysiologi och patofysiologi, bär det följande problem: antar en knockout-mus av genen X skulle ha en betydligt lägre GFR (med 40%) jämfört med en vild-typ mus, ett enkel screening genom att jämföra plasma kreatinin skulle inte detektera denna skillnad. Behovet av en bra exakt metod för bestämning GFR blir mer kritisk ju mindre skillnaderna i GFR blivit.

Möss har höga halter av icke-kreatinin chromagens i sin plasma och urin som stör handelntillgängliga kreatinin analyser. Som en följd av analyser som är baserade på den alkaliska pikrat Jaffé reaktion överskattning kreatinin koncentration i plasma jämfört med högupplösande vätskekromatografi (HPLC) bestämning 6, 13. En annan begränsning är att serumkreatinin ligger under detektionsgränser flera kommersiellt tillgängliga analyser jämfört med HPLC-bestämning. Men genom att använda enzymatiska reaktioner utredare kunde bestämma plasmakreatinin hos möss 10, 22.

GFR i ett liknande område hittades i medvetna möss med användning av en jämförbar enda bolusinjektion metoden samt urin FITC-inulin clearance 14. I kontrast till deras protokoll, kräver våra protokoll med svans klipp inte särskilda försiktighetsåtgärder för att bevara fartyget integriteten jämfört med svansven eller safenusvenen punktering. För urin / plasma baserad FITC-inulin clearance är det nödvändigt att kirurgiskt implantera två osmotiska minipumps. Två pumpar är nödvändiga för att uppnå tillräckligt höga steady-state plasmakoncentrationen FITC-inulin koncentrationer som är tydligt från bakgrunden. Detta kräver också användning av metaboliska burar för en komplett och tidsbestämda urin samling. Burarna måste sköljas att redovisa en förlust på 25-37% av FITC-inulin, vilket annars sker utan sköljning.

De fallgropar med att använda denna FITC-inulin metod är begränsade. Utredarna bör vara medveten om följande: (i) säkerställa att det inte finns några luftbubblor i sprutan som används för injektion av FITC-lösningen, måste (ii) fullständig retrobulbär injektion uppnås eftersom mängden injicerat bestämmer beräknat GFR, och ( iii) möss kommer sannolikt urinera under 75 min GFR experiment, så undvika att kontaminera blodprov med urinen, vilket kommer att ha en mycket hög FITC-inulin koncentration som en följd av njurarna koncentrationsförmåga.

Allmänna fördelar of detta FITC-inulin metod innefattar följande: (i) Den är en icke-radioaktiv teknik, (ii) det är möjligt att upprepa mätningar flera gånger i samma mus, (iii) analys kan utföras i medvetna möss, ( iv) ingen urinsamlingen krävs, och (v) en hög genomströmning alternativ kan utnyttjas. Nackdelar för bolusinjektion är behovet av dialys av FITC-inulin, som kan övervinnas med hjälp av en bättre FITC-markör, FITC-sinistrin, som är tillgänglig nu och kan mätas transkutant med en speciell miniatyriserad enhet 18. Även om GFR mäts, är det inte möjligt att mäta bråkdelar utsöndringar av vätska eller joner med denna metod.

Sammantaget ger denna metod det är möjligt att en hög genomströmning förfarande för mätning av GFR i medvetna möss. Således kan denna teknik vara av intresse för andra forskare som är intresserade av att bestämma njurfunktionen hos möss.

Disclosures

Författaren fick bidrag för att täcka kostnaderna för denna publikation från Thermo Fisher Scientific.

Acknowledgments

Jag tackar Dr Jessica Dominguez Rieg för kritisk läsning av detta manuskript. Detta arbete stöddes av American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), en Carl W. Gottschalk forskningsstipendium för American Society of Njurmedicin, National Institute of Diabetes and Digestive och njursjukdomar O'Brien Center for Acute Kidney Injury Research ( P30DK079337), och Department of Veterans Affairs.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma-Aldrich S7653
FITC-inulin Sigma-Aldrich F3272
HEPES Sigma-Aldrich H7706
Isoflurane Webster Veterinary 78366551
Dialysis membrane (MWCO 1000) Spectrum Laboratories 132636
Membrane closure Spectrum Laboratories 132736
80 μl Hematocrit capillaries Drummond Scientific 22362566
Hematocrit centrifuge IEC Micro-MB
10 μl Na+-Heparin minicaps Hirschmann 9000210
Syringe (100 μl) Hamilton 80601
Fluorospectrometer Thermo-Fisher Scientific NanoDrop 3300
Filter (0.22 μm) Spectrum Laboratories 880-26464-UE
Sealant Châ-seal 510
Needles (G26 ½ and G30 ½) Becton Dickinson 305111 & 305106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bauer, J. H., Brooks, C. S., Burch, R. N. Clinical appraisal of creatinine clearance as a measurement of glomerular filtration rate. Am. J. Kidney Dis. 2, (3), 337-346 (1982).
  2. Carrie, B. J., Golbetz, H. V., Michaels, A. S., Myers, B. D. Creatinine: an inadequate filtration marker in glomerular diseases. Am. J. Med. 69, (2), 177-182 (1980).
  3. Chasis, H., Ranges, H. A., Goldring, W., Smith, H. W. The Control of Renal Blood Flow and Glomerular Filtration in Normal Man. J. Clin. Invest. 17, (5), 683-697 (1938).
  4. Darling, I. M., Morris, M. E. Evaluation of "true" creatinine clearance in rats reveals extensive renal secretion. Pharm. Res. 8, (10), 1318-1322 (1991).
  5. NanoDrop 3300 Fluorospectrometer - www.nanodrop.com [Internet]. Thermo Scientific. Available from: http://www.nanodrop.com/Productnd3300overview.aspx (2013).
  6. Dunn, S. R., Qi, Z., Bottinger, E. P., Breyer, M. D., Sharma, K. Utility of endogenous creatinine clearance as a measure of renal function in mice. Kidney Int. 65, (5), 1959-1967 (2004).
  7. Eisner, C., Faulhaber-Walter, R., et al. Major contribution of tubular secretion to creatinine clearance in mice. Kidney Int. 77, (6), 519-526 (2010).
  8. Faulhaber-Walter, R., Chen, L., et al. Lack of A1 adenosine receptors augments diabetic hyperfiltration and glomerular injury. J. Am. Soc. Nephrol. 19, (4), 722-730 (2008).
  9. FINGL, E. Tubular excretion of creatinine in the rat. Am. J. Physiol. 169, (2), 357-362 (1952).
  10. Keppler, A., Gretz, N., et al. Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay. Kidney Int. 71, (1), 74-78 (2007).
  11. Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. E. Serum creatinine and renal function. Annu. Rev. Med. 39, 465-490 (1988).
  12. Lorenz, J. N., Gruenstein, E. A simple, nonradioactive method for evaluating single-nephron filtration rate using FITC-inulin. Am. J. Physiol. 276, 172-177 (1999).
  13. Meyer, M. H., Meyer, R. A., Gray, R. W., Irwin, R. L. Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 144, (1), 285-290 (1985).
  14. Qi, Z., Breyer, M. D. Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice. Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).
  15. Qi, Z., Whitt, I., et al. Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286, (3), F590-F596 (2004).
  16. Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats. Nephrol. Dial Transplant. 24, (10), 2997-3001 (2009).
  17. Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves. Kidney Int. 79, (11), 1254-1258 (2011).
  18. Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303, (5), F783-F788 (2012).
  19. Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients. Kidney Int. 28, (5), 830-838 (1985).
  20. Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses. J. Appl. Physiol. 84, (6), 2154-2162 (1998).
  21. Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view. J. Am. Soc. Nephrol. 14, (2), 530-537 (2003).
  22. Vallon, V., Eraly, S. A., et al. A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302, (10), F1293-F1299 (2012).
  23. Vallon, V., Schroth, J., et al. Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus. Nephron. Physiol. 111, (1), 30-38 (2009).
  24. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Anim. (NY. 40, (5), 155-160 (2011).
En hög genomströmning metod för mätning av glomerulär filtration Rate i medveten möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rieg, T. A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice. J. Vis. Exp. (75), e50330, doi:10.3791/50330 (2013).More

Rieg, T. A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice. J. Vis. Exp. (75), e50330, doi:10.3791/50330 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter